李曉波，付 瑞，王淑菁，衛(wèi) 禮，賀爭(zhēng)鳴，王 吉，岳秉飛

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

小鼠多瘤病毒熒光PCR檢測(cè)方法的建立及其在 裸鼴鼠感染情況調(diào)查中的應(yīng)用

李曉波，付 瑞，王淑菁，衛(wèi) 禮，賀爭(zhēng)鳴，王 吉*，岳秉飛*

(中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所，北京 100050)

研究報(bào)告

目的建立多瘤病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)裸鼴鼠中多瘤病毒感染情況進(jìn)行調(diào)查。方法比較NCBI中小鼠多瘤病毒(Genbank：NC_001515)的核酸序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，建立多瘤病毒的熒光定量PCR方法，對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行驗(yàn)證。人工感染9只1日齡KM乳鼠，21 d后采集心、肝、脾、肺、腎、腦、胸腺、盲腸內(nèi)容物和血液等組織臟器，用建立的熒光PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證方法在應(yīng)用中的有效性，最后用該方法檢測(cè)62份裸鼴鼠的盲腸內(nèi)容物樣本。結(jié)果建立的檢測(cè)方法特異性好，在以多瘤病毒為模板時(shí)出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，以猴空泡病毒、小鼠K病毒、小鼠微小病毒和大鼠細(xì)小病毒H-1株為模板時(shí)無(wú)熒光信號(hào)出現(xiàn)；方法的最低檢出限為100 copies/μL；人工感染小鼠的心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物中均檢測(cè)到多瘤病毒核酸，其中肺組織中含量最高，腦、胸腺和血液中未檢出；62份裸鼴鼠的盲腸內(nèi)容物樣本經(jīng)檢測(cè)多瘤病毒為陰性。結(jié)論建立的多瘤病毒熒光定量PCR方法可有效檢測(cè)動(dòng)物組織中的多瘤病毒，對(duì)裸鼴鼠自然感染多瘤病毒的調(diào)查為實(shí)驗(yàn)用裸鼴鼠微生物標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考。

多瘤病毒；裸鼴鼠；小鼠；熒光定量PCR方法

多瘤病毒(polyomavirus, poly)在分類上屬乳多空病毒科，多瘤病毒屬，可引起實(shí)驗(yàn)小鼠和野生小鼠的地方性流行，在自然條件下多呈隱性或亞臨床感染[1-3]。為中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測(cè)》(GB14922. 2-2011)中SPF 級(jí)小鼠必要時(shí)需排除的病原。

多瘤病毒不僅感染小鼠，還會(huì)感染大鼠、地鼠等嚙齒類動(dòng)物，在其他哺乳動(dòng)物如人類、非人靈長(zhǎng)類、食肉類、偶蹄類動(dòng)物和鳥類甚至海洋魚類中也發(fā)現(xiàn)了多瘤病毒的存在[4-8]。裸鼴鼠(Heterocephalusglaber)是一種分布于非洲索馬里、肯尼亞、埃塞俄比亞等地的野生動(dòng)物，動(dòng)物學(xué)分類上屬于哺乳綱、嚙齒目、濱鼠科、裸鼴鼠屬、裸鼴鼠種[9]，野生環(huán)境下終生在地下2 m左右的黑暗洞穴中生活。作為一種新型的實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物，具有壽命長(zhǎng)、抗腫瘤、耐缺氧、新陳代謝率低、痛覺缺失、觸覺靈敏、視覺功能低下、骨骼再生能力強(qiáng)等諸多特點(diǎn)，可用于抗腫瘤、抗衰老、低氧適應(yīng)及疼痛等多個(gè)領(lǐng)域的研究，在生物醫(yī)學(xué)研究中具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。Jarvis[11]在1967年首次將裸鼴鼠封閉飼養(yǎng)用于科學(xué)研究，中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)于2011年從非洲引入裸鼴鼠，并在人工環(huán)境下飼養(yǎng)繁殖成功[12]。裸鼴鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化迫切需要制定其相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，目前裸鼴鼠中病毒和細(xì)菌等微生物的自然感染情況還沒有報(bào)道，也沒有裸鼴鼠的相關(guān)微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究通過(guò)建立小鼠多瘤病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)裸鼴鼠自然感染小鼠多瘤病毒的情況進(jìn)行了初步調(diào)查，為裸鼴鼠微生物標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)KM乳鼠，10只，1日齡，購(gòu)自本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室[SCXK(京)2014-0013][SYXK(京)2011-0008]。成年裸鼴鼠，14月齡，62只，體重20～40 g，雌雄各半，來(lái)自于中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，普通環(huán)境飼養(yǎng)，采集其盲腸內(nèi)容物樣本，經(jīng)處理后置-70℃?zhèn)溆?。按?shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 病毒株和細(xì)胞

