周 強(qiáng) 宋宇峰 馮紅超

1.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院口腔科，廣東清遠(yuǎn) 511518；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，貴州貴陽(yáng) 550004；3.貴州省貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院頜面外科，貴州貴陽(yáng) 550002

酸性微環(huán)境對(duì)舌鱗癌中單核/巨噬細(xì)胞表型影響的實(shí)驗(yàn)研究

周 強(qiáng)1宋宇峰2馮紅超3

1.廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院口腔科，廣東清遠(yuǎn) 511518；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，貴州貴陽(yáng) 550004；3.貴州省貴陽(yáng)市口腔醫(yī)院頜面外科，貴州貴陽(yáng) 550002

目的以舌鱗癌為研究對(duì)象，研究探討腫瘤組織酸性微環(huán)境對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的表型變化和功能的影響。方法采用密度梯度離心法從健康人的外周血分離單核/巨噬細(xì)胞；從中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買人舌鱗癌細(xì)胞株（Tca-8113），將兩種細(xì)胞分別在酸性微環(huán)境（pH6.5/6.8/7.0）和常規(guī)環(huán)境下（pH7.2）單獨(dú)及混合培養(yǎng)，以常規(guī)環(huán)境下培養(yǎng)作為對(duì)照，4h后ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Arg和iNOS的水平變化。結(jié)果在酸性微環(huán)境下，單核/巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和與舌鱗癌細(xì)胞混合培養(yǎng)的iNOS分泌明顯減少和Arg分泌明顯增加，均高于常規(guī)環(huán)境下單核/巨噬細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)和與舌鱗癌細(xì)胞混合培養(yǎng)，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在酸性微環(huán)境及常規(guī)環(huán)境中，舌鱗癌細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)上清液中，Arg和iNOS無(wú)明顯變化，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論舌鱗癌酸性微環(huán)境中單核/巨噬細(xì)胞的表型偏向于M2型，即單核/巨噬細(xì)胞在舌癌酸性環(huán)境中可能通過自身表型的變化，分泌細(xì)胞因子下調(diào)免疫應(yīng)答，參與了腫瘤的的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移等。

單核/巨噬細(xì)胞；口腔鱗狀細(xì)胞癌；酸性微環(huán)境；表型鑒定

研究表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（tumor-associated macrophages，TAMs）參與了腫瘤發(fā)生、生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移的過程，活化的巨噬細(xì)胞在免疫應(yīng)答中也發(fā)揮重要作用[1]。舌鱗癌是發(fā)生在口腔黏膜的最常見的惡性腫瘤，浸潤(rùn)于其中的巨噬細(xì)胞，在體內(nèi)外不同的微環(huán)境影響下，表現(xiàn)出明顯的功能差異[2-3]。本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬舌鱗癌組織中的酸性微環(huán)境及正常環(huán)境，檢測(cè)其中Arg和iNos的水平變化來研究腫瘤組織酸性微環(huán)境對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的表型變化和功能的影響。

1 材料與方法

1.1 一般材料

主要試劑：人淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝陽(yáng)生物制品科技有限責(zé)任公司）；2%明膠溶液；5mmol/L EDTA；人iNOS及Arg ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司產(chǎn)品）；鼠抗人CD14單克隆抗體（上海雷浩）、PBS液（武漢博士德公司）；Hanks液，臺(tái)盤蘭染色液、25mL培養(yǎng)瓶；雙抗（青霉素100μg/mL，鏈霉素100μg/mL）；重組人粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子rhGM-CSF（peprotech公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM培養(yǎng)液；胰酶等。

主要設(shè)備：蘇凈超凈工作臺(tái)、流式細(xì)胞儀（FACS）、恒溫培養(yǎng)箱、低溫臺(tái)式水平離心機(jī)、Nikon倒置顯微鏡、酶標(biāo)儀（美國(guó)通用公司）、5%CO2培養(yǎng)箱、PB203-N電子天平、水式恒溫箱、烤箱等。細(xì)胞：人舌鱗癌細(xì)胞株Tca-8113（購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），健康人新鮮外周抗凝血。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外周血單核/巨噬細(xì)胞的提取 （1）采用梯度密度離心法，抽取人抗凝外周血50mL，用3～4倍hanks液稀釋并混勻；（2）取16個(gè)15mL離心管，每管加入人淋巴細(xì)胞分離液5mL。將稀釋的血液9mL輕輕加到裝有人淋巴細(xì)胞分離液的離心管上，注意不要破壞兩者之間的界面；（3）低溫水平離心機(jī)20℃，390g，離心20min可見在血漿與淋巴細(xì)胞分離液之間有一圈環(huán)形的白膜層（如下圖），此為大量的單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。將各管白膜層吸出至另外一試管；（4）將吸取的白膜層，用5倍的PBS液稀釋，390g，離心10min洗去多余的淋巴細(xì)胞分離液；（5）再用 PBS液稀釋，800r/min，離心 10min，重復(fù)兩次，盡量洗去血小板；（6）用含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞混懸，置六孔板中37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育貼壁3h后，用預(yù)熱的細(xì)胞培養(yǎng)液洗去未粘附細(xì)胞，懸浮細(xì)胞可重復(fù)粘附，得到更多的貼壁細(xì)胞。（7）加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液約2mL及rhGM-CSF（終濃度為1000U/mL），隔兩天半換液，培養(yǎng)7d得到貼壁細(xì)胞。

