茹艷艷,謝淑娜，李保葉，孫 靜，劉佳中，郝俊杰

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

Fusariumgraminearumsensustricto和F.asiaticum3種分子鑒定方法的比較

茹艷艷,謝淑娜，李保葉，孫 靜，劉佳中，郝俊杰*

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部華北南部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南省農(nóng)作物病蟲害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

Fusariumgraminearumsensu stricto和F.asiaticum是中國(guó)主要的禾谷鐮刀菌復(fù)合種(FGSC)成員，為了提高這2個(gè)種的鑒定效率，選取48個(gè)引起小麥赤霉病和玉米莖腐病的FGSC菌株，比較了系統(tǒng)發(fā)育譜系分析、PCR-RFLP(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)和多重PCR 3種分子鑒定方法。系統(tǒng)發(fā)育譜系分析首先擴(kuò)增菌株的EF-1α和Tri101兩個(gè)基因的部分序列，測(cè)序之后利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，有11個(gè)菌株與F.asiaticum聚在一起，37個(gè)菌株與F.graminearumsensu stricto聚為一枝，此法繁瑣、復(fù)雜、成本高，但鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。PCR-RFLP基于組蛋白H3基因特殊的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物H3dStyⅠ/H3R1，通過PCR和酶切反應(yīng)進(jìn)行鑒定，電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有11個(gè)菌株為F.asiaticum，37個(gè)菌株為F.graminearumsensu stricto，該法工作量大且對(duì)操作過程要求高。多重PCR基于CYP51A基因設(shè)計(jì)特異引物FaF/FaR和FgF/FgR進(jìn)行鑒定，電泳檢測(cè)結(jié)果表明，有11個(gè)菌株為F.asiaticum，37個(gè)菌株為F.graminearumsensu stricto，此法操作簡(jiǎn)單、效率高。以上3種分子鑒定方法結(jié)果一致，但多重PCR方法具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)。

禾谷鐮刀菌復(fù)合種；Fusariumgraminearumsensu stricto；Fusariumasiaticum； 分子鑒定

禾谷鐮刀菌復(fù)合種(Fusariumgraminearumspecies complex，F(xiàn)GSC)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常見的病原菌，可引起多種作物根腐病、莖腐病和穗腐病的發(fā)生，不僅使農(nóng)作物出現(xiàn)減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且產(chǎn)生的多種真菌毒素還影響糧食的安全[1-3]。目前，已經(jīng)明確禾谷鐮刀菌復(fù)合種包含至少16個(gè)種，不同種表現(xiàn)一定的地理分布特征，其中中國(guó)主要為F.asiaticum(進(jìn)化分枝6)和F.graminearumsensu stricto(進(jìn)化分枝7)[4-7]。

關(guān)于FGSC的概念，最初O’Donnell等[8]在全球收集了數(shù)十個(gè)代表性菌株，選用Tri101(the trichothecene 3-O-acetyltransferase gene)、RED(a putative reductase gene)、EF-1α(translation elongation factor 1α)、TUB(β-tubulin)、PHO(phosphate permase genes)和URA(UTP-ammonia ligase)6個(gè)單拷貝核基因，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，發(fā)現(xiàn)禾谷鐮刀菌是一個(gè)復(fù)合種。之后，Ward等[9]報(bào)道了利用多位點(diǎn)基因型分析法(multilocus genotyping assay)進(jìn)行FGSC的鑒定，該方法基于3個(gè)持家基因(RED、MAT和TEF-1)和毒素合成的3個(gè)基因(TRI101、TRI12 和TRI3)設(shè)計(jì)48對(duì)引物，通過多重PCR，同時(shí)進(jìn)行種和毒素型的鑒定。Davari等[10]發(fā)明了一種靈敏、有效識(shí)別FGSC的方法——RCA(rolling circle amplification)，該方法通過比較超過40個(gè)Fusariumspp.菌株(FGSC、FIESC、FTSC和FOSC)的EF-1α基因序列，設(shè)計(jì)FGSC特異的探針引物，PCR產(chǎn)物經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳(有條帶)或者加入熒光染料(SYBR Green Ⅰ)在紫外(UV)燈下照射(熒光發(fā)亮)進(jìn)行鑒定，此法的特點(diǎn)是靈敏，但不能區(qū)分FGSC的不同種。Fernández-Ortuo等[11]研究報(bào)道了通過Real-time PCR同時(shí)檢測(cè)FGSC中3個(gè)不同種(F.asiaticum、F.ussurianum和F.vorosii)，該方法基于鐮刀菌的特異基因CYP51C(a sterol 14-alpha demethylase paralogue)設(shè)計(jì)定量引物進(jìn)行鑒定，此法具有明顯的局限性，只能對(duì)已知的這3個(gè)種進(jìn)行鑒定。

