李輝騰 郭旭光 柯茂彬 黎卓華 磨慧玲 吳麗川 李亞東

1.廣東同江醫(yī)院檢驗科，廣東佛山528300；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510150

LAMP技術(shù)檢測社區(qū)獲得性非典型肺炎中的嗜肺軍團菌感染

李輝騰1郭旭光2柯茂彬1黎卓華1磨慧玲1吳麗川1李亞東1

1.廣東同江醫(yī)院檢驗科，廣東佛山528300；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科，廣東廣州510150

目的探討環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)檢測社區(qū)獲得性肺炎非典型病原體嗜肺軍團菌感染的可行性。方法收集195例CAP患者急性期雙份合格痰液標本，一份痰液標本用作嗜肺軍團菌分離培養(yǎng)，一份痰液標本經(jīng)處理后-80℃保存至DNA提取運用LAMP技術(shù)及熒光定量PCR檢測，驗證LAMP試驗方法的敏感性、特異性及可行性。結(jié)果195例痰培養(yǎng)嗜肺軍團菌檢出率1.54%（3/195），熒光定量PCR靈敏度達10-3/mL，檢出率8.72%（17/195）；LAMP方法學(xué)靈敏度達10-7/μL，檢出率9.23%（18/195）；兩者陽性符合率94.44%（17/18），兩者陰性符合率99.44%（177/178），兩者總符合率99.49%（194/195）。結(jié)論采用LAMP技術(shù)檢測臨床痰液標本中的嗜肺軍團菌具有高度的特異性和敏感性，實驗時間約1.5h且操作簡便，更合適基層醫(yī)院開展。

LAMP技術(shù)；社區(qū)獲得性非典型肺炎；嗜肺軍團菌；痰培養(yǎng)

社區(qū)獲得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是指于院外罹患的肺實質(zhì)感染性嚴重疾病，按致病菌不同又可將疾病分為典型性與非典型性[1]。前者致病菌以肺炎鏈球菌最多見[2]，而非典型性則以肺炎支原體、肺炎衣原體、嗜肺軍團菌多見。由于嗜肺軍團菌（legionella pneumophila，Lp）生長緩慢且要求嚴苛，因此傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)陽性率低、操作繁瑣、耗時長，難以在臨床普及開展[3]。目前使用比較多檢測嗜肺軍團菌的方法學(xué)有熒光定量PCR、血清免疫學(xué)檢測、尿抗原檢測等[4-5]。本研究是采用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)原理針對嗜肺軍團菌mip特異性基因設(shè)計出一套引物在一定條件下對社區(qū)獲得性非典型肺炎患者臨床痰液標本進行檢測，現(xiàn)將實驗報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月～2017年6月本院及廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院CAP患者共195例，所納入患者均符合社區(qū)獲得性非典型性肺炎診斷標準[6]。大部分患者有頑固性咳嗽，入院前咳嗽5～10d經(jīng)抗生素治療未見明顯好轉(zhuǎn)，上述患者留取急性期雙份合格痰液標本。

1.2 菌株來源

嗜肺軍團菌臨床分離菌株（廣州微生物研究所贈）

1.3 主要試劑與儀器

嗜肺軍團菌選擇培養(yǎng)基GVPC平板，確認培養(yǎng)基BCYE平板及BCYE-cys平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。嗜肺軍團菌核酸檢測試劑盒（上海之江），細菌基因組核酸提取試劑盒（廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司）。嗜肺軍團菌LAMP引物（上海生工生物工程有限公司合成）。全自動細菌培養(yǎng)儀（BD9120）鑒定儀（PHOENIX-100），5%CO2培養(yǎng)箱（上海精宏HF212），熒光定量PCR儀ABI Prism 7300（美國），ZYD-S1恒溫?zé)晒鈾z測儀（廣州雙螺旋基因技術(shù)有限公司），-80℃深低溫冰箱（海爾DW40L262），干式恒溫儀（黑馬 H-I），顯微鏡（奧林巴斯CX31）等。

1.4 方法

1.4.1 嗜肺軍團菌痰培養(yǎng) 將合格痰液標本接種于GVPC平板放于36℃5%CO2培養(yǎng)箱，每天觀察平板上菌落生長情況。如果GVPC平板有菌落生長則上挑取灰白色、大小適中、圓形稍凸、濕潤、有光澤和粘稠的菌落1～2個，做革蘭染色。把革蘭染色陰性的菌落接種BCYE和 BCYE-cys（不含L-半胱氨酸）平板，36℃，5%CO2培養(yǎng)2～3天，凡在BCYE瓊脂平板上生長而在BCYE-cys瓊脂上不生長的則為軍團菌菌落。

