馬玉濱 燕 速 于鵬杰 白振忠

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，西寧 810001)

低氧誘導(dǎo)因子-1α在胃癌組織中表達(dá)水平及分子作用機制研究

馬玉濱 燕 速 于鵬杰 白振忠

(青海大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸腫瘤外科，西寧 810001)

目的檢測低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在胃癌組織的表達(dá)水平，探討HIF-1α 在胃癌發(fā)病過程的分子作用機制。方法選取世居于青海省境內(nèi)河湟谷地的新發(fā)胃癌患者60例，設(shè)為高原組；選取平原地區(qū)(深圳)新發(fā)胃癌患者60例，設(shè)為平原組。收集兩組患者胃癌組織標(biāo)本，采用免疫組織化學(xué)染色SP法檢測兩組患者組織標(biāo)本中HIF-1α蛋白的表達(dá)情況。采用免疫熒光染色測定兩組受試者胃癌組織的HIF-1α的表達(dá)量。采用RT-PCR檢測兩組患者組織標(biāo)本中miR-210的表達(dá)水平。分析胃癌患者HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果高原組患者胃癌組織的HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著高于平原組(P<0.05)。高原組患者胃癌組織的HIF-1α mRNA含量也顯著高于平原組(P<0.05)。高原組患者胃癌組織的miR-210的表達(dá)水平也顯著高于平原組(P<0.05)。HIF-1α在胃癌中的陽性表達(dá)與腫瘤的分化(P=0.044 1)、浸潤深度(P=0.031 9)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.025 3)及TNM分期(P=0.028 9)相關(guān)。結(jié)論低氧環(huán)境下胃癌組織中HIF-1α水平顯著增加，并且HIF-1α能通過miR-210促進(jìn)胃癌細(xì)胞進(jìn)展。

低氧誘導(dǎo)因子-1α；胃癌；miR-210；分子機制

胃癌是目前最具侵襲性和致死性的惡性腫瘤之一。青海省地處青藏高原東北麓，也是胃癌高發(fā)省份，研究認(rèn)為低氧對胃癌發(fā)生、發(fā)展起著相當(dāng)重要的作用。近年來，低氧誘導(dǎo)因子(HIF)作為細(xì)胞和分子水平的低氧感知分子，被高度關(guān)注[1，2]。有研究者認(rèn)為HIF家族中重要成員HIF-1α與低氧環(huán)境下胃癌的發(fā)病具有高度相關(guān)性，但是作用機制尚不明確。miRNAs是一種小分子單鏈非編碼RNA，通過阻斷mRNA的翻譯或通過加速mRNA的降解調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。在缺氧相關(guān)HIF-1α為核心因子的信號通路中，最敏感且最有影響力的miR是miR-210。miR-210的種子序列(6～8個核苷酸)可以通過互補配對結(jié)合到HIF-1α的3′非翻譯區(qū)端，進(jìn)而調(diào)控 HIF-1α翻譯。故而，本研究通過評估HIF-1α在胃癌組織中表達(dá)水平，以此探討其是否由miR-210調(diào)節(jié)而發(fā)揮作用，以為臨床治療提供進(jìn)一步靶點。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象與分組 選取2015年1月至2016年6月我院接受治療的世居于青海省境內(nèi)河湟谷地的新發(fā)胃癌患者60例和同期平原地區(qū)(深圳)新發(fā)胃癌患者60例。選取青海省境內(nèi)河湟谷地的新發(fā)胃癌患者，設(shè)立高原組(n=60)，其中男34例，女26例，年齡27～79歲，平均(53.4±10.85)歲，其中腫瘤大小<5 cm 者28例，≥5 cm者32例；同時選取平原地區(qū)新發(fā)胃癌患者60例，設(shè)立平原組(n=60)，其中男33例，女27例，年齡26～78歲，平均(55.4±11.20)歲，本研究通過我院倫理委員會審核。

1.1.2入選標(biāo)準(zhǔn) ①所有病例術(shù)前未行放、化療；②均簽訂知情同意書；③能堅持出院后隨訪且臨床資料齊備。兩組研究對象在年齡、性別比、就診時間、既往內(nèi)科疾病史相比無顯著性差異(P>0.05)?；颊呒捌浼覍俸炇饏⑴c該臨床研究的知情同意書

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) ①各類肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒感染者；②肝腎功能不全疾患者；③嚴(yán)重的心腦血管等疾病患者；④患者不愿接受試驗或轉(zhuǎn)院者。

