王淑貞，尹 紅，鐘耀藝，范偉偉，林庚海*

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000； 2.廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院(福建省漳州中國人民解放軍第175醫(yī)院)， 福建 漳州 363000)

敲除TRPC6對MPTP誘導(dǎo)小鼠神經(jīng)炎性損傷的影響

王淑貞1，尹 紅1，鐘耀藝2，范偉偉2，林庚海2*

(1.漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，福建 漳州 363000； 2.廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院(福建省漳州中國人民解放軍第175醫(yī)院)， 福建 漳州 363000)

研究報告

目的在小鼠MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥模型中檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的TRPC6通道的表達，并探究TRPC6通道對于炎癥表達和多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響。方法在MPTP注射的小鼠中，用標(biāo)記CD11b的磁珠分選出黑質(zhì)區(qū)域的小膠質(zhì)細(xì)胞，并通過蛋白質(zhì)免疫印跡的方法檢測TRPC6的表達。在構(gòu)建CD11b-TRPC6-/-小鼠后，通過免疫熒光的方法檢測MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖以及多巴胺能神經(jīng)元的損傷。同時結(jié)合蛋白質(zhì)免疫印跡和實時熒光定量PCR的方法，在MPTP模型中檢測TRPC6敲除后cryαB蛋白水平和炎癥因子表達。結(jié)果在MPTP注射的小鼠中，小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道的表達顯著上調(diào)。另外，在注射MPTP的CD11b-TRPC6-/-小鼠中，小膠質(zhì)細(xì)胞中的cryαB蛋白水平被上調(diào)。同時，MPTP誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖以及炎癥因子表達增強被抑制，而多巴胺能神經(jīng)元的損傷得到緩解。結(jié)論小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道表達在MPTP模型中上調(diào)，而TRPC6的敲除可增加小膠質(zhì)細(xì)胞中cryαB蛋白水平，并降低炎癥因子的表達，從而減少多巴胺能神經(jīng)元的損傷。

小膠質(zhì)細(xì)胞；TRPC6通道；炎癥；MPTP；多巴胺能神經(jīng)元；帕金森病

帕金森病(Parkinson’ s disease，PD)是僅次于阿爾茲海默癥(Alzheimer’ s disease，AD)的第二常見的神經(jīng)退行性疾病，其主要病理學(xué)表現(xiàn)為PD患者黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元(dopaminergic neuron)的退行性病變[1, 2]。另外，研究表明，在PD的發(fā)生發(fā)展過程中，患者腦部的炎癥反應(yīng)逐漸增強[3, 4]，而過度的炎癥表達會直接導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷[5-7]，提示炎癥可能在PD的發(fā)病過程中扮演重要角色。

小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)被報道是大腦內(nèi)一類主要的免疫細(xì)胞，其主要負(fù)責(zé)感知外界的炎性刺激，啟動大腦內(nèi)的免疫系統(tǒng)以及吞噬并清除外來侵入的病原體[8, 9]。在PD患者腦部以及小鼠的PD模型——1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine(MPTP)模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞也被大量激活，并促進黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元的炎性損傷[10, 11]。因此，通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，進而減少巴胺能神經(jīng)元的死亡很有可能成為延緩PD病程發(fā)展的有效手段。但是，對于小膠質(zhì)細(xì)胞在PD發(fā)展過程中被過度激活的機制仍在探索之中。

鈣離子是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，同時也對于小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和增殖也至關(guān)重要[12, 13]。作為瞬時受體電勢通道(transient receptor potential channel，TRPC)家族一員，TRPC3受到腦源性營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)的調(diào)控，可以在小膠質(zhì)細(xì)胞中抑制一氧化氮的產(chǎn)生[14]。另外，在β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的AD細(xì)胞模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6被報道表達升高，并促進炎癥因子表達[15]。但是，對于TRPC通道是否參與PD發(fā)展過程中的炎癥調(diào)節(jié)目前還未研究透徹。

α晶狀蛋白B鏈(α-crystallin B chain，cryαB)是一類小熱休克蛋白。除了結(jié)合錯誤折疊蛋白防止其聚集外，cryαB還被報道具有炎癥調(diào)節(jié)的功能[16, 17]。在PD的小鼠模型中，cryαB可以在星形膠質(zhì)細(xì)胞中介導(dǎo)多巴胺受體2(dopamine receptor D2)信號進而抑制炎癥的過度表達[6]。