由于中國(guó)和日本的FGSC主要為F.graminearumsensu stricto和F.asiaticum2個(gè)種，因此，研究者基于這2個(gè)種，分別建立了系統(tǒng)發(fā)育譜系分析、PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)和多重PCR等方法。系統(tǒng)發(fā)育譜系分析是基于FGSC菌株的Tri101和EF-1α基因，利用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，完成種的鑒定[12-13]；PCR-RFLP是基于組蛋白H3基因特殊的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物H3dStyⅠ/H3R1，通過PCR和酶切反應(yīng)，完成種的鑒定[14]；多重PCR是基于CYP51A基因，設(shè)計(jì)特異引物FaF/FaR(對(duì)F.asiaticum特異)和FgF/FgR(對(duì)F.graminearumsensu stricto特異)，完成對(duì)FGSC種的鑒定[15]。本研究選取引起河南省小麥赤霉病和玉米莖腐病的FGSC菌株，通過比較3種分子鑒定方法，選擇出一種快速、準(zhǔn)確、高效的F.graminearumsensu stricto和F.asiaticum鑒定方法。

1 材料和方法

1.1 樣品收集與菌株分離

2012年，在小麥赤霉病和玉米莖腐病發(fā)病的高峰期，采集河南省許昌、漯河、駐馬店地區(qū)的病樣(小麥赤霉病為穗部，玉米莖腐病為病株莖基部第1～2節(jié))。FGSC菌株的分離、單孢純化和初步鑒定(主要通過觀察PDA培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顏色以及液體搖菌培養(yǎng)后分生孢子的形態(tài)來鑒定)等參照孫靜等[16]和吳全安等[17]的方法，共獲得48個(gè)FGSC菌株(表1)。

表1 試驗(yàn)所用的48個(gè)FGSC菌株

續(xù)表1 試驗(yàn)所用的48個(gè)FGSC菌株

注：菌株命名的第1個(gè)字母“W”和“M”分別代表菌株來自小麥和玉米。

1.2 菌絲收集與DNA提取

對(duì)活化的菌株挑取少量新鮮菌絲到PDA平板上，26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d后，以滅菌牙簽刮取菌絲1 g左右，用組織細(xì)胞破碎儀(Bullet Blender，美國(guó))研磨后，采用真菌DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)：DK621-01)提取各菌株的基因組DNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Tri101和EF-1α基因的PCR擴(kuò)增、測(cè)序及系統(tǒng)發(fā)育譜系分析

用引物TRI1015B/TRI1013E[18]和EF1/EF2[19]分別擴(kuò)增48個(gè)菌株的Tri101和EF-1α基因部分序列(表2)。PCR反應(yīng)體系均為：TaqPCR Master Mix(BIOTEKE公司)12.5 μL、上游引物(5 μmol/L)和下游引物(5 μmol/L)各1 μL、模板DNA(10 ng/μL)1 μL、ddH2O 9.5 μL，總體積為25 μL。反應(yīng)程序均為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，54 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物序列測(cè)定(采用雙向測(cè)序)均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 試驗(yàn)所用的引物

