余建瑋 洪 燕 湯志利 喻強(qiáng)強(qiáng) 葉 超

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西總隊(duì)醫(yī)院門(mén)診部，江西南昌 330006

益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機(jī)制與防御素的相關(guān)性研究

余建瑋1洪 燕2湯志利1喻強(qiáng)強(qiáng)1葉 超1

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院肺病科，江西南昌 330006；2.武警江西總隊(duì)醫(yī)院門(mén)診部，江西南昌 330006

目的研究與分析益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機(jī)制及與防御素的相關(guān)性。方法將240只SPF級(jí)雌性SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，A組（正常對(duì)照組）、B組（模型組）、C組（卡介菌多糖核酸組）、D組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)低劑量組）、E組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)中劑量組）和F組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)高劑量組），每組各40只。分別于激發(fā)2周、4周、6周及8周各檢測(cè)6組大鼠的肺組織α防御素及β防御素表達(dá)情況。結(jié)果激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織α防御素及β防御素表達(dá)持續(xù)升高，且均高于A組，C～F組的表達(dá)均低于B組，D～F組的表達(dá)低于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論支氣管哮喘大鼠的肺組織防御素表達(dá)增強(qiáng)，益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法對(duì)支氣管哮喘大鼠的防御素表達(dá)控制較好，因此在支氣管哮喘中的防治作用較好。

益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法；支氣管哮喘；肺組織；防御素

近年來(lái)，世界各地支氣管哮喘的發(fā)病率和死亡率一直較高，且呈現(xiàn)呈逐年增高的趨勢(shì)[1]，因此臨床對(duì)于支氣管哮喘的重視程度極高。與支氣管哮喘相關(guān)的研究顯示，中藥近年來(lái)的臨床效果不斷受到肯定，其中益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法的效果研究多見(jiàn)[2-3]，但是細(xì)致的防治機(jī)制及與防御素關(guān)系研究相對(duì)不足。本研究中我們就益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機(jī)制及與防御素的相關(guān)性進(jìn)行探討與分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將240只SPF級(jí)雌性SD大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，大鼠體重為200～220g。A組（正常對(duì)照組）、B組（模型組）、C組（卡介菌多糖核酸組）、D組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)低劑量組）、E組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)中劑量組）和F組（益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)高劑量組），每組各40只。

1.2 方法

1.2.1 大鼠模型制備 制備哮喘動(dòng)物模型，其中B～F組均為哮喘動(dòng)物模型組，模型各組大鼠分別于第1天腹腔注射新鮮配制的卵蛋白氫氧化鋁溶液1mL(內(nèi)含卵蛋白10mg及氫氧化鋁200mg)致敏，并于第8天重復(fù)注射1次。自第15天起予以2%OVA霧化吸入激發(fā)哮喘，每天1次，每次30min，分別持續(xù)2周、4周、6周及8周。分別于激發(fā)2周、4周、6周及8周各處死10只大鼠，每次分別處死正常大鼠、模型組大鼠、地塞米松組大鼠和蠲哮片（江中藥業(yè)股份有限公司，Z10960033）低、中、高組大鼠各5只，各組大鼠于末次霧化吸入后24h內(nèi)用1%戊巴比妥鈉（上海新亞藥業(yè)有限公司，H31021724）1.0mL腹腔注射麻醉后，將其固定于手術(shù)臺(tái)上，肺組織以液氮凍存，抽提總RNA和蛋白，用于Realtime PCR、Western blot檢測(cè)。將肺組織采用SYBR Green Realtime PCR 技術(shù)檢測(cè)靶基因檢測(cè)α-防御素[人嗜中性白細(xì)胞肽(HNP)HNP-1、HNP-2、HNP-3、HNP-4和腸源性的潘氏細(xì)胞α-防御素(HD-5、HD-6)]及β-防御素 (HBD)[HBD-1、HBD-2、HBD-3和 HBD-4]等mRNA的表達(dá)。然后比較比較上述組別不同時(shí)間的檢測(cè)結(jié)果。