在本研究中，我們在注射MPTP的小鼠中發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞的TRPC6通道的表達顯著升高。而在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異敲除TRPC6之后，MPTP模型中小膠質(zhì)細(xì)胞的cryαB蛋白水平被上調(diào)，同時小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和炎癥因子的表達被顯著抑制，黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元的損傷得到緩解。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

CD11b-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6背景)購于European Mouse Mutant Archive(EMMA)，TRPC6flox/flox小鼠(129/sv背景)購于美國Jackson Laboratory。野生型C57BL/6小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK(滬)2012-0002]。動物模型建立及相關(guān)實驗在中國人民解放軍第一七五醫(yī)院[SYXK(軍)2012-0054]開展。本研究中涉及的全部動物實驗均參考中國人民解放軍第一七五醫(yī)院動物管理委員會有關(guān)實驗動物使用的相關(guān)規(guī)定，并遵照實驗動物試驗3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 抗體和試劑

TRPC6抗體購于Alomone公司(貨號ACC-017)；TRPC3抗體購于Alomone公司(貨號ACC-016)；離子鈣結(jié)合銜接子分-1(ionized calcium-binding adapter molecule 1，Iba1)抗體購于Wako公司(貨號019-19741)；六糖核苷酸結(jié)合蛋白-3(hexaribonucleotide binding protein-3/NeuN)抗體購于Abcam公司(貨號ab177487)；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購于Sigma公司(貨號G3893)；酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體購于Millipore公司(貨號MAB318)；cryαB抗體購于Abgent公司(貨號ALS12840)；分化分子簇-11b(cluster of differen-tiation molecule 11b，CD11b)抗體標(biāo)記磁珠購于MiltenyiBiotec公司(貨號130-049-601)；MPTP購于Sigma公司(貨號M0896)；TRIzol購于Sigma公司(貨號T9424)。

1.3 實驗方法

1.3.1 CD11b-TRPC6-/-小鼠品系構(gòu)建

通過將CD11b-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與TRPC6flox/flox小鼠交配獲得CD11b-TRPC6+/-F1代雜合小鼠(+，TRPC6野生型；-，TRPC6敲除)。再將CD11b-TRPC6+/-F1代與TRPC6flox/flox小鼠回交并篩選獲得CD11b-TRPC6-/-F2代純合子小鼠。而通過將CD11b-TRPC6-/-F2代與TRPC6flox/flox小鼠交配，則可穩(wěn)定獲得CD11b-TRPC6-/-小鼠子代。

1.3.2 MPTP注射

待雄性CD11b-TRPC6-/-小鼠生長至8～10周(23～25 g)后，即可建立MPTP模型。MPTP(20 mg/kg)注射采用急性腹腔給藥的方式，模型中每只小鼠連續(xù)給予4次MPTP注射，每次間隔2 h。在MPTP模型建立后的第3天進行小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖及炎癥因子表達檢測，而多巴胺神經(jīng)元損傷檢測于模型建立后的第7天。

1.3.3 免疫熒光

在MPTP模型建立后，使用戊巴比妥鈉麻醉小鼠。經(jīng)過生理鹽水和4%的多聚甲醛灌流小鼠后，解剖出腦部，置于4%的多聚甲醛中過夜。第二天，更換30%的蔗糖溶液以脫去組織中的水分。待腦組織在蔗糖溶液中沉底后，進行冰凍切片(30 m)。腦片經(jīng)0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖生理鹽水 (phos-phate buffer saline，PBS)漂洗后，置于10%的牛血清白蛋白中室溫封閉1 h。在4℃孵育一抗過夜(抗體稀釋比例均為1∶1000)后，再使用PBS漂洗三次，并置于熒光二抗(稀釋比例均為1∶1000)中室溫孵育2 h。待PBS漂洗去非特異結(jié)合二抗后，置于顯微鏡下進行熒光檢測。

實驗中，將Iba1蛋白在黑質(zhì)區(qū)域的平均熒光表達強度(mean fluorescence intensity，MFI)定義為小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖水平，并通過ImageJ軟件進行熒光定量分析。而黑質(zhì)區(qū)域TH陽性表達細(xì)胞使用Image Pro Plus軟件進行計數(shù)。

1.3.4 小膠質(zhì)細(xì)胞分選

在將小鼠進行二氧化碳安樂死后，在冰上快速解剖出小鼠的腹側(cè)中腦，并使用眼科剪將組織剪碎。在經(jīng)過消化液(0.05%的膠原蛋白酶D+0.025 U/mL的DNA酶)室溫消化組織0.5 h后，500 r/min離心沉淀細(xì)胞。待PBS重懸細(xì)胞后，使用CD11b抗體標(biāo)記的磁珠4℃孵育標(biāo)記細(xì)胞1 h。經(jīng)過分選器分選后，獲得CD11b陽性表達細(xì)胞。

