閆 敏 宋軍營 曾華輝 袁 永 張鐘允 翟晉豫 張振強(qiáng) 劉文弟

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

適用免疫組化的突觸素與嗜鉻素A單克隆抗體的制備與臨床初步評價①

閆 敏 宋軍營 曾華輝 袁 永 張鐘允 翟晉豫②張振強(qiáng) 劉文弟

(河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450046)

目的制備突觸素與嗜鉻素A免疫組化單克隆抗體，期望可初步應(yīng)用于臨床。方法設(shè)計Syn與CgA融合基因，并構(gòu)建至表達(dá)載體上表達(dá)獲得融合蛋白。經(jīng)過抗原免疫、細(xì)胞融合后篩選獲得目標(biāo)抗體。通過臨床樣本對比驗(yàn)證，研究Syn和CgA兩者的特異性，評價相關(guān)系數(shù)。結(jié)果通過篩選，共獲得2株分別針對Syn與CgA的抗體3D9和4A12。通過對比抗體試劑共同驗(yàn)證19種蠟塊組織，統(tǒng)計結(jié)果分析，結(jié)果符合性較好，相關(guān)系數(shù)分別達(dá)到r=0.989 2與r=0.993 9。結(jié)論該方法成功制備獲得了可初步適用于免疫組化的突觸素與嗜鉻素A抗體，該方法可為免疫學(xué)抗體研究提供一定的借鑒意義。

突觸素；嗜鉻素A；單克隆抗體；免疫組化

突觸素(Synaptophysin，Syn)是由突觸囊泡膜上分泌的一類膜蛋白?？沙袚?dān)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞功能，在神經(jīng)元間信息傳遞過程當(dāng)中起著重要作用[1]。突觸素由307個氨基酸組成，分子量38 kD，存在有四個跨膜區(qū)。目前突觸素免疫組化檢測經(jīng)常在神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的診斷過程中應(yīng)用較多。實(shí)際臨床診斷過程中，神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuronspecific enolase，NSE)與嗜鉻素A(Chromogranin A，CgA)常常一起作為聯(lián)合分析指標(biāo)，指導(dǎo)分析神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生發(fā)展時期，并做出合理的判斷與指導(dǎo)[2,3]。嗜鉻素A是一種酸性蛋白，主要儲存在腎上腺髓質(zhì)和多種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的致密核心顆粒中。CgA與Syn是應(yīng)用在神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)記物中使用頻率最高的標(biāo)記物[4]。這些單克隆抗體在實(shí)際的應(yīng)用過程中有著重要的臨床意義。本實(shí)驗(yàn)以開發(fā)具有臨床檢測意義的CgA與Syn單克隆抗體為目的，同時進(jìn)行初步臨床評價這些抗體效果，探索該方法的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1材料 嗜鉻細(xì)胞瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等組織蠟塊取自鄭州大學(xué)附屬河南省腫瘤醫(yī)院病理科；6～8周齡BALB/c小鼠購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心；DH5α菌、BL-21菌為本實(shí)驗(yàn)室保存；SP2/0細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存；基因合成服務(wù)選擇南京金斯瑞生物；NdeⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶購自TaKaRa；無縫克隆試劑盒購自Novoprotein公司；弗氏完全佐劑與不完全佐劑購自Sigma公司；細(xì)胞融合用血清(FBS)、RPMI1640購自Gibco公司；免疫組化DAB套裝試劑盒購自福建邁新生物；對照CgA、Syn抗體試劑工作液選擇Leica試劑，由河南省腫瘤醫(yī)院病理科惠贈；其他化學(xué)試劑為分析純。

1.2方法

1.2.1抗原設(shè)計與制備 查閱Uniprot數(shù)據(jù)信息，選擇Syn蛋白的胞內(nèi)保守區(qū)，氨基酸序列：aa 224～300，CgA蛋白選擇中段氨基酸序列，氨基酸序列：aa 200～338。將二者基因進(jìn)行融合構(gòu)建，經(jīng)過基因直接合成，同時設(shè)計整段基因序列的上下游引物。上游引物：GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGGGACAGTGAGGGC；下游引物：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTAGCCTTGCTGCCCATAGTCG。

1.2.2基因構(gòu)建與蛋白表達(dá) 目的條帶經(jīng)過PCR擴(kuò)增后切膠回收，同時pET-28a載體經(jīng)過NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，核酸電泳后切膠回收，將二者按照無縫克隆試劑盒說明書要求比例進(jìn)行混合后無縫克隆，涂板，第二日挑單克隆測序并轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL-21。測序正確后經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，蛋白純化儀純化，咪唑洗脫目的蛋白后超濾濃縮并除去咪唑，利用BCA法測定蛋白濃度。