1.1.4胃癌患者臨床資料的收集 根據(jù)2013衛(wèi)計委胃癌規(guī)范化診治指南(試行)，分析、收集、統(tǒng)計胃癌患者的姓名、性別、年齡、腫瘤的病理類型，按腫瘤的部位分為近端胃癌與遠(yuǎn)端胃癌；按腫瘤的大小分為≥5 cm者和<5 cm者；按照組織學(xué)分級分為分化較好組(高分化+中分化者)、分化較差組(低+未分化者)；按照腫瘤的浸潤深度分為侵及漿膜層及以外者和未侵及漿膜層者；按照有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；TNM 分期采用 2010 年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會(UICC/AJCC)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，分為Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期。

1.1.5主要試劑 實驗所用一抗，兔抗人HIF-1α(Rabbit anti-HIF-1α)，效價1∶50，購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，UltraSensitive S-P試劑盒(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒)，購于福州邁新生物制品公司。ReverTra Ace qPCR RT kit FSQ-101逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本Toyobo公司。THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix QPS-201定量PCR試劑盒購自日本Toyobo公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化SP法檢測兩組受試者胃癌組織的HIF-1α蛋白的表達(dá)水平 選取SP試劑盒，切取5 μm 厚的標(biāo)本組織切片，脫蠟、水化后滴加一滴非免疫性動物血清，室溫下孵育20 min后滴加一滴兔抗人HIF-1α單克隆抗體濃縮液用PBS緩沖液按1∶200稀釋成的工作液；滴加一滴PBS液作為陰性對照。結(jié)果判定：以棕色或棕黃色表達(dá)為陽性，其表達(dá)強度結(jié)果由染色細(xì)胞數(shù)評判，隨機觀察高倍鏡(×400倍)下5個視野的表達(dá)情況，取平均值。

1.2.2免疫熒光染色測定兩組受試者胃癌組織的HIF-1α的表達(dá)量 首先制作好的2 μm石蠟切片60℃烘烤60 min，然后將石蠟切片在二甲苯、無水乙醇和梯度乙醇中進(jìn)行常規(guī)脫蠟，蒸餾水水化，抗原修復(fù)：高壓修復(fù)，事先燒開鍋中的水，修復(fù)盒中加入0.01 mol/L檸檬酸鈉，上汽后加熱10 min，關(guān)火。修復(fù)盒取出，放入裝有自來水的瓷缸中緩慢冷卻至室溫。去除內(nèi)源性酶：玻片取出放入濕盒，加3%H2O2，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min。加入一抗(小鼠抗HIF-1α單克隆抗體，非特異性的小鼠 IgG作為陰性對照)孵育，4℃過夜，然后室溫下采用異FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG染色15 min。用PBS洗滌后，切片加入顯影液在辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素溶液孵育20 min。最后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液對核進(jìn)行重新染色。以天然樹脂膠封片。采用萊卡DM5000B顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察、分析并形成圖像。采用形態(tài)計量學(xué)軟件(IP Lab,Scanalytics,Rockville,MD)對圖像進(jìn)行量化描述。

1.2.3RT-PCR法檢測兩組受試者胃癌組織的miR-210的表達(dá)水平 取適量新鮮冰凍組織樣本進(jìn)行總RNA提取，采用Toyobo公司的試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)程序如下：37℃ 15 min，98℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA產(chǎn)物，用雙蒸水稀釋5～20倍后，置于-20℃冰箱保存。miRNA成熟體的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包含50 nmol/L莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物、1×反轉(zhuǎn)錄緩沖液、0.25 mmol/L dNTPs、0.25 U/μl RNase 抑制劑和3.33 U/μl鼠源白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶；反轉(zhuǎn)錄程序為16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 10 min。熒光定量 PCR 的反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，35個循環(huán)。

上游pri-miR-210 BglⅡ:5′GGAGATCTGACCA-GGTCATTTGCATAC3′;下游pri-miR-210 Eco RⅠ：5′GGGAATTCGATATGACCACACCTGTG3′。