小鼠多瘤病毒(poly)、猴空泡病毒(SV40)、小鼠微小病毒(MVM)和大鼠細(xì)小病毒H-1株(H-1)均為本實(shí)驗(yàn)室保存，小鼠K病毒(MKV)購(gòu)于ATCC(編號(hào)：45028)，3T3細(xì)胞為本室保存。

1.3 主要試劑

TaqMan Gene Expression Master Mix為ABI產(chǎn)品；病毒核酸提取試劑盒購(gòu)自Takara公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 引物探針的設(shè)計(jì)

選擇小鼠多瘤病毒基因組序列(Genbank：NC_001515)中保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，上游引物P1∶5′-TCCTTCCAGTCTGTGTTGTGTTTC-3′；下游引物P2∶5′-CTTCATTCCGTGGGAAGATATGTGT-3′；探針：5′-(FAM) CTGCACAACCATTTGC (NFQ)-3′，預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長(zhǎng)度為66 bp，引物探針由華粵瑞科公司合成。

1.4.2 病毒的培養(yǎng)

小鼠多瘤病毒接種3T3細(xì)胞后，2～3 d后待出現(xiàn)細(xì)胞病變，反復(fù)凍融3次，置-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 核酸的提取

取0.2 mL病毒培養(yǎng)液按試劑盒說(shuō)明提取DNA，最后用50 μL滅菌水洗脫。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

在上述引物擴(kuò)增片段的上下游各設(shè)計(jì)引物：上游引物P3∶5′-TAGCTAGGCCATCCAGGAAT-3′；下游引物P4∶5′-GGGATCCAGCCCTTCTCGAT-3′，擴(kuò)增后的產(chǎn)物連接pClone007 Blunt Vector載體，轉(zhuǎn)化宿主菌制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒濃度(ng/μL)，根據(jù)公式濃度(copies/μL)=[6.02 × 1023× 質(zhì)粒濃度(ng/μL)× 10-9]/[質(zhì)粒大小(bp)× 660]換算為拷貝數(shù)濃度。

1.4.5 熒光定量PCR體系的優(yōu)化

以同一批次提取的多瘤病毒核酸為模板，分別采用不同的引物濃度(0.1～1.1 μmol/L)，探針濃度(0.1～1.1 μmol/L)及退火溫度(50～65℃)等反應(yīng)條件，根據(jù)其Ct值來(lái)判定最佳反應(yīng)條件，每個(gè)條件做3個(gè)重復(fù)。

1.4.6 方法的敏感性驗(yàn)證及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋成1.0×100～1.0×109copies/μL，用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行測(cè)定，驗(yàn)證其敏感性，并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.7 方法的特異性驗(yàn)證

用建立的熒光定量PCR法同時(shí)檢測(cè)多瘤病毒，K病毒，猴空泡病毒(SV40)及大鼠細(xì)小病毒H-1株(H-1)，小鼠微小病毒(MVM)等同屬或DNA病毒，驗(yàn)證方法的特異性。

1.4.8 人工感染小鼠樣本的檢測(cè)

腦內(nèi)接種1日齡的KM乳鼠poly病毒，接種9只，1只接種生理鹽水作為陰性對(duì)照，7日齡時(shí)再次滴鼻感染5 μL，21日齡時(shí)脫頸處死，取心、肝、脾、肺、腎、腦和盲腸內(nèi)容物，按10%(w/v)的比例加入DMEM培養(yǎng)基，研磨至勻漿，12 000 r/min離心5 min，取上清，進(jìn)行poly核酸的檢測(cè)。

1.4.9 裸鼴鼠的檢測(cè)

62只裸鼴鼠，處死后取盲腸內(nèi)容物，加入10%的DMEM培養(yǎng)基，漩渦振蕩器震蕩混勻，12 000 r/min離心5 min，取上清提取核酸檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)插入片段進(jìn)行測(cè)序，與NCBI發(fā)表的多瘤病毒序列(Genbank：NC_001515)同源性為100%。紫外分光法測(cè)得濃度為119.2 ng/μL，換算為拷貝濃度為5.126×1010copies/μL。

2.2 熒光定量PCR體系的優(yōu)化

優(yōu)化后的引物和探針濃度均為0.4 μmol/L，退火溫度為60℃，反應(yīng)條件為:50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。

