王俊虹 武 佳 魏茂提

(武警后勤學(xué)院部隊(duì)流行病學(xué)和統(tǒng)計(jì)教研室，天津 300309)

BALB/c小鼠免疫重組相思子毒素B鏈蛋白的免疫應(yīng)答①

王俊虹②武 佳 魏茂提②

(武警后勤學(xué)院部隊(duì)流行病學(xué)和統(tǒng)計(jì)教研室，天津 300309)

目的評(píng)價(jià)重組相思子毒素B鏈蛋白(rATB)免疫雌性BALB/c小鼠的免疫效果，并初步探討其免疫機(jī)制。方法以rATB為免疫原，腹腔免疫雌性BALB/c小鼠，間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a，流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)IFN-γ、IL-4，并進(jìn)行天然毒素攻毒實(shí)驗(yàn)和體外中和實(shí)驗(yàn)。結(jié)果血清IgG、IgG1效價(jià)達(dá)到1∶106以上，且攻毒后產(chǎn)生二次免疫應(yīng)答，與PBS對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而IgG2a的血清效價(jià)未發(fā)生明顯變化。細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明IFN-γ的表達(dá)量與PBS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而IL-4的表達(dá)量顯著提高(P<0.05)。小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)和體外中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，腹腔注射rATB可以抵抗最高劑量為5×LD50的天然AT毒素中毒，保護(hù)率為100%。結(jié)論rATB蛋白免疫小鼠后顯示出良好的免疫原性，能誘導(dǎo)以IgG1為主的抗體和Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，為候選疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

相思子毒素；B鏈；免疫應(yīng)答；生物恐怖

相思子毒素(Abrin toxin，AT)來(lái)源于植物相思子(Abrus precatorius)的種子，屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白(RIP)[1]。AT分子量約為65 kD，由A、B兩條多肽鏈(ATA和ATB)組成。由于AT具有毒性強(qiáng)、來(lái)源廣、易于制備等特點(diǎn)，被認(rèn)為是重要的致死性生物恐怖劑，因此相關(guān)的疫苗研制成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)[2,3]。

本研究旨在利用已制備的重組蛋白rATB(E.coliM15/pQE80L-ATB誘導(dǎo)表達(dá))[4]，腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠，觀察其免疫后機(jī)體全身的或局部的免疫效果并分析其免疫應(yīng)答機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1重組蛋白和天然毒素 重組蛋白rATB(E.coli M15/pQE80L-ATB表達(dá)、純化獲得)、天然AT均為本課題組制備[4]。

1.1.2主要試劑和儀器 辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a；ELISA用顯色液均購(gòu)自北京天根生物公司；液相內(nèi)毒素清除劑購(gòu)自北京天恩澤基因科技有限公司；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純；Coulter Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/c小鼠(雌性，6～8周齡，體重約18～20 g)：購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK-(軍)2015-005。

1.2方法

1.2.1免疫接種

1.2.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 20只6～8周齡雌性BALB/c小鼠分為4組，每組5只。實(shí)驗(yàn)組攻毒劑量分別為2×、5×、6×LD50，對(duì)照組注射PBS，攻毒劑量為2×LD50。

1.2.1.2免疫方案 PBS稀釋的rATB溶液(25 μl/只，100 μl)腹腔注射，免疫周期為0-14-28-42 d[5]。

1.2.2血清IgG、IgG1、IgG2a的檢測(cè) 每次免疫1周、攻毒后1周尾靜脈取血，室溫留取血清備用。定量后的rATB蛋白5 μg/ml，100 μl/孔，包被酶標(biāo)板，間接ELISA法[5]檢測(cè)血清抗體效價(jià)和抗體分型(HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a，1∶5 000稀釋)。

1.2.3細(xì)胞因子檢測(cè)

1.2.3.1重組蛋白去除內(nèi)毒素 按說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.3.2脾淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 在四免后1周，隨機(jī)選取免疫小鼠5只，頸椎脫臼處死后無(wú)菌取脾臟，剪碎、研磨擠壓成單細(xì)胞懸液后，離心、棄掉上清，溶紅細(xì)胞30 s后PBS洗2次，吹打均勻，以臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，要求活細(xì)胞數(shù)在90%以上；加1 ml 1640細(xì)胞培養(yǎng)基(10% FBS)重懸，調(diào)整細(xì)胞至1×107個(gè)/ml。