2 結(jié)果

2.1兩組受試者胃癌組織的HIF-1α蛋白表達(dá)量的比較 高原組患者胃癌組織的HIF-1α蛋白表達(dá)量顯著高于平原組(P<0.05)，見表1、圖1。

2.2免疫熒光染色測定兩組受試者胃癌組織的HIF-1α表達(dá)量 高原組患者胃癌組織的HIF-1α含量顯著高于平原組(P<0.05)，見圖2。

2.3兩組受試者胃癌組織的miR-210的表達(dá)水平比較 高原組患者胃癌組織的miR-210的表達(dá)水平顯著高于平原組(P<0.05)，見圖3。

2.4胃癌患者HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 HIF-1α蛋白的表達(dá)與患者的年齡、性別之間的關(guān)系：男性胃癌患者中，陽性者為21例(21/34)，陰性者為13例(13/34)，女性胃癌患者中，陽性者為15例(15/26)，陰性者為11例(11/26)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.747 9，故說明HIF-1α與腫瘤患者的性別不相關(guān)。高齡(≥60歲)胃癌患者中，陽性者為20例(20/31)，陰性者為11例(11/31)，非高齡(<60歲)胃癌患者中，陽性者為16例(16/29)，陰性者為13例(13/29)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.460 3，故說明HIF-1α與腫瘤患者的年齡不相關(guān)。所以，HIF-1α在胃癌中的陽性表達(dá)與胃癌患者的性別(P=0.747 9)、年齡(P=0.460 3)不相關(guān)。

GroupsSalinePlainsgroup157.75±20.36Plateaugroup205.69±27.69t10.695P0.018

圖1 兩組受試者胃癌組織的HIF-1α蛋白表達(dá)量的比較(SP×400)Fig.1 Comparison of HIF-1α protein expression in gastric cancer tissues between two groups of patients(SP×400) Note: A.Plains group；B.Plateau group.

高原組HIF-1α蛋白的表達(dá)與腫瘤的體積間的關(guān)系：腫瘤較大(≥5 cm)的胃癌患者中，陽性者為24例(24/40)，陰性者為16例(16/40)，腫瘤較小(<5 cm)的胃癌患者中，陽性者為12例(12/20)，陰性者為8例(8/20)，經(jīng)χ2檢驗，P=1.000 0，故說明HIF-1α與腫瘤的大小不相關(guān)。

高分化的胃癌中陽性者為20例(20/27)，陰性者為7例(7/27)，低分化和未分化胃癌中陽性者為16例(16/33)，陰性者為17例(17/33)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.044 1，故說明HIF-1α與腫瘤的分化程度相關(guān)；分化程度越好的腫瘤，HIF-1α陽性率越高。T1/T2期的胃癌中陽性者為6例(6/16)，陰性者為10例(10/16)，T3/T4期胃癌中陽性者為30例(30/44)，陰性者為14例(14/30)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.031 9，故說明HIF-1α與腫瘤的浸潤深度相關(guān)；T分期越晚，浸潤深度越深，HIF-1α陽性率越高。存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中陽性者為28例(28/40)，陰性者為12例(12/40)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中陽性者為8例(8/20)，陰性者為12例(12/20)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.025 3，故說明HIF-1α與腫瘤是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者中HIF-1α陽性率越高，HIF-1α陽性的胃癌患者可能易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。TNM分期為Ⅰ/Ⅱ期的胃癌患者，陽性者為7例(7/18)，陰性者為11例(11/18)，Ⅲ/Ⅳ期的胃癌患者，陽性者為29例(29/42)，陰性者為13例(13/42)，經(jīng)χ2檢驗，P=0.028 9，故說明HIF-1α與腫瘤的分期相關(guān)；TNM分期越早，HIF-1α陽性率越低，反之HIF-1α陽性率越高。 所以，HIF-1α在胃癌中的陽性表達(dá)與腫瘤的分化(P=0.044 1)、浸潤深度(P=0.031 9)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.025 3)及TNM分期(P=0.028 9)相關(guān)(表2)。

圖2 兩組受試者胃癌組織的HIF-1α表達(dá)量的比較Fig.2 Comparison of HIF-1α expression in gastric cancer tissues between two groups of patients

圖3 兩組受試者胃癌組織的miR-210的表達(dá)水平的比較Fig.3 Comparison of expression levels of miR-210 in two groups of gastric cancer tissuesNote: A.Plains group;B.Plateau group.