1.4.2 熒光定量PCR檢測 取痰液加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min液化，取0.5mL樣品于離心管中，再加入0.5mL 4%NaOH 室溫放置10min后13 000rpm離心5min。沉淀加無菌生理鹽水1mL打勻，13 000rpm離心5min：再重復(fù)洗滌一次。去盡上清，沉淀物中直接加入50μL DNA提取液充分混勻，100℃恒溫10min再13 000rpm離心5min，取上清4μL做PCR反應(yīng)模板，根據(jù)Ct值判斷結(jié)果：待測樣品Ct值≤35，檢測結(jié)果報為陽性；待測樣本Ct值顯示在35～40之間，需重復(fù)測定，Ct值仍在35～40之間，且擴增曲線呈典型的S型，則判斷為陽性；若非典型S型曲線，則判為陰性。

1.4.3 嗜肺軍團菌LAMP引物設(shè)計 選取嗜肺軍團菌具有高度保守性的mip特異基因，采用LAMP引物設(shè)計軟件Primer Explorer version4設(shè)計引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列為：

F3-GTTGTTGTATTGCCAAGTGG，B3-TTTCATTTGGGCCAATAGGT

FIP（F1c+F2）-ACGTTGCTGGCTTACCAGTTA GTCACTGTCGAATATACTGGT

BIP（B1c+B2）-TGGATGGACAGAAGCTTTGCA CCATATGCAAGACCTGAGG

LoopF-ACGGTACCATCAATCAGACG，LoopBAGCTGGATCAACTTGGGAAAT

1.4.4 LAMP反應(yīng)體系 將合成的引物均配制成內(nèi)引物：外引物：環(huán)引物濃度比為40 μM：5 μM：20μM的引物混合液，然后取1μL進行恒溫擴增反應(yīng)。25μL反應(yīng)體系含有：引物混合液PM 1μL，2× 反應(yīng)液 12.5μL，Bst聚合酶 8U，熒光染料SYTO-9 0.5μL，待檢樣品2μL，用超純水補齊至25μL，加入密封液20μL，反應(yīng)條件63℃時間45min。根據(jù)擴增曲線呈典型的S型則判斷為陽性，若非典型S型曲線，則判為陰性。

1.4.5 采用LAMP技術(shù)對臨床痰液標本檢測 收集195例臨床痰液標本經(jīng)液化處理后提取的DNA標本從-80℃深低溫冰箱取出，采用嗜肺軍團菌菌株DNA（107拷貝/mL）作為陽性對照，非嗜肺軍團菌DNA（107拷貝/mL）作為陰性對照，反應(yīng)條件63℃時間45min。

2 結(jié)果

2.1 特異性實驗

分別提取嗜肺軍團及其他常見病原菌金黃色葡萄球菌，傷寒沙門氏菌，阪崎腸桿菌，單核細胞增生李斯特氏菌，福氏志賀氏菌，大腸埃希氏菌，副溶血性弧菌，銅綠假單胞桿的基因組DNA，按照設(shè)計的反應(yīng)條件進行擴增，只有嗜肺軍團菌菌株出現(xiàn)“S”擴增曲線，非嗜肺軍團菌及陰性對照均呈陰性結(jié)果。見圖1。

圖1

2.2 敏感性實驗

提取嗜肺軍團菌基因組DNA濃度為1ng/μL依次稀釋至 100pg/μL、10pg/μL、1pg/μL、100fg/μL后作為模板進行實驗。實驗結(jié)果表明敏感性可達100fg/μL即 10-7/μL，比熒光定量 PCR10-3/mL檢測限（試劑說明書）高。

2.3 195例痰液標本進行傳統(tǒng)痰培養(yǎng)只檢出嗜肺軍團菌3例陽性，檢出率1.54%（3/195），采用熒光定量PCR檢出17例陽性，檢出率8.72%（17/195），LAMP方法學(xué)檢出18例陽性檢出率9.23%（18/195）。熒光定量 PCR法和 LAMP技術(shù)兩者陽性符合率94.44%（17/18），兩者陰性符合率99.44%（177/178），兩者總符合率99.49%（194/195）。見圖 2。

圖2

3 討論

隨著社區(qū)獲得性肺炎的發(fā)生率愈漸攀升，其相關(guān)研究已成為熱點[7]。嗜肺軍團菌廣泛存在于空調(diào)系統(tǒng)冷卻水、泳池水、環(huán)境水源等是社區(qū)獲得性非典型性肺炎的重要病原體之一，據(jù)范志強等報道其在社區(qū)獲得性非典型性肺炎中占比可達5%左右[8-9]。軍團菌肺炎潛伏期2～10d有明顯的肺外癥狀該病在早期X線胸片無特征性改變[10]，因此，僅依據(jù)臨床表現(xiàn)難以確診。病原體分離培養(yǎng)作為診斷嗜肺軍團菌的金標準，雖診斷價值高，但由于嗜肺軍團菌屬于苛養(yǎng)菌需要特殊培養(yǎng)基且生長極為緩慢，因此，不具快速檢測優(yōu)勢[11]。另一種早期檢測方式，尿抗原檢測通過濃縮尿標本雖可在一定程度上增加檢測的敏感度，但無法檢出Lp以外的血清型，加之尿抗原排出時間相對較長，也增加對感染時間的判斷難度[12]。