表1 6組大鼠不同時(shí)間的α-防御素mRNA表達(dá)比較（± s）

表1 6組大鼠不同時(shí)間的α-防御素mRNA表達(dá)比較（± s）

注：與A組比較①P＜0.05；與B組比較②P＜0.05；與C組比較③P＜0.05

組別 HNP-1 HNP-2 HNP-3 HNP-4 HD-5 HD-6 A組 2周 0.38±0.02 0.43±0.04 0.11±0.02 0.35±0.02 0.56±0.05 0.45±0.04 4周 0.40±0.03 0.44±0.06 0.13±0.02 0.37±0.02 0.55±0.07 0.47±0.05 6周 0.37±0.02 0.42±0.05 0.12±0.03 0.38±0.03 0.53±0.06 0.44±0.06 8周 0.41±0.04 0.43±0.05 0.11±0.03 0.36±0.03 0.55±0.06 0.45±0.06 B組 2周 0.82±0.08① 0.92±0.10① 0.62±0.08① 0.71±0.06① 1.12±0.11① 0.95±0.12①4周 0.90±0.09① 1.02±0.11① 0.70±0.10① 0.84±0.07① 1.28±0.14① 1.07±0.13①6周 1.06±0.11① 1.15±0.13① 0.75±0.10① 1.01±0.09① 1.42±0.15① 1.15±0.15①8周 1.21±0.15① 1.35±0.16① 0.81±0.13① 1.18±0.013① 1.61±0.17① 1.21±0.20①C組 2周 0.70±0.06①② 0.78±0.05①② 0.46±0.05①② 0.62±0.05①② 0.84±0.08①② 0.71±0.08①②4周 0.81±0.07①② 0.88±0.07①② 0.50±0.06①② 0.73±0.05①② 0.92±0.10①② 0.82±0.10①②6周 0.90±0.09①② 0.96±0.08①② 0.53±0.06①② 0.83±0.07①② 1.02±0.11①② 0.90±0.11①②8周 0.98±0.11①② 1.06±0.12①② 0.60±0.07①② 0.90±0.10①② 1.13±0.13①② 0.99±0.13①②D組 2周 0.58±0.05①②③ 0.62±0.05①②③ 0.35±0.04①②③ 0.52±0.04①②③ 0.77±0.07①②③ 0.65±0.07①②③4周 0.65±0.06①②③ 0.70±0.06①②③ 0.37±0.05①②③ 0.56±0.05①②③ 0.84±0.08①②③ 0.73±0.08①②③6周 0.72±0.08①②③ 0.77±0.09①②③ 0.41±0.05①②③ 0.68±0.06①②③ 0.96±0.10①②③ 0.83±0.10①②③8周 0.81±0.08①②③ 0.86±0.10①②③ 0.44±0.06①②③ 0.72±0.08①②③ 1.04±0.11①②③ 0.92±0.12①②③E組 2周 0.52±0.04①②③ 0.55±0.05①②③ 0.29±0.03①②③ 0.45±0.04①②③ 0.72±0.06①②③ 0.60±0.06①②③4周 0.56±0.05①②③ 0.60±0.06①②③ 0.30±0.04①②③ 0.48±0.05①②③ 0.81±0.07①②③ 0.65±0.07①②③6周 0.63±0.06①②③ 0.68±0.07①②③ 0.32±0.04①②③ 0.55±0.06①②③ 0.93±0.10①②③ 0.73±0.08①②③8周 0.72±0.07①②③ 0.77±0.08①②③ 0.33±0.04①②③ 0.60±0.06①②③ 0.98±0.11①②③ 0.84±0.08①②③F組 2周 0.42±0.03①②③ 0.44±0.03①②③ 0.22±0.02①②③ 0.41±0.04①②③ 0.68±0.08①②③ 0.55±0.05①②③4周 0.43±0.03①②③ 0.50±0.05①②③ 0.23±0.02①②③ 0.44±0.06①②③ 0.78±0.10①②③ 0.59±0.07①②③6周 0.48±0.05①②③ 0.56±0.06①②③ 0.25±0.03①②③ 0.46±0.07①②③ 0.88±0.09①②③ 0.66±0.08①②③8周 0.62±0.05①②③ 0.66±0.07①②③ 0.26±0.04①②③ 0.52±0.08①②③ 0.92±0.09①②③ 0.76±0.07①②③