注：R=A或G，Y=C或T，S=C或G，I=Inosine(肌苷)，N=Nucleoside(核苷)。

通過DNAStar軟件的SeqMan模塊將Tri101和EF-1α基因序列拼接在一起，人工校對(duì)后獲得測(cè)序菌株的完整序列，然后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中FGSC 16個(gè)種代表性菌株[來自美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(NRRL)]的Tri101和EF-1α基因序列通過ClustalX 1.81(www.clustal.org/clustal2/)進(jìn)行多重比對(duì)，刪除多余不匹配的序列，利用MEGA 6.06軟件通過最大似然法(maximum-likelihood,ML)，根據(jù)貝葉斯推斷(Bayesian information criterion scores)選擇最合適的模型(Kimura-2參數(shù)模型，Bootstrap replications的值為1 000)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育譜系分析[12-13]。

1.4 PCR-RFLP

用引物H3dStyⅠ和H3R1(表2)擴(kuò)增48個(gè)菌株的基因組DNA，獲得的PCR產(chǎn)物分別用內(nèi)切酶StyⅠ(對(duì)F.asiaticum特異，酶切片段大小為195 bp和28 bp)或者EcoRⅤ酶切(對(duì)F.graminearumsensu stricto特異，酶切片段大小為191 bp和32 bp)，其他Fusariumspp.菌株不會(huì)出現(xiàn)酶切片段，酶切產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用StyⅠ酶切后電泳條帶較小的即為F.asiaticum菌株，用EcoRⅤ酶切后電泳條帶較小的即為F.graminearumsensu stricto菌株。PCR反應(yīng)操作方法參照Suga等[14]的反應(yīng)體系和程序。

1.5 多重PCR

同時(shí)用引物FaF/FaR和FgF/FgR(表2)擴(kuò)增48個(gè)菌株的基因組DNA。多重PCR反應(yīng)操作方法參照Yun等[15]的反應(yīng)體系和程序，擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，F(xiàn).asiaticum菌株電泳條帶大小為292 bp，F(xiàn).graminearumsensu stricto菌株電泳條帶大小為352 bp。

2 結(jié)果與分析

2.1 FGSC菌株的系統(tǒng)發(fā)育譜系分析

對(duì)所研究的48個(gè)菌株的Tri101和EF-1α基因部分序列進(jìn)行了測(cè)定。同時(shí)從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了已報(bào)道的FGSC 16個(gè)種(F.asiaticum、F.graminearumsensu stricto、F.vorosii、F.boothii、F.acaciae-mearnsii、F.mesoamericanum、F.austroamericanum、F.brasilicum、F.cortaderiae、F.meridionale、F.aethiopicum、F.louisianense、F.nepalense、Fusariumsp.、F.ussurianum、F.gerlachii)的Tri101和EF-1α基因序列，另外選取F.culmorum和F.pseudograminearum作為參考種，共獲得18個(gè)種40個(gè)菌株(來自NRRL)的Tri101和EF-1α基因序列。將所有序列多重比對(duì)后對(duì)齊，去掉兩端引物和多余部分堿基，用于建樹的Tri101和EF-1α基因序列片段為998 bp和598 bp。用MEGA 6.06軟件進(jìn)行Tri101和EF-1α基因部分序列的系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，結(jié)果表明，所研究的48個(gè)FGSC菌株中有11個(gè)菌株為F.asiaticum(基于Tri101和EF-1α的Bootstrap為96%)，37個(gè)菌株為F.graminearumsensu stricto(基于Tri101和EF-1α的Bootstrap為97%)(圖1)。

2.2 FGSC菌株的PCR-RFLP鑒定

PCR產(chǎn)物酶切之后，用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，用StyⅠ酶切，有11個(gè)FGSC菌株的電泳條帶與其他菌株相比較小，為F.asiaticum菌株(圖2A)；用EcoRⅤ酶切，有37個(gè)FGSC菌株的電泳條帶與其他相比較小，為F.graminearumsensu stricto菌株(圖2B)。該鑒定結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育譜系分析的結(jié)果一致。