1.3.5 蛋白免疫印跡

將分選的小膠質(zhì)細(xì)胞置于蛋白裂解液(碧云天)裂解后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。待將凝膠上蛋白4℃轉(zhuǎn)移至醋酸纖維膜上后，使用5%的脫脂牛奶室溫封閉0.5 h。在4℃孵育一抗過夜(NeuN、Iba1、GFAP和cryαB抗體稀釋比例均為1∶800，-actin抗體稀釋比例為1∶10000)后，進行PBS漂洗，并室溫孵育二抗(稀釋比例均為1∶5000)2 h。經(jīng)過PBS再次漂洗三次后，滴加曝光液，置于成像儀中進行分析。

1.3.6 實時熒光定量PCR

樣品經(jīng)過TRIzol提取總RNA后，通過反轉(zhuǎn)錄酶于42℃反轉(zhuǎn)獲得cDNA。腫瘤壞死因子-(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6以及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的相對表達使用SYBR green法進行熒光實時定量。TNF-a的引物為：正向5′-CTACGAGACCAAGTGCAATCC-3′；反向5′-AATCGCCAGCCAATTCTCTTT-3′。IL-1b的引物為：正向5′-GTACATAAAATCTGGGGGTTCTGGG-3′；反向5′-AGTCTTAAAGCAAGGAACAACGTATTT-3′；IL-6的引物為：正向5′-CTACGAGACCAAGTGC AATCC-3′；反向5′-AATCGCCAGCCA ATTCTCTTT-3′。iNOS的引物為：正向5′-GTTCTCAGCCCAAC AATACAAGA-3′；反向5′-GTGGACGGGTCGATGTCA C-3′。bβ-actin的引物為：正向5′-CCTCGCCTTTG CCGATCCG-3′；反向5′-ATGCCGGAGCCGTTGTCG- 3′。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道的表達在MPTP模型中顯著升高

為了探究TRPC通道在PD發(fā)展過程中的炎癥調(diào)節(jié)作用，我們首先在小鼠上建立了MPTP模型，并通過標(biāo)記有CD11b抗體的磁珠將小膠質(zhì)細(xì)胞從黑質(zhì)區(qū)域分選出來。如圖1A顯示，CD11b磁珠分選出的細(xì)胞特異地表達小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白—Iba1，而并不表達星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記蛋白—GFAP和神經(jīng)元的的標(biāo)記蛋白—NeuN。另外，通過蛋白質(zhì)免疫印跡分析，我們發(fā)現(xiàn)在CD11b磁珠分選出的細(xì)胞中TRPC6的蛋白表達有顯著升高(圖1B-C)，而TRPC家族的另一成員TRPC3的表達并不受到影響(圖1B和D)。這些提示MPTP可以特異地上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞的TRPC6通道的表達。

注：與生理鹽水組比，***P<0.001。圖1 MPTP注射對于小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6蛋白表達影響(n=6) Compared with the saline group，*** P<0.001.Fig.1 Effect of MPTP administration on the expression of TRPC6 in the microglia. Compared with the saline group,*** P<0.001.

2.2 小膠質(zhì)細(xì)胞中特異敲除TRPC6抑制MPTP介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活和炎癥因子表達

為了進一步研究小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道在MPTP模型中對炎癥的調(diào)控，我們通過將CD11b-Cre和TRPC6flox/flox的小鼠雜交，得到在小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6蛋白特異敲除的小鼠。炎癥因子TNF-、IL-1、IL-6以及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白iNOS等被報道在MPTP介導(dǎo)的神經(jīng)炎性損傷中扮演重要角色[6, 10,11]。我們發(fā)現(xiàn)，在CD11b-TRPC6-/-小鼠中，其這些炎癥因子表達并沒有發(fā)生改變(圖2D-F)。而在注射MPTP之后，其TNF-、IL-1、IL-6以及iNOS的mRNA水平相對于TRPC6flox/flox的小鼠被顯著下調(diào)(圖2D-F)。同時，免疫熒光的結(jié)果顯示，在小膠質(zhì)細(xì)胞中敲除TRPC6通道后，MPTP注射引起的黑質(zhì)區(qū)域Iba1陽性表達的小膠質(zhì)細(xì)胞的增多也受到抑制(圖2 A和C)。

