邱昌恩，王衛(wèi)東

(湖北師范大學 生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心，湖北 黃石 435002)

過氧化氫對銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)生長及生理特性的影響

邱昌恩，王衛(wèi)東

(湖北師范大學 生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心，湖北 黃石 435002)

以銅綠微囊藻為實驗材料，研究H2O2對其生長及生理特性的影響。結果顯示，藻細胞密度與645nm波長處吸光值成正比關系，回歸方程為y=957.32x-12.12，R2=0.989；在實驗濃度范圍內，隨H2O2濃度上升，銅綠微囊藻細胞中丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)以及過氧化氫酶(CAT)活性逐漸升高；H2O2對銅綠微囊藻72h半效致死濃度為0.0417m mol/L.

H2O2；銅綠微囊藻；EC50；生長；生理特性

0 前言

近年來水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴重，人們對于水華的關注和研究甚多?，F(xiàn)有文獻中關于水華的定義較為詳細的說法有：藻類是水體生態(tài)系統(tǒng)的正常組成部分，但其過度生長可能帶來問題。藻類水華主要是由營養(yǎng)過剩引起的，特別是磷和氮[1]。水華發(fā)生是多種因素共同作用的結果，這些因素包括：①水體中豐富的N、P營養(yǎng)物質，BOD及其他微量元素；②適宜的溫度和光照；③適宜的水文地理條件,如緩慢的水流等。由于湖泊、水庫水體生態(tài)系統(tǒng)相對容易滿足上述條件(特別是水流條件)，因此湖、庫水體發(fā)生“水華”現(xiàn)象遠多于河流[2]。在淡水中可能產(chǎn)生水華的藻類有藍藻門的微囊藻屬、魚腥藻屬、束絲藻屬、膠刺藻屬等，除此之外，還有綠藻門和硅藻門的一些種類[3]。如滇池、太湖藍藻水華爆發(fā)導致生活用水污染，類似情況多有發(fā)生。因此，必須高度重視藍藻水華，深入了解其危害并徹底清除藍藻水華。藍藻水華導致的危害主要有：①水體中溶氧降低；②抑制其他藻類生長；③影響魚類生長從而影響水體養(yǎng)殖；④產(chǎn)生藍藻毒素影響水質；⑤水體生態(tài)系統(tǒng)失衡；⑥影響供水；⑦影響旅游業(yè)[4]。

藍藻水華防治措施包括化學法、物理法、生物法、水力學法和聯(lián)用法[5]。最常用的是化學藥劑法，其原理是金屬離子抑制藻類的正常代謝，還可通過絮凝作用沉降藍藻。采用化學試劑雖然能快速殺滅藍藻，但也有其弊端，如容易破壞水體功能，而且會對藍藻之外的有益藻產(chǎn)生影響，最重要的是不能徹底根除藍藻水華。物理方法如調水稀釋、曝氣、藍藻打撈、粘土絮凝等可以有效減少氮磷含量，改善水體，從而治理藍藻水華，但物理方法對于大水面實施困難，而且耗費大量的人力、物力、財力，有些方法還可能會造成二次污染。水體中釋放的藻毒素也可通過活性炭吸附法去除。生物法包括使用溶藻微生物、高等植物、及放養(yǎng)濾食性魚類鰱、鳙等可以有效治理藍藻水華。

過氧化氫，其水溶液成為雙氧水，氧化性強，安全易得，且其分解產(chǎn)物為水和氧氣，不會產(chǎn)生新的污染物，是一種重要的綠色化學試劑[6]。過氧化氫還是一種活性氧(ROS)物質，不僅會影響植物的光合作用，還會使某些基因表達發(fā)生紊亂，并且會使生物體細胞發(fā)生膜脂過氧化作用，對細胞產(chǎn)生損傷，從而影響生物體的正常生長和繁殖，因此，過氧化氫能夠有效殺死藻細胞，是一種潛在的除藻劑。銅綠微囊藻屬于藍藻門、色球藻科、色球藻目、微囊藻屬，廣泛分布于有機質豐富的湖泊、池塘等水體中，是富營養(yǎng)化水體中形成藍藻水華的一種優(yōu)勢藻類[7]。本研究以銅綠微囊藻為實驗材料，研究不同濃度的過氧化氫處理對藻細胞數(shù)量和生理生化指標的影響，以探討過氧化氫對藻細胞的生長抑制及氧化損傷效應，為過氧化氫除藻機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和藻種培養(yǎng)