熒光定量PCR快速檢測法的最大優(yōu)勢在于快速、便捷[13]，直接規(guī)避了病原體分離培養(yǎng)的時間局限，但對實驗室設(shè)備要求比較高對基層醫(yī)院難以普及開展。本研究采用LAMP技術(shù)原理針對嗜肺軍團菌mip特異性基因設(shè)計獨特引物對嗜肺軍團菌具有高靈敏度、高特異性，添加環(huán)引物使擴增反應(yīng)更快，而添加新型熒光染料SYTO-9后不需要進行電泳直接在恒溫?zé)晒鈾z測儀就能直觀判斷出結(jié)果。為進一步探索本實驗方法的應(yīng)用價值，本研究將其與痰培養(yǎng)及熒光定量PCR法等進行對比。結(jié)果提示，LAMP技術(shù)能檢測出痰培養(yǎng)及熒光定量PCR法所檢出的嗜肺軍團菌陽性標本。而熒光定量PCR檢測不出的另一例陽性標本可能是其他種或血清型嗜肺軍團菌菌株或者是基于靈敏度原因。PCR及LAMP兩種方法同樣具備高度特異性，但LAMP在特異性、靈敏度具顯著優(yōu)勢，且重復(fù)性更佳，穩(wěn)定性更強。該方法擴增及檢測過程均于同一閉管內(nèi)進行，不僅降低標本污染風(fēng)險，降低假陽性發(fā)生率，同時檢測結(jié)果直觀可判，且整個檢測過程約90min內(nèi)便可完成，更符合社區(qū)獲得性肺炎診治指南中要求的4h內(nèi)住院指導(dǎo)[14]。臨床依據(jù)病原學(xué)診斷立即采取對癥治療可使病程迅速得以控制。

綜上所述，采用LAMP技術(shù)檢測嗜肺軍團菌具備準確、快速便捷，對實驗室條件及檢驗技師的操作技能要求相對較低，易于臨床開展，尤其值得社區(qū)醫(yī)院推廣。

據(jù)任紅宇等[15]報道現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)嗜肺軍團菌超過20個種和血清型可以引起人類疾病，并不斷有新的種屬從環(huán)境中分離及被鑒定。本次研究不足之處在于未能確所設(shè)計的引物是否能檢出可引起人類軍團菌肺炎的嗜肺軍團菌所有血清型，這問題值得繼續(xù)探索研究。

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Detection of Legionella pneumophila infection in communityacquired atypical pneumonia by LAMP technique

LI Huiteng1GUO Xuguang2KE Maobin1LI Zhuohua1MO Huiling1WU Lichuan1LI Yadong1
1.Department of Clinical Laboratory,Guangdong Tongjiang Hospital,Foshan 528300;2.Department of Clinical Laboratory,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510150

ObjectiveTo investigate the feasibility of detecting the infection of Legionella pneumophila in the atypical pathogens of community acquired pneumonia by loop mediated constant temperature amplification.MethodsTwo qualified sputum specimens were collected from 195 patients with CAP in acute stage,one sputum specimen was used for isolation and culture of Legionella pneumophila,one sputum sample was stored at -80℃ for DNA extraction and detected by LAMP technique and fluorescence quantitative PCR.the sensitivity,specificity and feasibility of LAMP test method are verified.ResultsThe detection rate of Legionella pneumophila in 195 cases of sputum culture was 1.54% (3/195).The sensitivity of fluorescence quantitative PCR was 10-3/mL and the detection rate was 8.72% (17/195).The sensitivity of the LAMP method was 10-7/L,and the detection rate was 9.23%(18/195).The positive coincidence rate of both of them was 94.44% (17/18) and the negative coincidence rate of both of them was 99.44%(177/178) and the total coincidence rate of both of the two was 99.49% (194/195).ConclusionDetection of Legionella pneumophila in clinical sputum samples by LAMP technique has high specificity and sensitivity,the experimental time is about 1.5h and the operation is simple and convenient,which is more suitable for primary hospitals.

Lamp technology;Community acquired atypical pneumonia;Legionella pneumophila;Sputum culture

R563.1

A

2095-0616（2017）23-113-04

廣東省佛山市醫(yī)學(xué)類科技攻關(guān)項目（2015AB002593）。

2017-11-08）