1.2.3融合蛋白免疫與效價檢測 將融合蛋白按照100 μg/只小鼠的劑量進(jìn)行免疫，首次免疫將其與弗氏完全佐劑冰上乳化，第二次、第三次免疫同樣按照100 μg/只劑量進(jìn)行乳化后免疫。三次免疫之間時間間隔為2周，免疫方式均為腹腔內(nèi)注射免疫。第三次免疫后2周進(jìn)行小鼠尾血效價檢測，采集尾血離心取上清后按照1∶1 000開始等體積梯度進(jìn)行稀釋，融合蛋白包被濃度為100 ng/孔。ELISA間接法檢測，以陰性血清為對照，統(tǒng)計結(jié)果分析免疫效果。

1.2.4細(xì)胞融合與抗體篩選 融合前3 d，小鼠尾靜脈沖擊抗原50 μg，同時復(fù)蘇SP2/0細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞生長狀態(tài)，待融合前達(dá)到1×107～2×107細(xì)胞量。融合時，收集脾臟進(jìn)行研磨，將脾臟細(xì)胞進(jìn)行過濾并計數(shù)、與SP2/0細(xì)胞株按照1∶(5～10)的比例混合，離心后PEG作用1 min，1640培養(yǎng)液終止，再利用含HAT的20%FBS、80%RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行鋪96孔板，每孔250 μl培養(yǎng)液，鋪板密度為1×105個/孔。培養(yǎng)第11天全換液，第12天進(jìn)行ELISA檢測，待上清培養(yǎng)一定時間后，將陽性細(xì)胞上清經(jīng)過免疫組化評價，篩選初步適用于免疫組化的分泌抗體細(xì)胞株。

1.2.5臨床初步評價抗體 利用從醫(yī)院獲得的19個不同蠟塊或切片(神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞瘤、結(jié)腸腺癌腫瘤細(xì)胞、肝臟、胰十二指腸等)，與對照試劑相比，評價通過腹水制備純化獲得的自制CgA與Syn單克隆抗體特異性、兩者交叉性及與對照試劑的符合系數(shù)，結(jié)果使用組織學(xué)評分法(Histological score，H-score)進(jìn)行評分統(tǒng)計，強(qiáng)度表達(dá)按陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度由弱至強(qiáng)分別記分，細(xì)胞膜無黃色顆粒樣沉淀為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、深棕黃色為3分；顯微鏡下統(tǒng)計完整細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)。具體公式：H-score=強(qiáng)度×陽性細(xì)胞/視野網(wǎng)格下細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 對照組與自產(chǎn)抗體組針對相同樣本的IHC結(jié)果利用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，結(jié)果通過H-score進(jìn)行評分統(tǒng)計，統(tǒng)計后利用SPSS分析軟件分析評估，進(jìn)而評估該方法在臨床診斷抗體制備過程中的價值。

2 結(jié)果

2.1融合基因PCR結(jié)果與克隆后PCR鑒定 合成獲得的融合基因，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，得到的目的條帶如圖1A所示，再經(jīng)過無縫克隆重組連接后，經(jīng)PCR鑒定結(jié)果如圖1B所示。結(jié)果顯示目的基因與pET-28a質(zhì)粒載體重組成功。

2.2蛋白純化結(jié)果與小鼠免疫效價分析 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行鎳柱純化，純化結(jié)果如圖2所示。

圖1 融合基因PCR檢測與克隆鑒定結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR product geneNote: A.The PCR amplification results of fusion gene；B.The PCR identification results of fusion gene construction.

表1小鼠尾血效價檢測結(jié)果

Tab.1Resultsofimmunizingpotency

MouseNo.Serumdilutionratio1∶10001∶20001∶40001∶80001∶160001∶320001∶640001∶128000NegativeBlank12.1331.9841.5691.2240.8620.5980.2470.120.0630.02822.2451.9981.6211.3020.8990.6170.2550.1360.0620.02832.1871.9561.5341.1990.8750.5860.2580.1150.0620.028

圖2 蛋白純化結(jié)果Fig.2 Purification results of recombinant proteinNote: 1.Supernatant of lysate；2.Precipitation of lysate；3.Flow through;4.Elution by 50 mmol/L imidazole；5.Elution by 200 mmol/L imidazole.