1.2.2 益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)湯制備及應(yīng)用 益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)湯的制備：將生黃芪、白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、白芍、生姜、大棗、炙甘草、仙茅、仙靈脾等10味藥按比例2：1.5：1.5：1：1：1：1：0.5：1：1.5配伍，其中白術(shù)、防風(fēng)、桂枝、白芍、生姜提取揮發(fā)油。然后取8倍量冷水浸藥半小時(shí)，第1煎1h（沸后）；第2煎加6倍量水煎40min，將兩次煎液，過(guò)濾合并濃縮，將提取物混合成合劑，分別調(diào)至含生藥2g/mL將各濃度溶液分別密封于無(wú)菌量瓶。將D組、E組及F組進(jìn)行上述藥物應(yīng)用，分別按 0.36g/kg、0.72g/kg、1.44g/kg的劑量對(duì)大鼠進(jìn)行益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)湯藥液灌服，于每天霧化吸入OVA前1h應(yīng)用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠不同時(shí)間的α-防御素表達(dá)比較

激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織α防御素表達(dá)持續(xù)升高，且B～E組均高于A組（F=6.689，7.125，7.884，6.521，5.893，8.015），C ～ F組的表達(dá)均低于B組（F=7.025，6.864，7.223，6.569，7.846，8.113），D～F組的表達(dá)低于C組（F=5.996，5.843，6.110，6.423，5.978，5.642），激發(fā) 8 周 F 組的HNP-1高于A組（t=7.963），激發(fā)6周及8周F組HNP-2及 HNP-4高于 A 組（F=8.125，7.560），激發(fā)2周、4周、6周及8周F組HNP-3、HD-5及HD-6均高于 A 組（F=7.586，6.651，7.203），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D組、E組及F組的上述指標(biāo)表達(dá)有所差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表2 6組大鼠不同時(shí)間的β-防御素表達(dá)比較（± s）

表2 6組大鼠不同時(shí)間的β-防御素表達(dá)比較（± s）

注：與A組比較①P＜0.05；與B組比較②P＜0.05；與C組比較③P＜0.05

組別 HBD-1 HBD-2 HBD-3 HBD-4 A組 2周 0.32±0.03 0.44±0.05 0.41±0.04 0.31±0.04 4周 0.33±0.02 0.42±0.06 0.43±0.05 0.33±0.04 6周 0.35±0.04 0.43±0.07 0.39±0.05 0.32±0.05 8周 0.33±0.03 0.44±0.06 0.40±0.04 0.30±0.05 B組 2周 0.81±0.08① 0.95±0.10① 0.85±0.08① 0.78±0.10①4周 0.95±0.10① 1.12±0.13① 0.99±0.10① 0.95±0.13①6周 1.02±0.12① 1.19±0.16① 1.11±0.12① 1.02±0.15①8周 1.12±0.13① 1.23±0.18① 1.18±0.15① 1.06±0.15①C組 2周 0.65±0.07①② 0.71±0.07①② 0.66±0.07①② 0.60±0.06①②4周 0.72±0.08①② 0.82±0.09①② 0.75±0.09①② 0.70±0.08①②6周 0.80±0.10①② 0.91±0.10①② 0.82±0.11①② 0.81±0.09①②8周 0.89±0.11①② 0.96±0.12①② 0.92±0.12①② 0.86±0.11①②D組 2周 0.51±0.05①②③ 0.58±0.06①②③ 0.52±0.05①②③ 0.43±0.05①②③4周 0.56±0.06①②③ 0.58±0.08①②③ 0.56±0.05①②③ 0.46±0.06①②③6周 0.60±0.08①②③ 0.63±0.09①②③ 0.61±0.07①②③ 0.52±0.08①②③8周 0.63±0.08①②③ 0.72±0.11①②③ 0.66±0.07①②③ 0.58±0.08①②③E組 2周 0.48±0.04①②③ 0.56±0.05①②③ 0.50±0.04①②③ 0.42±0.05①②③4周 0.51±0.05①②③ 0.52±0.05①②③ 0.51±0.05①②③ 0.43±0.05①②③6周 0.56±0.06①②③ 0.56±0.07①②③ 0.57±0.05①②③ 0.47±0.06①②③8周 0.59±0.07①②③ 0.63±0.08①②③ 0.59±0.06①②③ 0.53±0.07①②③F組 2周 0.45±0.03①②③ 0.46±0.04①②③ 0.46±0.05①②③ 0.35±0.04①②③4周 0.48±0.05①②③ 0.50±0.05①②③ 0.48±0.06①②③ 0.41±0.05①②③6周 0.50±0.06①②③ 0.53±0.06①②③ 0.52±0.06①②③ 0.46±0.05①②③8周 0.52±0.06①②③ 0.56±0.06①②③ 0.55±0.07①②③ 0.50±0.06①②③