1.2.2 單核/巨噬細(xì)胞的鑒定 用抗CD14單克隆抗體分析懸液中的細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞定義為CD14陽(yáng)性細(xì)胞：（1）取上述培養(yǎng)的單核/巨噬細(xì)胞懸液，1000rpm離心5min。棄掉上清，加入2mmol/L EDTA（以減少分析中細(xì)胞的粘附）；（2）取上述細(xì)胞懸液100μL加入5mL流式管底；（3）取10μL CD14標(biāo)記抗體加入流式管底與細(xì)胞懸液混勻，室溫避光孵育30min；（4）加入2mL PBS重懸細(xì)胞，以1000rpm離心5min，棄掉上清。上流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)。結(jié)果CD14陽(yáng)細(xì)胞占87.7%，足以滿足實(shí)驗(yàn)需要。

1.2.3 人舌鱗癌細(xì)胞懸液的制備 將所購(gòu)凍存的Tca-8113細(xì)胞復(fù)蘇，加入pH為7.2的20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液3mL在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代獲得大量口腔癌細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，加入3～5滴0.25%EDTA胰酶放入37℃培養(yǎng)箱中1～3min，見貼壁細(xì)胞脫落，細(xì)胞由貼壁梭形變成橢圓形，以5mL 20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中和并混勻，1500轉(zhuǎn)/離心5min，留取沉淀細(xì)胞，20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/mL。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組并在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) A組：每孔加入重懸的單核/巨噬細(xì)胞1mL（細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL）及相應(yīng)PH值細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，使每孔單核/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞濃度為 0.5×106個(gè) /mL，在 pH 值 為 6.5、6.8、7.0、7.2 下進(jìn)行培養(yǎng)。B組：每孔加入重懸的舌鱗癌細(xì)胞1mL（細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL）及相應(yīng)pH值細(xì)胞培養(yǎng)液1mL，使每孔舌癌細(xì)胞的細(xì)胞濃度為0.5×106個(gè)/mL，在pH值為 6.5、6.8、7.0、7.2下進(jìn)行培養(yǎng)。C組：每孔加入重懸單核巨噬細(xì)胞1mL（細(xì)胞濃度為106個(gè)/mL）和舌鱗癌細(xì)胞1mL（細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL），使每孔單核/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞濃度為0.5×106個(gè)/mL，在pH值為6.5、6.8、7.0、7.2下混合培養(yǎng)。以上樣本放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，離心收集上清液，采用ELISA法檢測(cè)iNOS和Arg的含量。

1.2.5 ELISA法測(cè)定上清液中的iNOS的水平變化 采用人iNOS的ELISA試劑盒進(jìn)行，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。具體操作步驟如下：（1）標(biāo)準(zhǔn)濃度配制：40ng/瓶標(biāo)準(zhǔn)品中，加入1mL已高壓消毒過的去離子水，混勻，配成濃度40ng/mL的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管，第一管加入900μL標(biāo)本稀釋液，第二至第八管加入標(biāo)本稀釋液500μL再在第1管中加入100μL 40ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混勻后用加樣器吸出吸出500μL，移至第2管中，再次混勻，如此反復(fù)做對(duì)倍稀釋，到第7管中吸出500μL棄去，第8管為空白對(duì)照；（2）10X標(biāo)本稀釋液用去離子水作1：10倍稀釋；（3）洗滌液：用去離子水1：20稀釋；（4）加樣：每孔各加入待測(cè)樣品100μL；每例檢測(cè)樣品設(shè)6個(gè)復(fù)孔。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃ 120min；（5）洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干；（6）每孔加入第一抗體工作液100μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60min；（7）洗板：同前；（8）每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL；將反應(yīng)板充分混勻后置37℃30min；（9）洗板：同前；（10）每孔加入底物工作液100μL，置37℃暗處反應(yīng)15min；（11）每孔加入100μL終止液混勻；（12）30min內(nèi)在波長(zhǎng)450nm處測(cè)吸光值。