圖3 突觸素自制抗體與對照試劑IHC初步對比驗(yàn)證結(jié)果(×400)Fig.3 Comparison between 3D9(Syn)mAb and Leica mAb in IHC detection(×400)Note: A，B.Neuroendocrine carcinoma；C，D.Liver.

通過將該抗原進(jìn)行免疫，免疫結(jié)果顯示，蛋白條帶大小符合預(yù)期，免疫效果達(dá)到可融合要求(見表1)。

2.3初步經(jīng)ELISA方法與免疫組化篩選獲得細(xì)胞株 經(jīng)過融合后ELISA篩選與免疫組化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得較好的細(xì)胞株為3D9(Syn)與4A12(CgA)，免疫組化驗(yàn)證選擇Leica對照試劑。部分圖片如圖3(Syn)、圖4(CgA)所示，結(jié)果與對照試劑基本符合。

圖4 CgA自制抗體與對照試劑IHC初步對比驗(yàn)證結(jié)果(×400)Fig.4 Comparison between 4A12(CgA)mAb and Leica mAb in IHC detection(×400)Note: A,B.Bowel adenocarcinoma tumor;C,D.Pancreatic duodenum.

圖5 兩種抗體臨床評價對比結(jié)果Fig.5 Contrast results of clinical evaluationNote: A.The Score statistics of Syn antibody (3D9) and control reagent；B.The Score statistics of CgA antibody (4A12) and control reagent.

2.4臨床評價結(jié)果 通過醫(yī)院獲取的19種不同樣本，經(jīng)過免疫組化對照試驗(yàn)，結(jié)果通過H-score進(jìn)行評分統(tǒng)計自制抗體與對照抗體之間相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果顯示Syn與對比試劑相關(guān)系數(shù)r=0.989 2，CgA與對比試劑相關(guān)系數(shù)r=0.993 9(見圖5)，該制備抗體臨床評價結(jié)果達(dá)到了較好的效果。

3 討論

Syn與CgA是臨床評價腫瘤的兩類重要指標(biāo)，在對胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[5]、小細(xì)胞肺癌[6]、髓質(zhì)病變[7]、原發(fā)食管小細(xì)胞癌[8]等的診斷及預(yù)后均具有重要的指導(dǎo)作用。WHO國際腫瘤組織學(xué)中明確指出：CgA陽性表達(dá)、Syn陽性表達(dá)、電鏡直接觀察到有神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒，這三類只要有一項(xiàng)滿足，即可認(rèn)定腫瘤細(xì)胞存在神經(jīng)內(nèi)分泌分化。Syn與CgA作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)記物，在實(shí)際的臨床診斷過程當(dāng)中，往往是被作為神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分析的必選方案[9]。Nordi在對Syn的質(zhì)評方面更是開展了6次評比驗(yàn)證(http：//www.nordiqc.org/)，足以見到其的重要性。因此Syn與CgA的免疫組化抗體制備具有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)抗原設(shè)計過程中，通過分析Syn與CgA的保守區(qū)序列，為了提高免疫組化抗體制備的成功率，將兩者組成融合蛋白后，解決了單獨(dú)Syn與CgA蛋白分子量較小，免疫原性弱可能帶給免疫效果的不良影響，而且一次融合可以制備出兩種抗體，具有較高的實(shí)用價值。經(jīng)免疫、效價評定、細(xì)胞融合后進(jìn)行篩選并制備純化得到該抗體。后期從醫(yī)院選擇的19種腫瘤組織，對比Leica抗體，在評價的過程當(dāng)中，兩者識別位點(diǎn)專一，特異性較強(qiáng)，兩者之間不存在特異性交叉現(xiàn)象，19種腫瘤組織分別與對照免疫組化統(tǒng)計相關(guān)系數(shù)r=0.989 2(Syn)和r=0.993 9(CgA)。

抗原免疫是決定整個抗體制備的關(guān)鍵，抗原的選擇與制備方法非常重要。本研究利用復(fù)合抗原驗(yàn)證并成功制備出兩株分別針對Syn和CgA的抗體，并初步評價可初步應(yīng)用于免疫組化。3個氨基酸區(qū)段及以上復(fù)合構(gòu)建的抗原能否應(yīng)用，值得嘗試。同時，Syn與CgA在目前國內(nèi)市場中，包括邁新與中杉等大型免疫組化抗體供應(yīng)商，皆無該自制抗體，目前市場應(yīng)用主要還是依賴進(jìn)口分裝，因此，本篇文章獲得兩種免疫組化細(xì)胞株不僅有方法學(xué)的意義，同時也有著較高的市場價值。

[1] Gordon SL,Harper CB,Smillie KJ,etal.A fine balance of synaptophysin levels underlies efficient retrieval of synaptobrevin II to synaptic vesicles[J].PLoS One,2016,11(2):e0149457.