2.2 6組大鼠不同時(shí)間的β-防御素表達(dá)比較

激發(fā)2周、4周、6周及8周B～F組的肺組織β防御素表達(dá)持續(xù)升高，且B～E組均高于A組（F=7.968，8.045，8.456，9.023），C ～ F 組的表達(dá)均低于 B 組（F=6.432，7.793，7.820，8.015），D ～ F組的表達(dá)低于 C 組（F=6.880，8.057，7.963，7.257），激發(fā)2周、4周、6周及8周F組HBD-1均高于A組（F=8.857），激發(fā) 6周及 8周 HBD-2、HBD-3及HBD-4 高于 A 組（F=7.663，6.541，6.823），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），D組、E組及F組的上述指標(biāo)表達(dá)有所差異，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

3 討論

支氣管哮喘在臨床多見(jiàn)，而與本病相關(guān)的治療研究多見(jiàn)，且中醫(yī)、西醫(yī)的治療效果多受肯定[4-5]。近年來(lái)，臨床對(duì)于中醫(yī)的研究占比不斷升高，且研究多顯示，中醫(yī)治療效果較好，中醫(yī)主要為通過(guò)調(diào)節(jié)患者全身的綜合機(jī)能狀態(tài)為目標(biāo)，通過(guò)治療達(dá)到增強(qiáng)體質(zhì)，防御疾病的能力，因此在減少哮喘的發(fā)作甚至達(dá)到長(zhǎng)期緩解等方面成為治療干預(yù)的重點(diǎn)[6-7]。益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法是根據(jù)哮喘反復(fù)發(fā)作的內(nèi)因制定的治療方案，其從患者“氣陽(yáng)虛弱、衛(wèi)氣不固”及“衛(wèi)氣根于下焦，滋養(yǎng)于中焦，宣發(fā)于上焦”等特點(diǎn)進(jìn)行治療方案的制定與實(shí)施，從調(diào)補(bǔ)肺、脾、腎三臟之氣陽(yáng)虛弱入手來(lái)達(dá)到調(diào)理機(jī)體的目的，從而實(shí)現(xiàn)提升呼吸道防御能力及免疫調(diào)節(jié)的作用。近年來(lái)臨床可見(jiàn)益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法治療支氣管哮喘的療效[8-9]，但是對(duì)于其對(duì)哮喘細(xì)致的影響研究不足。