1.2.6 ELISA法測(cè)定上清液中的Arg的水平變化 收集細(xì)胞培養(yǎng)上清標(biāo)本稀釋液做1∶10稀釋，配制標(biāo)準(zhǔn)濃度，10X標(biāo)本稀釋液以及洗滌液，常規(guī)加樣，洗板，每孔加入第一抗體工作液100μL，充分混勻，37℃靜置1h，再次洗板，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100μL，充分混勻，37℃靜置1h，再次洗板，每孔加入底物工作液100μL，37℃暗處?kù)o置15min，每孔加入100μL終止液混勻，在30min內(nèi)在波長(zhǎng)450mm處檢測(cè)吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。培養(yǎng)上清液中的iNOS和Arg含量以（）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取的單核/巨噬細(xì)胞流式細(xì)胞

分離的單核/巨噬細(xì)胞，重復(fù)四次，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定CD14陽(yáng)性為87.7%，滿足實(shí)驗(yàn)需要，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)單核/巨噬細(xì)胞比例

2.2 人舌鱗癌細(xì)Tca-8113

舌癌細(xì)胞經(jīng)過復(fù)蘇，傳代3次后置于倒置顯微鏡下觀察，見Tca-8113細(xì)胞多角形，體積大，長(zhǎng)滿時(shí)呈鋪路石狀，細(xì)胞核大或雙核，幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，核漿比例增大，見圖2。

2.3 ELISA法檢測(cè)iNOS的含量

根據(jù)酶標(biāo)儀軟件計(jì)算出各例標(biāo)本iNOS含量均值，其中混合組各個(gè)pH值所測(cè)含量均大于單核/巨噬細(xì)胞和舌癌細(xì)胞組含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1、圖3。

圖2 培養(yǎng)的舌癌細(xì)胞

表1 不同pH值下細(xì)胞培養(yǎng)液中的NOS含量（± s，pg/mL）

表1 不同pH值下細(xì)胞培養(yǎng)液中的NOS含量（± s，pg/mL）

注：Mф代表單核/巨噬細(xì)胞培養(yǎng)組，Tca-8113代表人舌鱗癌細(xì)胞培養(yǎng)組，Mф+Tca-8113為混合培養(yǎng)組

pH值 Mф Tca-8113 Mф+Tca-8113 7.2 81.53±11.40 19.62±1.57 93.87±5.51 7.0 67.60±4.59 17.56±2.77 89.10±7.10 t 11.335 6.470 5.308 P 0.000 0.000 0.000 7.2 81.53±11.40 19.62±1.57 93.87±5.51 6.8 59.95±2.67 16.94±4.09 83.90±4.25 t 18.431 6.117 14.328 P 0.000 0.000 0.000 7.2 81.53±11.40 19.62±1.57 93.87±5.51 6.5 50.26±6.94 16.48±3.16 65.52±6.87 t 23.430 8.899 32.192 P 0.000 0.000 0.000

圖3 不同pH值下細(xì)胞培養(yǎng)液中的iNOS的平均含量

2.4 ELISA法檢測(cè)Arg的含量

根據(jù)酶標(biāo)儀軟件計(jì)算出各例標(biāo)本Arg含量均值，其中混合組各個(gè)pH值所測(cè)含量均大于單核/巨噬細(xì)胞和舌癌細(xì)胞組含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 ELLISA檢測(cè)不同pH值下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Arg的表達(dá)水平（± s，pg/mL）

表2 ELLISA檢測(cè)不同pH值下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的Arg的表達(dá)水平（± s，pg/mL）

pH值 Mф Tca-8113 Mф+Tca-8113 7.2 40.26±8.52 31.96±1.59 75.08±7.07 7.0 52.44±9.28 30.19±3.27 82.37±5.64 t 9.668 4.868 8.061 P 0.000 0.000 0.000 7.2 40.26±8.52 31.96±1.59 75.08±7.07 6.8 65.80±7.62 30.04±2.53 86.33±3.72 t 22.344 6.425 14.082 P 0.000 0.000 0.000 7.2 40.26±8.52 31.96±1.59 75.08±7.07 6.5 73.06±3.91 29.55±4.06 93.27±3.51 t 34.989 5.539 23.045 P 0.000 0.000 0.000

3 討論

腫瘤是當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)及難點(diǎn)之一。其中口腔鱗狀細(xì)胞癌占口腔頜面部惡性腫瘤的90%以上，是發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤之一[4-7]。有資料表明，由于腫瘤細(xì)胞無(wú)限增殖，需要不停地塑造一個(gè)適于自己生長(zhǎng)的外部組織環(huán)境，但是腫瘤細(xì)胞塑造的外部組織環(huán)境永遠(yuǎn)滿足不了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的需要，所以出現(xiàn)組織缺氧和酸中毒、間質(zhì)高壓形成、大量生長(zhǎng)因子和蛋白水解酶的產(chǎn)生及免疫炎性反應(yīng)等[8-10]。隨著腫瘤進(jìn)展，局部的營(yíng)養(yǎng)條件已不能滿足腫瘤生長(zhǎng)的需求，這時(shí)腫瘤細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)血管、淋巴管生成等途徑不斷構(gòu)建新的營(yíng)養(yǎng)代謝網(wǎng)路，同時(shí)也促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[4]。