[2] Annaratone L,Medico E,Rangel N,etal.Search for neuro-endocrine markers (chromogranin A,synaptophysin and VGF) in breast cancers.an integrated approach using immunohistochemistry and gene expression profiling[J].Endocr Pathol,2014,25(3):219-228.

[3] 馬志紅,沈琦斌,費(fèi)淑祎,等.CEA、CA125、CYFRA21-1、NSE聯(lián)合檢測肺癌的臨床價值[J].中國免疫學(xué)雜志,2013,29(11):1174-1176.

[4] Wachter DL,Hartmann A,Beckmann MW,etal.Expression of neuroendocrine markers in different molecular subtypes of breast carcinoma[J].Bio Med Res Int,2014,2014:408459.

[5] 葉必星,林 琳.嗜鉻素A和突觸素對胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤診斷及預(yù)后的臨床價值[J].中華消化雜志,2012,32(1):29-32.

[6] Kayser G,Csanadi A,Otto C,etal.Simultaneous multi-antibody staining in non-small cell lung cancer strengthens diagnostic accuracy especially in small tissue samples[J].PLoS One,2013,8(2):e56333.

[7] Mula-Abed W-AS,Ahmed R,Ramadhan FA,etal.A rare case of adrenal pheochromocytoma with unusual clinical and biochemical presentation:a case report and literature review[J].Oman Med J,2015,30(5):382-390.

[8] Funahashi H,Miyai H,Wakasugi T,etal.Successful combination chemotherapy with irinotecan hydrochloride and cisplatin for primary gastric small cell carcinoma:report of a case[J].World J Surg Oncol,2013,11:263.

[9] 宋佳樂,李丕鵬.胸腺神經(jīng)內(nèi)分泌功能與衰老[J].中國免疫學(xué)雜志,2011,27(3):274-276.

PreparationandclinicalevaluationofsynaptophysinandchromograninAmonoclonalantibodiesagainstimmunohistochemistry

YANMin,SONGJun-Ying,ZENGHua-Hui,YUANYong,ZHANGZhong-Yun,ZHAIJin-Yu,ZHANGZhen-Qiang，LIUWen-Di.

ChineseMedicineImmunologyLaboratory,HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China

Objective:To prepare the synaptophysin and chromogranin A monoclonal antibodies with clinical evalua-tion.MethodsThe fuse gene (Syn and CgA) was designed and it was constructed on the expression vector pET-28a.Then ,the fusion protein was purified.After protein immunization,cell fusion and screening,the target antibodies were selected.Specificity study and correlation coefficient of Syn and CgA was evaluated by clinical sample comparison validation.ResultsBy screening,two antibodies 3D9 and 4A12,respectively,for Syn and CgA,were obtained.19 kinds of wax block organization were detected by 3D9,4A12 and control antibody(Leica).The statistical results were analyzed,the results were in good agreement,and the correlation coefficients werer=0.9892 andr=0.993 9,respectively.ConclusionThis method is prepared to obtain the synaptophysin and chromogranin A antibodies successfully and both can be used for immunohistochemistry.This method can also provide some reference for the study of antibody.

Synaptophysin ;Chromogranin A;Monoclonal antibody ;Immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.015

R392.3

A

1000-484X(2017)12-1828-04

①本文為2015年度河南省科技創(chuàng)新人才計劃(154100510019)、河南省基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)(2014KYYWF-ZZCX3-06，2014KYYWF-ZZCX3-04)、2014年度河南中醫(yī)學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊(2014XCXTD01)和河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持計劃(13HASTIT027)。

②河南省腫瘤病理診斷試劑工程技術(shù)研究中心，鄭州 450001。

閆 敏(1985年-)，女，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，主要從事免疫學(xué)研究，E-mail：yanmin85@126.com。

及指導(dǎo)教師：張振強(qiáng)(1971年-)，男，博士，教授，主要從事中醫(yī)藥與免疫性疾病研究，E-mail：zhang_zhenqiang@126.com。

[收稿2017-07-04 修回2017-07-17]

(編輯 倪 鵬)