2.3 FGSC菌株的多重PCR鑒定

多重PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，有11個(gè)FGSC菌株出現(xiàn)292 bp的電泳條帶，為F.asiaticum；有37個(gè)FGSC菌株出現(xiàn)352 bp的電泳條帶，為F.graminearumsensu stricto(圖3)。該方法對(duì)48個(gè)FGSC菌株的鑒定結(jié)果與上述2種方法的結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

將FGSC準(zhǔn)確鑒定到種是研究其相關(guān)病害的基礎(chǔ)。目前，常用的是形態(tài)鑒定結(jié)合分子鑒定的方法。近年來，利用特異性PCR、特征DNA序列等分子技術(shù)輔助鑒別FGSC的方法已經(jīng)被普遍應(yīng)用[20-22]。Geiser等[23]建立了基于TEF-1α基因部分序列的鐮刀菌數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)TEF-1α基因部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，將FGSC鑒定到種。本研究中，通過比對(duì)測(cè)序菌株和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的FGSC 16個(gè)種代表性菌株的Tri101和EF-1α基因部分序列，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，結(jié)果表明，有11個(gè)FGSC菌株與F.asiaticum聚在一起成為一個(gè)分枝，37個(gè)FGSC菌株與F.graminearumsensu stricto聚在一起，但這種分子鑒定FGSC的方法繁瑣、復(fù)雜。有些FGSC具有地理分布特征，單獨(dú)基于Tri101或者EF-1α基因部分序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，并不能準(zhǔn)確鑒定到種，故需要將二者的基因序列拼接之后進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育譜系分析，其結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。系統(tǒng)發(fā)育譜系分析方法的特點(diǎn)是準(zhǔn)確、利于新發(fā)現(xiàn)種的鑒定，特別是對(duì)自然界中FGSC內(nèi)不同種之間通過基因滲入的雜交新種或者基因內(nèi)重組出現(xiàn)新種的鑒定，對(duì)發(fā)現(xiàn)新種有重要的意義，但成本較高。

Suga等[14]報(bào)道了PCR-RFLP，該法是基于組蛋白H3基因的特殊酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異引物，第一步PCR反應(yīng)產(chǎn)物片段大小為223 bp，用內(nèi)切酶StyⅠ酶切后只有F.asiaticum菌株出現(xiàn)195 bp的條帶，用EcoRⅤ酶切后只有F.graminearumsensu stricto菌株出現(xiàn)191 bp的條帶，將相差28 bp或者32 bp的條帶通過電泳顯示出來，需要2%或者濃度更高的瓊脂糖凝膠。該法對(duì)電泳過程有很高的要求，此外PCR反應(yīng)產(chǎn)物中含有的Buffer、dNTP、鎂離子等也可能會(huì)影響酶切效率。

Bootstrap值(%，基于1 000次重復(fù))≥60時(shí)顯示在系統(tǒng)發(fā)育樹分支上;比例尺顯示了每個(gè)位點(diǎn)的核苷酸差異數(shù)

Ward等[9]為了對(duì)FGSC同時(shí)進(jìn)行種和毒素型的鑒定，設(shè)計(jì)了利用48對(duì)引物的多重PCR，該方法的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)已明確的FGSC種進(jìn)行鑒定，但操作過程繁瑣復(fù)雜，第一步PCR反應(yīng)過程需要高保真Taq酶降低堿基錯(cuò)配率，PCR產(chǎn)物經(jīng)過特殊的儀器設(shè)備純化后作為模板，再利用種和毒素型引物進(jìn)行等位基因特異性延伸反應(yīng)，從而完成種的鑒定。Yun等[15]研究報(bào)道，基于CYP51A和β-tubulin基因設(shè)計(jì)了F.asiaticum和F.graminearumsensu stricto的特異引物FaF/FaR、FgF/FgR和FgaF/FgaR(內(nèi)參引物)，用來同時(shí)定性和定量檢測(cè)小麥中的FGSC。本研究利用特異引物FaF/FaR和FgF/FgR進(jìn)行多重PCR，可將FGSC準(zhǔn)確鑒定到種，此方法簡(jiǎn)單、靈敏、錯(cuò)誤率低，電泳檢測(cè)結(jié)果一目了然，但只能用來鑒定F.graminearumsensu stricto和F.asiaticum這2個(gè)種，不能對(duì)其他14個(gè)種或新發(fā)現(xiàn)種進(jìn)行鑒定。