注：1：TRPC6flox/flox-生理鹽水組；2：CD11b-TRPC6-/--生理鹽水組；3：TRPC6flox/flox-MPTP組；4：CD11b-TRPC6-/--MPTP組。與TRPC6flox/flox-生理鹽水組相比，* P<0.05，** P<0.01，***P<0.001;與TRPC6flox/flox-MPTP組相比，##P<0.01，###P<0.001;虛線框里顯示黑質(zhì)區(qū)域Iba1陽性表達細(xì)胞。圖2 小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6蛋白敲除對于MPTP介導(dǎo)cryαB蛋白表達、 小膠質(zhì)細(xì)胞增殖以及炎癥因子產(chǎn)生的影響(n=5, Bar=250 μm)Note.1: TRPC6flox/flox-saline group. 2: CD11b-TRPC6-/--saline group. 3: TRPC6flox/flox-MPTP group. 4: CD11b-TRPC6-/--MPTP group in Fig. 2B. Compared with the TRPC6flox/flox-saline group，* P<0.05,** P<0.01,***P<0.001. Compared with the TRPC6flox/flox-MPTP group，##P<0.01,###P<0.001. Dashed boxes indicate Iba1-positive cells in substantia nigra.Fig.2 Effect of TRPC6 knock-out in microglia on the MPTP-induced cryαB expression, microglia proliferation and cytokine production

2.3 小膠質(zhì)細(xì)胞中特異敲除TRPC6導(dǎo)致cryαB蛋白水平被上調(diào)

由于膠質(zhì)細(xì)胞中的cryαB蛋白被報道具有抑制炎癥作用[16, 17]，我們接下來檢測了cryαB在TRPC6flox/flox和的CD11b-TRPC6-/-小鼠表達。在注射MPTP之后，相對于TRPC6flox/flox小鼠，cryαB蛋白在CD11b-TRPC6-/-小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達被顯著上調(diào)(圖2B和D)，提示cryαB可能在TRPC6通道下游發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)功能。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞中特異敲除TRPC6減少MPTP介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷

為了探究TRPC6通道調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥表達的病理意義，我們通過染色多巴胺能神經(jīng)元的標(biāo)記蛋白—TH來測定MPTP 注射小鼠中多巴胺能神經(jīng)元的存活數(shù)量。結(jié)果顯示，在注射MPTP后的第7天，黑質(zhì)區(qū)域的TH陽性表達神經(jīng)元數(shù)目顯著減少(圖3A-B)。而在小膠質(zhì)細(xì)胞中敲除TRPC6通道后，MPTP注射引起的TH陽性表達神經(jīng)元損傷被部分抑制(圖3A-B)。

注：與TRPC6flox/flox-生理鹽水組相比，* P<0.05，***P<0.001；與TRPC6flox/flox-MPTP組相比，#P<0.05。圖3 小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6蛋白敲除對于MPTP介導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元損傷的影響(n=6，Bar=250 μm)Note.Compared with the TRPC6flox/flox-saline group,* P<0.05,***P<0.001. Compared with the TRPC6flox/flox-MPTP group,#P<0.05.Fig.3 Effect of TRPC6 knock-out in the microglia on MPTP-induced dopaminergic neuron damages

3 討論

在PD的發(fā)生發(fā)展過程中，伴隨著大腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的增強，提示炎癥很可能參與了患者黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元的損傷，進而促進病情的發(fā)展。另外，鈣離子信號的傳導(dǎo)對于小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮正常功能至關(guān)重要，而其中TRPC6調(diào)節(jié)的鈣信號在小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥調(diào)節(jié)過程中扮演重要角色。因此，探究TRPC通道是否參與PD發(fā)展過程中的炎癥調(diào)節(jié)作用，進而影響神經(jīng)元的存活，對于理解PD的發(fā)病機制以及臨床干預(yù)PD的發(fā)展進程具有重要意義。