巨噬細(xì)胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在清除衰老和感染細(xì)胞、機(jī)體損傷后的組織重塑中起重要作用[11-13]。在機(jī)體不同生理和疾病狀態(tài)下，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出不同的類型，通過表型分析鑒定巨噬細(xì)胞類型已成為研究巨噬細(xì)胞功能多樣性的主要方法[14-17]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)： IL-12的分泌、iNOS表達(dá)和活性以及膜蛋白CD16/32的表達(dá)可用于鑒定M1型巨噬細(xì)胞；而Arg-1表達(dá)和活性、CD206以及DECTIN-1的表達(dá)，是鑒定M2型巨噬細(xì)胞較為理想的表型指標(biāo)[18-19]。

綜上所述，此次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腫瘤酸性環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）傾向于M2型。即單核/巨噬細(xì)胞在舌癌酸性環(huán)境中M1型表達(dá)減弱，M2型表達(dá)增強(qiáng)。此消彼長(zhǎng)使得TAMs下調(diào)免疫應(yīng)答，更多參與了腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移。作為巨噬細(xì)胞極化的重要標(biāo)志，精氨酸酶Ⅰ和iNOS相互競(jìng)爭(zhēng)底物精氨酸，產(chǎn)生不同代謝物并對(duì)巨噬細(xì)胞的功能起著重要作用。不同的細(xì)胞因子通過其特異受體可激活不同的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子，從而決定巨噬細(xì)胞的極化方向和功能。若巨噬細(xì)胞通過一系列信號(hào)通路活化M1相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，激活M1相關(guān)基因表達(dá)，則向M1型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化。對(duì)于M1型巨噬細(xì)胞的重要標(biāo)志之一iNOS來說，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB及STATl結(jié)合并激活iNOS的啟動(dòng)子區(qū)是調(diào)控其表達(dá)的關(guān)鍵步驟。若巨噬細(xì)胞通過一系列信號(hào)通路激活了M2相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，則向M2型巨噬細(xì)胞活化，而其重要的標(biāo)志之一精氨酸酶I則主要受STAT6和c/EBPβ調(diào)控。此次實(shí)驗(yàn)只是從體外模擬了舌鱗癌微環(huán)境中酸性的方面，腫瘤微環(huán)境是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，機(jī)制復(fù)雜，有待于我們更多的探討。

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Effect of acidic microenvironment on the phenotype of monocyte/ macrophage in tongue squamous cell carcinoma

ZHOU Qiang1SONG Yufeng2FENG Hongchao3
1.Department of Stomatology, Qingyuan People's Hospital, Qingyuan 511518,China; 2.Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004; 3. Maxillofacial Surgery, Stomatological Hospital of Guiyang City,Guiyang 550002, China

ObjectiveTo investigate the effect of acidic microenvironment on the phenotype and function of monocytes/macrophages in tongue squamous cell carcinoma(NPC).MethodsMononuclear cells/macrophages were isolated from peripheral blood of healthy subjects by density gradient centrifugation; Human tongue squamous cell carcinoma cell line(Tca-8113) were purchased from cell bank of Chinese Academy of Sciences. The two kinds of cells were cultured separately in acid microenvironment(pH 6.5/6.8/7.0) and conventional environment(pH 7.2). The changes of Arg and iNOS in the supernatant of the cultured cells were detected by ELISA after 4H.ResultsIn acidic microenvironment, the secretion of iNOS was significantly decreased and the secretion of Arg was increased significantly in monocytes/macrophages cultured alone and iNOS culture mixed with squamous cell carcinoma of the tongue, they were Higher than those in the conventional environment(P＜0.05), there were significant difference between two groups; In acidic microenvironment and conventional environment, Arg and iNOS in the supernatant of tongue squamous cell carcinoma cells were not significantly changed(P＞0.05), and there was no significant difference between them.Conclusionthe phenotype of monocytes/macrophages in the acidic microenvironment of tongue squamous cell carcinoma tends to be type M2, that is, monocytes/macrophages may secrete cytokines in the acidic environment of tongue squamous cell carcinoma, which may downregulate the immune response and participate in the growth, invasion and metastasis of tumor.

Monocyte/macrophage; Oral squamous cell carcinoma; Acidic microenvironment; Phenotype identification

R739.8

A

2095-0616（2017）23-29-05

2017-08-14）