A.StyⅠ酶切; B.EcoRⅤ酶切。M為DL2000 Marker; 3、4、5、10、12、13、18、25、26、36和40為F.asiaticum菌株，其他為F.graminearum sensu stricto菌株，下同

圖3 多重PCR鑒定FGSC的電泳檢測(cè)結(jié)果

通過對(duì)48個(gè)FGSC菌株的鑒定發(fā)現(xiàn)，以上3種分子鑒定F.graminearumsensu stricto和F.asiaticum方法的結(jié)果一致，其中系統(tǒng)發(fā)育譜系分析步驟繁瑣、費(fèi)用高，PCR-RFLP對(duì)操作過程要求高且工作量大，而多重PCR快速、準(zhǔn)確、高效，但其可能只適合對(duì)FGSC引起的中國(guó)小麥或玉米相關(guān)病害的鑒定，因?yàn)镕.graminearumsensu stricto和F.asiaticum是中國(guó)作物上FGSC的主要成員。

本研究比較了鑒定FGSC的分子方法，發(fā)現(xiàn)多重PCR的方法適用于室內(nèi)大量鑒定F.graminearumsensu stricto和F.asiaticum的工作，其對(duì)象包括FGSC菌株、籽粒和植株等，可為中國(guó)FGSC相關(guān)病害的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

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Comparison of Three Molecular Identification Methods for Fusarium graminearum sensu stricto and F.asiaticum

RU Yanyan,XIE Shuna,LI Baoye,SUN Jing,LIU Jiazhong,HAO Junjie*

(Plant Protection Institute,Henan Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Region of North China/Henan Key Laboratory of Crop Pest Control,Zhengzhou 450002,China)

Fusariumgraminearumsensu stricto andF.asiaticumare major members ofFusariumgraminearumspecies complex(FGSC) in China.In this study,to improve the identification efficiency of these two species,48 members of FGSC collected from plants showingFusariumhead blight (FHB) or maize stalk rot(MSR) were identified using three molecular identification methods.One method was amplification of partial sequences of two genesEF-1αandTri101,and then sequencing and phylogenetic analyses by MEGA 6.06 software.The results showed that 11 isolates were clustered together withF.asiaticumand 37 isolates were clustered together withF.graminearumsensu stricto.This method was cumbersome,complex and costly,but the identification results were accurate.A second method was polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP).Based on the specific restriction sites of histone H3 gene,primers H3dStyⅠ and H3R1 were designed.11 isolates were identified asF.asiaticumand 37 isolates wereF.graminearumsensu stricto.This method required lots of work and high operation process.The third method was a multiplex PCR.Based on theCYP51Agene,primers FaF/FaR and FgF/FgR were designed.11 isolates were identified asF.asiaticumand 37 isolates wereF.graminearumsensu stricto.This method was simple and efficient.These results were similar,while the multiplex PCR method was more rapid,accurate and efficient.

Fusariumgraminearumspecies complex(FGSC)；Fusariumgraminearumsensu stricto；Fusariumasiaticum； molecular identification

S432.4

A

1004-3268(2017)11-0080-07

2017-04-13

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目(201412008，豫財(cái)預(yù)[2017]76-11)；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新專項(xiàng)基金項(xiàng)目(2017ZC38)

茹艷艷(1986-)，女，河南洛陽(yáng)人，助理研究員，博士，主要從事玉米病害研究。E-mail：ruyanbingyu@163.com

*通訊作者：郝俊杰(1978-)，男，河南登封人，副研究員，博士，主要從事玉米病害研究。E-mail：haojjds@163.com