在本次實驗中，我們發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞中的TRPC6通道在小鼠MPTP模型中顯著升高。而在小膠質(zhì)細(xì)胞中特異敲除TRPC6蛋白后，炎癥抑制蛋白cryαB的水平顯著上調(diào)。另外，MPTP所介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖以及炎癥因子的表達被有效抑制，同時經(jīng)元的損傷也得到部分緩解。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子信號對小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、遷移和炎癥表達具有重要調(diào)節(jié)作用[12]。然而，在小膠質(zhì)細(xì)胞的激活期間，鈣離子信號是如何進行信號傳遞并發(fā)揮功能還未研究清楚。在實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在注射MPTP后，CD11b-TRPC6-/-小鼠中cryαB蛋白水平被上調(diào)，同時炎癥因子表達和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活被明顯抑制。鑒于cryαB蛋白被認(rèn)為是一類炎癥抑制蛋白[16, 17]，提示cryαB可能在TRPC6通道下游發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)功能。另外，鈣離子信號被報道可以調(diào)節(jié)cryαB的翻譯后修飾并影響其活性[18, 19]，為后續(xù)探究TRPC6通道在小膠質(zhì)細(xì)胞中對于cryαB的調(diào)節(jié)奠定了理論基礎(chǔ)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，MPTP注射可以導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道的表達升高，但對于其中的機制還未闡述明晰。根據(jù)報道，在小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞系—BV-2細(xì)胞中，β淀粉樣蛋白可以同樣導(dǎo)致TRPC6蛋白表達的上升。而在此過程中，TRPC6蛋白表達變化受到了轉(zhuǎn)錄因子NF-kappaB的調(diào)控[15]。在MPTP模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-kappaB同樣也被激活[10]。因此，探究NF-kappaB是否介導(dǎo)MPTP注射導(dǎo)致的TRPC6通道的表達上調(diào)，對于我們理解PD發(fā)生發(fā)展過程中小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥調(diào)控具有重要意義。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在MPTP模型中，小膠質(zhì)細(xì)胞中TRPC6通道表達被上調(diào)，并促進了小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖以及炎癥因子的表達，進而影響了多巴胺能神經(jīng)元的存活，而cryαB蛋白可能在TRPC6通道下游參與了炎癥的表達調(diào)控，為闡明小膠質(zhì)細(xì)胞的功能以及以TRPC6為靶標(biāo)緩解PD過程中的炎癥損傷提供了理論依據(jù)。

[1] Groger A, Kolb R, Schafer R, et al. Dopamine reduction in the substantia nigra of Parkinson’ s disease patients confirmed by in vivo magnetic resonance spectroscopic imaging [J]. PLoS One, 2014, 9(1): e84081.

[2] Drui G, Carnicella S, Carcenac C, et al. Loss of dopaminergic nigrostriatal neurons accounts for the motivational and affective deficits in Parkinson’ s disease [J]. Mol Psychiatry, 2014, 19(3):358-367.

[3] Deleidi M, Gasser T. The role of inflammation in sporadic and familial Parkinson’ s disease [J]. Cell Mol Life Sci, 2013, 70(22): 4259-4273.

[4] Gerhard A, Pavese N, Hotton G, et al. In vivo imaging of microglial activation with [11C](R)-PK11195 PET in idiopathic Parkinson’ s disease [J]. Neurobiol Dis, 2006, 21(2):404-412.

[5] Ouchi Y, Yoshikawa E, Sekine Y, et al. Microglial activation and dopamine terminal loss in early Parkinson’ s disease [J]. Ann Neurol, 2005, 57(2): 168-175.

[6] Shao W, Zhang SZ, Tang M, et al. Suppression of neuroinflammation by astrocytic dopamine D2 receptors via alphaB-crystallin [J]. Nature, 2013, 494(7435): 90-94.

[7] Gao X, Chen H, Schwarzschild MA, et al. Use of ibuprofen and risk of Parkinson disease [J]. Neurology, 2011, 76(10): 863-869.

[8] Yamasaki R, Lu H, Butovsky O, et al. Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system [J]. J Exp Med, 2014, 211(8): 1533-1549.

[9] Ginhoux F, Lim S, Hoeffel G, et al. Origin and differentiation of microglia [J]. Front Cell Neurosci, 2013, 7: 45.

[10] Jing H, Wang S, Wang M, et al. Isobavachalcone attenuates MPTP-induced Parkinson’ s disease in mice by inhibition of microglial activation through NF-kappaB pathway [J]. PLoS One, 2017, 12(1): e0169560.

[11] Jiang J, Kim JJ, Kim DY, et al. Acorus gramineus inhibits microglia mediated neuroinflammation and prevents neurotoxicity in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)-induced mouse model of Parkinson’ s disease [J]. J Ethnopharmacol, 2012, 144(3): 506-513.

[12] Kettenmann H, Hanisch UK, Noda M, et al. Physiology of microglia [J]. Physiol Rev, 2011, 91(2): 461-553.

[13] Miyake T, Shirakawa H, Kusano A, et al. TRPM2 contributes to LPS/IFNgamma-induced production of nitric oxide via the p38/JNK pathway in microglia [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 444(2): 212-217.