實驗所用銅綠微囊藻FACHB-905藻種取自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB collection)。本實驗以藻類常用BG-11 液體培養(yǎng)基為培養(yǎng)介質來培養(yǎng)藻種，藻種接于150mL錐形瓶中(內含100mLBG-11液體培養(yǎng)基)并置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度設為25℃，光暗周期12h:12h，光照強度為30～50u mol.m-2.s-1，培養(yǎng)期間每天定時搖動錐形瓶3～4次。

1.2 實驗方法

1.2.1 繪制標準曲線

取處于對數(shù)生長期的銅綠微囊藻，接種5mL藻液至100mLBG-11液體培養(yǎng)基中，置于光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同藻種培養(yǎng)條件，連續(xù)培養(yǎng)18d. 每3d用紫外分光光度計測量一次藻在645nm波長處的吸光值并用血球計數(shù)方法測定藻細胞密度[8,9]，將所得結果通過EXCEL軟件繪制銅綠微囊藻的生長曲線，確定藻細胞濃度與OD值之間的回歸方程。

1.2.2 確定半效致死濃度(EC50)

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的銅綠微囊藻，接種4mL藻液至100mLBG-11液體培養(yǎng)基中，必須有明顯綠色，向藻液中加入不同濃度的H2O2.銅綠微囊藻中H2O2的濃度梯度設置為0.000176m mol/L，0.000704m mol/L，0.00282m mol/L，0.0113m mol/L，0.0451m mol/L；另有空白比色組(只加100mLlBG11培養(yǎng)基)和對照組(只含培養(yǎng)基和銅綠微囊藻)。每組設3個平行，連續(xù)培養(yǎng)10d，每48h測量OD645，從第0 d開始測量。通過計算各濃度抑藻百分數(shù)，找出H2O2對銅綠微囊藻的半效致死濃度范圍[10]。

1.2.3 MDA含量以及SOD、CAT、POD活性的測定

不同濃度H2O2處理銅綠微囊藻第六天，測藻體內MDA含量以及SOD、POD、CAT活性，丙二醛含量以及SOD、POD、CAT活力測定方法參見文獻[11]。

2 結果與分析

2.1 藻細胞密度與吸光值的關系

圖1 銅綠微囊藻細胞密度與吸光值關系

圖2 H2O2對銅綠微囊藻的抑制率

銅綠微囊藻細胞密度與吸光值之間的關系見圖1，回歸方程為y=957.32x-12.12(y:銅綠微囊藻細胞個數(shù)，單位：104個；x：645nm波長下的吸光值)。相關系數(shù)R2=0.989，表明銅綠微囊藻細胞密度與吸光值的關系可信度較高，可以當作以后實驗計算銅綠微囊藻細胞密度的計算公式。

2.2 EC50測定結果

H2O2對銅綠微囊藻的抑制率實驗結果如圖2所示，表明在0.000176～0.000704m mol/L濃度范圍內，H2O2對銅綠微囊藻的生長起促進作用。0.00282～0.0451m mol/L濃度范圍內，H2O2對銅綠微囊藻的生長起抑制作用，并且隨著H2O2濃度的增加，抑制作用越來越強。通過計算得出H2O2對銅綠微囊藻的72h半效致死濃度為0.0417m mol/L.

2.3 H2O2對銅綠微囊藻MDA含量的影響

H2O2濃度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

H2O2濃度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

H2O2對銅綠微囊藻MDA含量的影響如圖3所示，所有經(jīng)H2O2處理的實驗組藻細胞中MDA含量均高于對照組，并且隨H2O2濃度上升銅綠微囊藻體內MDA含量逐漸升高。

2.4 H2O2對銅綠微囊藻SOD、POD、CAT活性的影響

不同濃度H2O2處理銅綠微囊藻SOD活性的變化如圖4所示，H2O2濃度在0～0.00282m mol/L之間銅綠微囊藻中SOD的活性緩慢增強，在0.00282～0.0451m mol/L之間銅綠微囊藻中SOD的活性迅速增強。整體來看，隨著H2O2濃度的增加，銅綠微囊藻中SOD的活性逐漸增強。

不同濃度H2O2處理銅綠微囊藻POD活性的變化如圖5所示，銅綠微囊藻中的POD活性較高，加入H2O2后，POD的活性進一步增強。在0.000176～0.0451m mol/L間，隨著H2O2濃度的增加，銅綠微囊藻中POD的活性逐漸增強。