表2胃癌患者HIF-1α的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

Tab.2RelationshipbetweenexpressionofHIF-1αandclinicopathologicalfeaturesinpatientswithgastriccancer

ClinicalcharactersnHIF-1α+-χ2PGenderMale3421130.10180.7479Female261511Age<602916130.54510.4603≥60312011Tumorsize<5cm201280.00001.0000≥5cm402416TumordifferentiationHighly/moderately272074.05160.04411)Poorly/undifferentiated331617TumorinfiltrationT1/T2166104.60230.03191)T3/T4443014LymphnodesmetastaticNegative208125.63900.02531)Positive402812TNMstagesⅠ/Ⅱ187114.77510.02891)Ⅲ/Ⅳ422913

3 討論

青海省平均海拔2 300～3 000米左右屬高原地勢,人群長期處于高寒、低氧環(huán)境中，易造成人體血管的收縮，血液黏稠度增高并加重組織缺血缺氧，胃黏膜亦處于低氧狀態(tài)，可導(dǎo)致胃黏膜屏障受損和幽門螺旋桿菌(Hp)的定植[3,4]。故而，從低氧對胃癌發(fā)生、發(fā)展的作用機制著手，是研究高原地區(qū)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移分子機制的一個重要突破口。

HIF-1α作為低氧感知分子在低氧信號通路中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[5,6]。低氧條件下，細(xì)胞中的 HIF-1α穩(wěn)定并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，通過與低氧反應(yīng)元件(HRE)結(jié)合來調(diào)控細(xì)胞存活、增殖和分化等[7]。miR-210通過其靶基因參與對細(xì)胞存活、凋亡、線粒體代謝、DNA 損傷修復(fù)和血管生成等過程，被認(rèn)為是microRNA低氧標(biāo)志，研究證明 HIF-1ɑ能夠與miR-210轉(zhuǎn)錄起始位點上游40 bp 處的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控 miR-210 的表達(dá)[8-11]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，HIF-1α通過上調(diào)促紅細(xì)胞生成素(EPO)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、運鐵蛋白受體和血漿銅藍(lán)蛋白等增加紅細(xì)胞或者上調(diào)紅細(xì)胞中亞鐵血紅素的生成來提高紅細(xì)胞的輸氧能力[12-18]；通過上調(diào)胰島素樣生長因子2(IGF2)和轉(zhuǎn)化生長因子Ⅱ(TGF-Ⅱ)等生長因子的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活[19]。此外，當(dāng)嚴(yán)重缺氧造成細(xì)胞損傷時，HIF-1α能通過上調(diào)B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)等促凋亡基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20]。

綜上所述，低氧環(huán)境下胃癌組織中HIF-1α水平顯著增加，并且HIF-1α能通過miR-210促進(jìn)胃癌細(xì)胞進(jìn)展，同時HIF-1α在胃癌中的陽性表達(dá)與腫瘤的分化(P=0.044 1)、浸潤深度(P=0.031 9)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.025 3)及TNM分期(P=0.028 9)相關(guān)。

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ExpressionofHIF-1αintissuesofgastriccancerandmolecularmechanism

MAYu-Bin,YANSu,YUPeng-Jie,BAIZhen-Zhong.

TheAffiliatedHospitalofQinghaiUniversity,GastrointestinalTumorSurgery,Xining810001，China

Objective:To analyze the expression levels of the HIF-1α in the tissues of gastric cancer and the molecular mechanism in the pathogenesis of the gastric cancer.MethodsA total of 60 patients resided at the Hehuang valley in Qinghai province and diagnosed to gastric cancer were collected to plateau group.And the 60 patients resided at the plains(Shenzhen) and diagnosed to gastric cancer were collected to plains group.The specimens of gastric cancer in two groups were collected.The levels of HIF-1α protein were detected by the SP method of the immunological histochemistry and compared between two groups.The levels of HIF-1α gene were detected by the RT-PCR and compared between two groups.And the levels of miR-210 were detected by the RT-PCR and compared between two groups.To analyze the relationship between the expression of HIF-1α and clinicopathological features in patients with gastric cancer.ResultsThe levels of HIF-1α protein in plateau group were higher than in plains group(P<0.05).The levels of HIF-1α gene in plateau group were higher than in plains group(P<0.05).The levels of miR-210 in plateau group were higher than in plains group(P<0.05).The positive expression of HIF-1α in gastric cancer was related to tumor differentiation(P=0.044 1),invasion depth(P=0.031 9),lymph node metastasis(P=0.025 3) and TNM staging(P=0.028 9).ConclusionThe expression levels of the HIF-1α in the tissues of gastric cancer are upregulated under hypoxia environment,and the HIF-1α can improve the development of the gastric cancer.

Hypoxia inducible factor-1;Gastric cancer;miR-210;Molecular mechanism

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.009

R735.2

A

1000-484X(2017)12-1799-05

馬玉濱(1979年-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事胃腸腫瘤外科臨床和基礎(chǔ)研究。

[收稿2017-08-01 修回2017-08-30]

(編輯 倪 鵬)