1.2.3.3IFN-γ、IL-4檢測(cè) 24孔板中加入細(xì)胞(2～4)×107個(gè)/孔；rATB蛋白(經(jīng)優(yōu)化10 μg/ml)；CD28：1 μg/ml；CD49d：1 μg/ml；GolgiStop：1 μg/ml。經(jīng)1640細(xì)胞培養(yǎng)基(10% FBS)至1.5 ml終體積。經(jīng)優(yōu)化作用12 h后，1 500 r/min離心5 min后棄上清收集細(xì)胞，加入工作濃度的BD固定/透膜液250 μl 重懸，4℃避光20 min；1 500 r/min離心5 min后棄上清，150 μl PBS重懸細(xì)胞，分為3管分別加入不同組合的單克隆抗體(CD3e-FITC、CD4-PECY5、CD8-APC、IFNγ-PE、IL-4-PE、Rat IgG1-PE)，避光4℃反應(yīng)30 min。各管加入1 ml PBS重懸，1 500 r/min 離心5 min后棄上清，重復(fù)2次；加入4%多聚甲醛150 μl，避光4℃保存，1周內(nèi)用流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn) 四免1周后進(jìn)行小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)，即分別注入含2×LD50、5×LD50、6×LD50劑量的天然AT。此外，5只小鼠組成PBS免疫組，注入含2×LD50天然毒素。每天觀察小鼠體重變化和死亡情況，共10 d。

1.2.5體外中和實(shí)驗(yàn)[5]取rATB免疫小鼠和PBS組小鼠血清備用，并重新選取雌性BALB/c小鼠20只，分為4組，每組5只，分別與2×LD50、5×LD50、6×LD50劑量的天然AT混合，對(duì)照組為PBS組小鼠血清與2×LD50的天然毒素混合。將純化的天然AT配制成10 μg/ml(LD50=2.58 μg/kg)，實(shí)施體外中和試驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0和Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?？贵w效價(jià)經(jīng)幾何均數(shù)數(shù)據(jù)變換后經(jīng)方差分析。計(jì)量資料采用成組t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用一般χ2檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1IgG和抗體亞型分析 圖1顯示：rATB四免后小鼠血清IgG效價(jià)達(dá)到1∶107，攻毒后產(chǎn)生了二次免疫應(yīng)答；IgG1的效價(jià)可達(dá)到1∶106，而IgG2a的血清效價(jià)最高只可達(dá)1∶102。PBS組血清IgG、IgG1、IgG2a則無(wú)明顯變化。

2.2細(xì)胞因子檢測(cè) 采用2×2析因設(shè)計(jì)方差分析，結(jié)果如表1所示，細(xì)胞因子IFN-γ：蛋白刺激劑量(10 μg/ml和20 μg/ml)和作用時(shí)間(12 h和24 h)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；IL-4：刺激劑量和作用時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即10 μg/ml的蛋白刺激劑量，作用時(shí)間為12 h時(shí)表達(dá)量最高；同型對(duì)照IgG1，蛋白刺激劑量和作用時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此可見(jiàn)，根據(jù)rATB體外刺激免疫小鼠脾臟細(xì)胞因子檢測(cè)的刺激條件為蛋白刺激劑量為10 μg/ml、作用時(shí)間為12 h。

圖1 不同時(shí)期血清中抗體效價(jià)水平Fig.1 Antibody titers of sera after each immunization and challenge trial

GroupsIFN-γ12h24hIL-412h24hIgG112h24h10μg/ml2.07±0.411.54±0.4515.77±3.0612.86±2.172.44±0.521.98±0.3320μg/ml2.11±0.561.94±0.299.56±3.086.67±1.862.05±0.582.56±0.72

圖2 rATB免疫小鼠脾臟細(xì)胞因子水平Fig.2 Levels of cytokine of rATB in spleen after immunity

圖3 體內(nèi)攻毒實(shí)驗(yàn)小鼠存活情況和體重變化Fig.3 Vaccination with rATB followed by different doses of AT administered by i.p.injectionNote: A.Average weights (as percentage of initial weight)；B.Survival curves.

此外，圖2顯示在rATB在最佳刺激條件下，與同型對(duì)照IgG1組比較，細(xì)胞因子IFN-γ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而IL-4的表達(dá)量有顯著性提高(P<0.05)。

2.3小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn) AT在2×LD50，5×LD50攻毒劑量下，小鼠均存活且體重在10 d內(nèi)逐漸恢復(fù)正常；6×LD50劑量攻毒的小鼠死亡2只，即生存率僅為60%。PBS組免疫小鼠在2×LD50劑量攻毒后全部死亡(圖3)。

圖4 體外中和實(shí)驗(yàn)變化圖Fig.4 rATB neutralization assay and efficacy of passive protectionNote: A.Average weights (as percentage of initial weight)；B.Survival curves.