2.3 方法的敏感性驗(yàn)證

提取的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為119.2 ng/μL，換算成拷貝數(shù)濃度為5.126×1010copies/μL，將其稀釋成100～109copies/μL，對(duì)系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR方法，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，在101稀釋度有一個(gè)重復(fù)未起峰，其余兩個(gè)重復(fù)起峰晚，102～109稀釋度線性關(guān)系較好，R2值為0.995，因此本方法判定最低的檢測(cè)靈敏度為102copies/μL，Ct值≤32.416時(shí)為陽(yáng)性，反之為陰性(圖1，圖2)。

圖1 poly熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the poly fluorescence real-time PCR assay

圖2 poly熒光定量PCR方法的敏感性驗(yàn)證Fig.2 Sensitivity of the poly fluorescence real-time PCR assay

2.4 方法的特異性驗(yàn)證

圖3 poly熒光定量PCR方法的特異性Fig.3 Specificity of the poly fluorescence real-time PCR assay

檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)檢測(cè)poly病毒時(shí)，出現(xiàn)FAM熒光擴(kuò)增曲線(Ct值為13.984，對(duì)應(yīng)濃度為2.67×107copies/μL)。檢測(cè)猴空泡病毒、K病毒、小鼠微小病毒和大鼠細(xì)小病毒H-1株均無(wú)明顯擴(kuò)增曲線。表明所建立的熒光定量PCR法特異性強(qiáng)，與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。(圖3)

2.5 感染樣品的檢測(cè)

9只人工感染poly的小鼠均無(wú)明顯臨床癥狀，在心、肝、脾、肺、腎、盲腸內(nèi)容物中均檢測(cè)到poly核酸，各組織核酸含量肺>心，肝，脾，腸>腎；胸腺，腦和血中poly核酸為陰性(圖4)。

2.6 裸鼴鼠的檢測(cè)

注：1-9依次為肺、陽(yáng)性對(duì)照、肝、腸、心、腎、胸腺、腦和血。圖4 人工感染小鼠poly各組織檢測(cè)結(jié)果Note.1-9 represent lung, positive control, liver, cecum, heart, kidney, thymus, brain and blood, respectively.Fig.4 Results of detection of polyomavirus distribution in various tissues after artificial infection

對(duì)62份裸鼴鼠盲腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行檢測(cè)，poly病毒均為陰性(圖5)。

圖5 62只裸鼴鼠poly檢測(cè)結(jié)果(P/C：陽(yáng)性對(duì)照)Fig.5 Results of detection of polyomavirus in 62 naked mole rats (P/C: positive control).

3 討論

裸鼴鼠作為一種新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在抗腫瘤、抗衰老、耐低氧等研究領(lǐng)域中有著廣闊的應(yīng)用前景，我國(guó)對(duì)裸鼴鼠的研究和應(yīng)用目前處于起步階段，中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)于2011年引進(jìn)并成功進(jìn)行了裸鼴鼠人工繁殖[13]，為了使其滿足實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化的要求，迫切需要制定裸鼴鼠的微生物，寄生蟲和遺傳等的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為此我們對(duì)其攜帶的微生物進(jìn)行了初步調(diào)查，本研究主要對(duì)裸鼴鼠中小鼠多瘤病毒的感染情況進(jìn)行了調(diào)查。

我們通過(guò)與NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)比較，查找其保守序列，最后選取小鼠多瘤病毒核衣殼蛋白基因(Genbank：NC_001515)序列設(shè)計(jì)引物探針，建立了小鼠多瘤病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法。用濃度已經(jīng)標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒對(duì)其檢測(cè)敏感度進(jìn)行驗(yàn)證，在102～109copies/μL范圍呈線性關(guān)系，將102copies/μL作為本方法的檢測(cè)敏感度，對(duì)應(yīng)的Ct值為32.416；我們用同為多瘤病毒屬的猴空泡病毒和小鼠K病毒以及大小鼠的兩種DNA病毒作為對(duì)照病毒驗(yàn)證本方法的特異性，結(jié)果只有多瘤病毒出現(xiàn)熒光信號(hào)，其他對(duì)照病毒均無(wú)熒光信號(hào)出現(xiàn)，表明方法的特異性良好。為了驗(yàn)證方法在實(shí)際樣本的檢測(cè)中是否適用，我們用多瘤病毒細(xì)胞毒感染9只KM乳鼠，為了提高感染成功率，我們分兩次分別經(jīng)腦和鼻飼兩個(gè)途徑進(jìn)行感染，檢測(cè)結(jié)果顯示在心、肝、脾、肺、腎和盲腸內(nèi)容物中檢測(cè)到多瘤病毒核酸，腦、胸腺和血液中未檢測(cè)到，并且各組織病毒含量不同，肺組織中含量最高，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]。感染的9只小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀也未產(chǎn)生腫瘤，可能是受到了母源抗體的保護(hù)。