防御素是臨床中有效的抗菌殺菌物質(zhì)，且在介導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中均有較強(qiáng)的作用，具有較高的穩(wěn)態(tài)維持作用[10-11]，有研究認(rèn)為在支氣管哮喘中呈現(xiàn)顯著異常的表達(dá)，在幼稚樹(shù)突狀細(xì)胞趨化及炎癥聚集等方面均有反應(yīng)意義，同時(shí)在肺損傷中具有反應(yīng)價(jià)值[12-13]，因此其在支氣管哮喘患者中的變化及藥物對(duì)其影響的研究意義較高。

本研究就益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法防治支氣管哮喘作用機(jī)制及與防御素的相關(guān)性進(jìn)行觀察分析，結(jié)果顯示，支氣管哮喘大鼠的肺組織α-防御素及β-防御素均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且隨著激發(fā)時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)水平升高，均高于健康大鼠，同時(shí)益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法治療大鼠的表達(dá)水平低于卡介菌多糖核酸干預(yù)大鼠，說(shuō)明益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法在支氣管哮喘大鼠中的調(diào)節(jié)治療作用更好，而隨著益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)湯劑量的加大，其表達(dá)水平雖有下降，但是不顯著，因此認(rèn)為在藥物應(yīng)用劑量方面應(yīng)進(jìn)一步給予重視與研究。分析研究結(jié)果，我們認(rèn)為益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法的應(yīng)用使肺宣發(fā)肅降功能、脾之運(yùn)化水濕功能、腎之蒸化水液功能均得到有效調(diào)節(jié)與改善，因此哮喘的控制作用得以凸顯[14-15]，而益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法通過(guò)改善機(jī)體的陽(yáng)氣虛弱及衛(wèi)氣不固等方面來(lái)達(dá)到實(shí)現(xiàn)防控慢性肺系病發(fā)病的作用，而其在放空的過(guò)程中有效激發(fā)了機(jī)體的自我防御機(jī)制，其中肺組織α-防御素及β-防御素表達(dá)增強(qiáng)，因此肺部保護(hù)作用凸顯，在降低炎性因素對(duì)呼吸系統(tǒng)的損傷的基礎(chǔ)上，對(duì)其修復(fù)作用也有促進(jìn)作用，因此應(yīng)用效果突出。

綜上所述，本研究認(rèn)為支氣管哮喘大鼠的肺組織防御素表達(dá)增強(qiáng)，益氣溫陽(yáng)護(hù)衛(wèi)法對(duì)支氣管哮喘大鼠的防御素表達(dá)控制較好，因此在支氣管哮喘中的防治作用較好。

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Study on the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin

YU Jianwei1HONG Yan2TANG Zhikli1YU Qiangqiang1YE Chao1
1.Lung Disease Department,the Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangxi Provinical Corps Hospitial,Chinese People’s Armed Police Forces,Nanchang 330006,China

ObjectiveTo study and analyze the action mechanism of Yiqi Wenyang Huwei method in the prevention and treatment of bronchial asthma and correlation with defensin.Methods240 female SD rats of grade SPF were divided into six groups,group A（normal control group）,group B（model group）,group C（BCG Polysaccharide and Nucleic Acid group）,group D（low dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,group E（middle dose of Yiqi Wenyang Huwei group）and group F（high dose of Yiqi Wenyang Huwei group）,with 40 cases in each group according to the method of random number table.Then the expression situation of lung tissue α-defensins and β-defensins of six groups at second,forth,sixth and eighth week of provocation were detected.ResultsThe expression of lung tissue α-defensins and β-defensins of group B to group F at second,forth,sixth and eighth week of provocation were continuously increased,and they were all higher than those of group A,the expression of group C to group F were all lower than those of group B,the expression of group D to group F were lower than those of group C,there were all significant differences(P＜0.05).ConclusionThe lung tissue α-defensins expression of rats with bronchial asthma are intensive,so its prevention and treatment effect in the bronchial asthma is better.

Yiqi Wenyang Huwei method;Bronchial asthma;Lung tissue;Defensin

R259

A

2095-0616（2017）23-34-04

國(guó)家自然科學(xué)基金（81560767）；江西省自然科學(xué)基金（20132BAB215035）。

2017-10-30）