不同濃度H2O2處理銅綠微囊藻CAT活性的變化如圖6所示，隨著H2O2濃度增大，銅綠微囊藻中CAT的活性逐漸增強。H2O2濃度在0.000704～0.00282 m mol/L間，銅綠微囊藻中CAT的活性有個陡增的過程。

H2O2濃度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

H2O2濃度/Concentration of H2O2/(m mol/L)

3 討論

3.1 H2O2對藻細胞生長的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理藻液后，會對銅綠微囊藻藻細胞產(chǎn)生嚴重的損傷效應，從而對銅綠微囊藻的生長產(chǎn)生抑制作用，因此，可以應用H2O2來殺滅銅綠微囊藻，H2O2是一種潛在的除藻劑。不同濃度的H2O2處理藻液后，會對藻細胞產(chǎn)生不同程度的毒害作用。這是由于H2O2本身是一種ROS物質，當藻細胞受到氧化脅迫時，細胞膜脂質會發(fā)生過氧化作用而受到損傷，破壞細胞膜結構，從而對藻細胞產(chǎn)生毒害作用，當藻液中H2O2濃度越大，其毒害作用就越大。KAY S H等[12]的研究結果顯示，H2O2對水產(chǎn)養(yǎng)殖是一種潛在的除藻藥劑，建議在實際應用中，要在一定時間內達到有效抑制藻類效果，H2O2的質量分數(shù)應為0.004‰以上。本文研究結果也發(fā)現(xiàn)，H2O2對銅綠微囊藻的抑制率與H2O2的濃度成正比，并且H2O2對銅綠微囊藻的72h半效致死濃度為0.0417m mol/L.

3.2 H2O2對藻細胞生理的影響

H2O2對銅綠微囊藻的損傷效應還表現(xiàn)在對藻細胞的生理指標及抗氧化防御系統(tǒng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，H2O2處理藻液第六天，測量銅綠微囊藻藻細胞內MDA含量，在實驗的H2O2濃度范圍內，隨著H2O2濃度的增加，銅綠微囊藻藻細胞內MDA含量逐漸增加。MDA是細胞膜發(fā)生脂質過氧化的產(chǎn)物，說明H2O2使銅綠微囊藻發(fā)生了脂質過氧化，并且H2O2濃度越高，脂質過氧化作用越強，說明藻細胞的損傷效應越大。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)均是藻細胞內的抗氧化防御體系的酶，當藻細胞受到氧化損傷時，一定程度上會刺激藻細胞提高這三種酶的活性來抑制氧化損傷。本研究結果也顯示，H2O2處理銅綠微囊藻，這三種酶的活性都增大，說明這三種酶與銅綠微囊藻藻細胞抗氧化能力密切相關。

本研究中，銅綠微囊藻在H2O2的脅迫生長過程中，藻細胞內三種保護酶SOD、CAT、POD的活性均發(fā)生了變化，丙二醛的含量也發(fā)生了相應的改變。在這三種酶活性測定以及丙二醛MDA含量的測定中，結果顯示經(jīng)過過氧化氫處理后藻細胞對其有一定的抗逆性，藻體內會自行產(chǎn)生一些防御機制。

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TheeffectsofH2O2onthegrowthandphysiologicalcharacteristicsofMicrocystisaeruginosa

QIU Chang-en，WANG Wei-dong

(College of Life Sciences, National Demonstration Center for Experimental Biology Education, Hubei Normal University, Huangshi 435002, China)

The effects of H2O2on the growth and physiological characteristics ofMicrocystisaeruginosawere studied. The results showed that the density of algal cells was proportional to the absorbance at the wavelength of 645nm. The regression equation wasy=957.32x-12.12andR2=0.989. In the experimental concentration range, with the increase of H2O2concentration, the contents of malondialdehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) inMicrocystisaeruginosawere increased gradually. The 72h EC50 of H2O2onMicrocystisaeruginosawas 0.0417m mol/L.

hydrogen perioxide;Microcystisaeruginosa; EC50; growth; physiological characteristics

Q17

A

2096-3149(2017)04- 0001-05

10.3969/j.issn.2096-3149.2017.04.001

2017—03—15

邱昌恩(1966— )，男，湖北鄂州市人，博士，教授，研究方向為藻類生物技術和環(huán)境科學.