多瘤病毒的宿主并不局限于小鼠，在大鼠、地鼠以及其他哺乳類動(dòng)物，鳥類和魚類中都有發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠中也可能存在這種病毒，但我們用建立的熒光定量PCR方法并未從裸鼴鼠中檢測(cè)到多瘤病毒，采用ELISA方法也未從裸鼴鼠血清中檢測(cè)到多瘤病毒抗體(文中未顯示)，可能的原因有以下幾點(diǎn)：選擇的靶器官中病毒含量太低，我們進(jìn)行的感染試驗(yàn)表明多瘤病毒在小鼠肺組織中的含量最高，本次試驗(yàn)參考先前的文獻(xiàn)報(bào)道我們選擇裸鼴鼠的盲腸內(nèi)容物作為檢測(cè)的靶器官[15]，后續(xù)的試驗(yàn)還需對(duì)其他的靶器官進(jìn)行檢測(cè)；另一個(gè)原因可能是感染裸鼴鼠的多瘤病毒與小鼠多瘤病毒核酸序列存在差異，由于沒有裸鼴鼠多瘤病毒的參考資料，考慮到裸鼴鼠與小鼠同屬嚙齒目，我們選擇小鼠多瘤病毒的基因序列為參考建立了檢測(cè)方法，有研究表明不同種屬動(dòng)物中的多瘤病毒核酸序列不是完全相同的，這樣雖然我們建立的方法檢測(cè)小鼠中的多瘤病毒是有效的，但用來(lái)檢測(cè)裸鼴鼠中的多瘤病毒就有可能檢測(cè)不到；本研究檢測(cè)的裸鼴鼠不是野生狀態(tài)，是經(jīng)過(guò)人工飼養(yǎng)繁殖多代凈化過(guò)的，因此包括多瘤病毒在內(nèi)的一些病原體可能已經(jīng)凈化掉了。以上幾個(gè)方面均需在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)深入研究。

綜上所述，我們建立了小鼠多瘤病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)一定數(shù)量的裸鼴鼠樣本進(jìn)行了檢測(cè)，為實(shí)驗(yàn)用裸鼴鼠微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了參考。

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EstablishmentofafluorescencequantitativePCRassayformurinepolyomavirusdetectionanditsuseinthedetectioninnakedmolerats

LI Xiao-bo， FU Rui， WANG Shu-jing， WEI Li， HE Zheng-ming， WANG Ji*， YUE Bing-fei*

(Institute of Laboratory Animal Resources, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo establish a fluorescence quantitative PCR assay for polyomavirus and to apply this technique in the investigation of its infection rate in naked mole rats.MethodsTo compare the nucleic acid sequence of murine polyomavirus (Genbank: NC_001515) in NCBI and design primers and probes in its conserved region. To establish a fluorescence quantitavive PCR method for polyomavirus and evaluate the sensitivity and specificity of the method. To infect nine one-day old KM strain suckling mice, and to collect samples of the heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, thymus, cecal contents and blood at 21 days after infection. The efficacy of the method was validated by detecting the virus in organs. 62 cecal samples from naked mole rats were tested by the established assay.ResultsThere was obvious fluorescence signal when polyomavirus was used as the template and no fluorescence signal when simian virus 40, murine K virus, MVM and H-1 were used as templates. The detection limit of the assay was 100 copies/μL. Polyomavirus DNA was detected in the heart, liver, spleen, lung, kidney and cecal contents of the mice which were inoculated with polyomavirus. The polyomavirus DNA content was highest in the lung tissue. There was no detectable polyomavirus DNA in the brain, thymus and blood of the infected mice. Sixty-two cecal contents of naked mole rats were tested for polyomavirus and the results were negative.ConclusionsThe fluorescence quantitative PCR assay for polyomavirus established in this study can effectively detect polyomavirus DNA in animal tissues. The results of investigation of the natural infected polyomavirus of naked mole rats provide a reference for the formulation of microbiological criteria for experimental naked mole rats.

Polyomavirus;Heterocephalusglaber; Fluorescence quantitative PCR

國(guó)家科技支撐計(jì)劃“普通級(jí)封閉群裸鼴鼠種群的建立及耐低氧機(jī)制的初步研究”(2015BAI09B02)。

李曉波(1980-)，男，副研究員，研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒學(xué)。 E-mail： lxb8493059@163.com。

岳秉飛(1960-)，男，研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail： y6784@126.com。

王吉(1974-)，女，副研究員，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: wj_nd_jds@sina.com。*共同通訊

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0091-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.016

2017-05-05