[14] Mizoguchi Y, Kato TA, Seki Y, et al. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) induces sustained intracellular Ca2+elevation through the up-regulation of surface transient receptor potential 3 (TRPC3) channels in rodent microglia [J]. J Biol Chem, 2014, 289(26): 18549-18555.

[15] Liu N, Zhuang Y, Zhou Z, et al. NF-kappaB dependent up-regulation of TRPC6 by Aβ in BV-2 microglia cells increases COX-2 expression and contributes to hippocampus neuron damage [J]. Neurosci Lett, 2017, 651: 1-8.

[16] Park H, Hwang HJ, Hwang HS, et al. Alpha B-crystallin prevents ventricular arrhythmia by attenuating inflammation and oxidative stress in rat with autoimmune myocarditis [J]. Int J Cardiol, 2015, 182: 399-402.

[17] Holtman IR, Bsibsi M, Gerritsen WH, et al. Identification of highly connected hub genes in the protective response program of human macrophages and microglia activated by alpha B-crystallin [J]. Glia, 2017, 65(3): 460-473.

[18] Chebotareva NA, Eronina TB, Sluchanko NN, et al. Effect of Ca2+and Mg2+ions on oligomeric state and chaperone-like activity of αB-crystallin in crowded media [J]. Int J Biol Macromol, 2015, 76: 86-93.

[19] Aggeli IK, Beis I, and Gaitanaki C. Oxidative stress and calpain inhibition induce alpha B-crystallin phosphorylation via p38-MAPK and calcium signalling pathways in H9c2 cells [J]. Cell Signal, 2008, 20(7): 1292-1302.

EffectofTRPC6knock-outonthemouseneuroinflammationinducedbyMPTP

WANG Shu-zhen1， YIN Hong1， ZHONG Yao-yi2， FAN Wei-wei2， LING Geng-hai2*

(1.Zhangzhou Health Vocational College, Zhangzhou 363000, China； 2.The Affiliated Dongnan Hospital of Xiamen University (PLA 175th Hospital), Zhangzhou 363000)

ObjectiveTo measure the level of microglia TRPC6 in mouse MPTP (1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)-induced neuroinflammation model and investigate its role in cytokine production and dopaminergic neuron damages.MethodsMicroglia were sorted by magnetic beads labeled with CD11b antibody and the level of TRPC6 in MPTP-induced neuroinflammation models was measured by western blotting. The proliferation of microglia and damages of dopaminergic neurons induced by MPTP were analyzed by immunofluorescence in CD11b-TRPC6-/-mice. Meanwhile, the expression of cryαB and cytokines in microglia was measured by western blotting and real-time quantitative PCR, respectively.ResultsThe level of microglia TRPC6 in MPTP-induced neuroinflammation model was up-regulated. The expression of cryαB was increased and the cytokine level was down-regulated in the microglia in MPTP-injected CD11b-TRPC6-/-mice. Moreover, the dopaminergic neuron survival was improved in the MPTP-induced neuroinflammation model after TRPC6 knock-out in the microglia.ConclusionsThe expression of TRPC6 in microglia is up-regulated after MPTP injection, while in CD11b-TRPC6-/-mice the MPTP-induced cytokine expression is reduced, contributing to the improvement of dopaminergic neuron survival.

Microglia; TRPC6; Inflammation; MPTP; Dopaminergic neuron; Parkinson’s disease

國家自然基金(81601223)。

王淑貞(1982-)，女，講師，研究方向: 妊娠期合并神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷和治療。E-mail: wsz2211518@126.com

林庚海(1978-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向: 炎癥調(diào)節(jié)和心血管疾病治療。E-mail: 183961581@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0001-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.001

2017-05-17

簡訊

《中國實驗動物學(xué)報》入編《中文核心期刊要目總覽》(北大圖書館)

2014年版(即第七版)

《中文核心期刊要目總覽》是學(xué)術(shù)界對某類期刊的定義，一種期刊等級的劃分。它的對象是中文學(xué)術(shù)期刊。是根據(jù)期刊影響因子等諸多因素所劃分的期刊。中文核心期刊是北京大學(xué)圖書館聯(lián)合眾多學(xué)術(shù)界權(quán)威專家鑒定，目前受到了學(xué)術(shù)界的廣泛認(rèn)同。從影響力來講，其等級屬同類劃分中較權(quán)威的一種。按照慣例，北大核心期刊每四年由北大圖書館評定一次，并出版《北大核心期刊目錄要覽》一書。