2.4小鼠體外中和實(shí)驗(yàn) 如圖4所示：2×LD50和5×LD50劑量組小鼠全部存活，而6×LD50劑量組小鼠死亡3只，生存率僅為40%。PBS組小鼠全部死亡。

3 討論

作為重要的致死性生物毒素戰(zhàn)劑，AT的毒性是普通化學(xué)武器的幾百倍[3,6]，易被恐怖分子利用，因此發(fā)展有效的防治手段，即研發(fā)預(yù)防性疫苗，用于應(yīng)對(duì)生物恐怖已成為各國(guó)生防領(lǐng)域的重要任務(wù)。

目前關(guān)于AT相關(guān)的生防疫苗研制較少，主要包括類(lèi)毒素和基于A鏈亞單位。其中，經(jīng)甲醛化處理后的全毒素[3]、ATA突變體(mABRAE164-AR167L)[2]和ATA的截?cái)嗥蝃6]，均能抵抗致死劑量的天然毒素攻毒，顯示出良好的免疫原性，但由于具有毒性而限制了進(jìn)一步的使用。毒素B鏈亞單位疫苗的研究較少，主要因?yàn)锽鏈的免疫原性一直存有爭(zhēng)議。文獻(xiàn)報(bào)道B鏈的免疫原性不如A鏈[7,8]，但也研究表明B鏈同樣是良好的疫苗候選抗原[9,10]，尤其是作為結(jié)合鏈，B鏈對(duì)人體無(wú)毒性，使得其作為疫苗候選成為可能。本研究采用E.coli M15/pQE80L-ATB表達(dá)、純化獲得的rATB為免疫原腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠，評(píng)價(jià)其免疫效果[4，5]，并初步探討其免疫機(jī)制。圖1結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)四免后，rATB免疫小鼠血清IgG的效價(jià)達(dá)107以上，攻毒后產(chǎn)生二次免疫應(yīng)答，PBS組小鼠血清IgG未發(fā)生明顯變化(P<0.05)，IgG1的結(jié)果變化相同，而IgG2a與PBS組小鼠血清差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)，細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果顯示：與同型對(duì)照IgG1組比較，IFN-γ表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而IL-4的表達(dá)量有顯著性提高(P<0.05)?？贵w亞型分析和細(xì)胞因子(IFN-γ和IL-4)檢測(cè)結(jié)果提示，重組蛋白rATB免疫小鼠后能誘導(dǎo)以IgG1為主的抗體和Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，但不能誘導(dǎo)IgG2a和Th1優(yōu)勢(shì)應(yīng)答。此外，經(jīng)小鼠攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)和體外中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，rATB可以完全抵抗5×LD50劑量的天然AT攻毒。

總之，本研究對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中獲得的重組蛋白rATB進(jìn)行了免疫效果評(píng)價(jià)并初步分析了免疫機(jī)制，結(jié)果表明免疫小鼠可誘導(dǎo)以IgG1為主的抗體和Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答，并保護(hù)致死劑量的AT攻毒，為研究相思子B鏈疫苗奠定了基礎(chǔ)。

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ImmuneresponseofarecombinantabrinBchainproteinagainstabrinintoxicationinBALB/cmice

WANGJun-Hong,WUJia,WEIMao-Ti.

LogisticsUniversityofPAP，MilitaryEpidemiology&StatisticsSection,Tianjin300309,China

Objective:To evaluate the immune response efficiency of the recombinant abrin B chain protein (rATB) in BALB/c mice.MethodsBALB/c mice were vaccinated intraperitoneally (i.p.) with the purified rATB protein.ELISA was used to detect the IgG,IgG1and IgG2a.Meanwhile,the expression of IL-4 and IFN-γ were detected by flow cytometry.Then the protein neutralization assay and efficacy of passive protection were done.ResultsThe anti-rATB antibody was detected by ELISA after vaccinated the rATB in the mice and results showed that the highest titer reached 106,which was acquired after the last vaccination.Meanwhile,a strong secondary response was triggered in mice when challenged with toxin.In contrast,the antibody response of the PBS-vaccinated mice was less than 1∶10 andP<0.05 indicated obvious difference between test group and control group.The result of IgG1was the same as the IgG,while the result of IgG2ahad not changed.There was significant difference for IL-4 between two groups (P<0.05),while no significant difference for IFN-γ was observed.All BALB/c mice survived after challenged with 5×LD50of AT.Transfusion of sera from immunized mice provided passive protection in naive mice.Furthermore,the rATB could induce specific neutralizing antibodies against abrin toxin.ConclusionThe recombinant protein can induce the Th2-type immune response and trigger a good immune response and protective efficacy,which means it may be a promising vaccine candidate against human exposure to AT.

Abrin toxin;B chain;Immune response;Bioterrorism

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.014

R392

A

1000-484X(2017)12-1824-04

①本文受武警后勤學(xué)院博士啟動(dòng)金項(xiàng)目(WHKF201503)和軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)“2110”三期工程建設(shè)項(xiàng)目資助。

②同時(shí)供職于天津市職業(yè)與環(huán)境危害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300309。

王俊虹(1977年-)，女，博士，講師，主要從事生物戰(zhàn)劑的偵檢與防治方面的研究，E-mail：wangjunhong11007@163.com。

[收稿2016-10-21 修回2016-11-21]

(編輯 張曉舟)