李 蕊

(西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安 710077)

PHB對高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞中活性氧及細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究①

李 蕊

(西安外事學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安 710077)

目的探討抗增殖蛋白(PHB)對高糖誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響以及機(jī)制研究。方法選取pCDNA3-PHB、pCDNA3-NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和高糖干預(yù)心肌細(xì)胞，實驗分為4組：正常對照組(Control組)、高糖刺激組(HG組)、高糖+空載體組(HG+pCDNA3-NC組)、高糖加pCDNA3-PHB重組質(zhì)粒組(HG+pCDNA3-PHB)；Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞中PHB蛋白、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2 相關(guān)X 蛋白(Bax)/B 細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、剪切的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(c-caspase3)、蛋白激酶B(AKt)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKt)蛋白的表達(dá)量，二氫乙啶(DHE)染色法檢測高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平，實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的測定 ，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果pCDNA3-PHB重組質(zhì)?？墒筆HB表達(dá)量增加；與Control組相比，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞凋亡率顯著增高(P<0.05)；與HG組相比，HG+pCDNA3-NC組細(xì)胞凋亡率變化不顯著(P>0.05)；HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。與Control組相比，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、Bax/Bcl-2的相對表達(dá)量、c-caspase3(P<0.05)蛋白相對表達(dá)量顯著增高；與HG組相比，HG+pCDNA3-NC組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平(P>0.05)、TNF-α mRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/Bcl-2的相對表達(dá)量(P>0.05)、c-caspase3蛋白相對表達(dá)量(P>0.05)無明顯差異；但pCDNA3-PHB組細(xì)胞中ROS的水平(P<0.05)、TNF-α mRNA(P<0.05)、IL-6 mRNA(P<0.05)、Bax/Bcl-2的相對表達(dá)量(P<0.05)、c-caspase3(P<0.05)蛋白相對表達(dá)量明顯降低。經(jīng)統(tǒng)計分析顯示，各組細(xì)胞中AKt蛋白的相對表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。經(jīng)比較后，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞中p-AKt蛋白的相對表達(dá)量顯著低于Control組(P<0.05)；HG+pCDNA3-NC組心肌細(xì)胞中p-AKt蛋白的相對表達(dá)量與HG組間無顯著差異(P>0.05)；但HG+pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞中p-AKt蛋白的相對表達(dá)量明顯高于HG組(P<0.05)。結(jié)論P(yáng)HB過表達(dá)可抑制高糖環(huán)境下H9C2心肌細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)，主要是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路、ROS、Bax/Bcl-2、c-caspase3蛋白的水平，為糖尿病心肌病的治療提供新的思路與方法。

PHB；心肌細(xì)胞；ROS；Bax/Bcl-2；c-caspase3；Akt

近年來，機(jī)體自身代謝紊亂逐漸成為影響人類健康的慢性疾病之一，其中以糖尿病最為嚴(yán)重[1,2]。若機(jī)體長期發(fā)生糖代謝異常會引起各種并發(fā)癥，且死亡率極高[3]。糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，主要是由于高糖環(huán)境下導(dǎo)致心肌細(xì)胞受到損傷而導(dǎo)致的增殖、凋亡機(jī)制異常，最終引起心臟功能障礙的一種疾病。糖脂代謝紊亂和氧化應(yīng)激可能是引起糖尿病心肌病的重要原因[4]?？乖鲋车鞍?Prohibitin，PHB)普遍存在于線粒體內(nèi)膜上，是進(jìn)化中具有高度保守性的蛋白[5]。據(jù)研究PHB在細(xì)胞代謝、生長、凋亡以及糖尿病等多方面發(fā)揮重要作用[6，7]。PHB發(fā)揮作用主要通過與轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物和線粒體抗凋亡蛋白相互作用從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡[8]。但PHB對糖尿病心肌細(xì)胞功能的影響以及作用機(jī)制尚不完全清楚。因此本實驗通過體外模擬糖尿病心肌細(xì)胞的高糖狀態(tài)研究PHB對H9C2心肌細(xì)胞凋亡的影響以及作用機(jī)制，以期為糖尿病心肌病治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料 H9C2心肌細(xì)胞購自北京北納生物技術(shù)有限公司，胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；抗體均購自英國Abcam公司；pCDNA3-PHB過表達(dá)載體購自吉滿生物科技(上海)有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen 公司；DHE檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞培養(yǎng)：H9C2心肌細(xì)胞在5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，0.25%胰酶消化，更換新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2～3 d更換新的培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及干預(yù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長的H9C2心肌細(xì)胞胰酶消化后以5×104個/孔細(xì)胞接種于六孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入10 μl脂質(zhì)體Lipofectamine 2000，室溫靜置5 min，pCDNA3-PHB組加入pCDNA3-PHB重組質(zhì)粒，pCDNA3-NC組加入空載體，Normal組為未作處理的細(xì)胞，以β-actin為內(nèi)參，Western blot 檢測PHB蛋白的相對表達(dá)量。

以高糖對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)：實驗分為4組：正常對照組(Control組)、高糖刺激組(HG組)、高糖+空載體組(HG+pCDNA3-NC組)、高糖加pCDNA3-PHB重組質(zhì)粒組(HG+pCDNA3-PHB)。

1.2.2高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中活性氧的測定 使用二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)染色法檢測H9C2心肌細(xì)胞活性氧的表達(dá)情況。取高糖刺激48 h的心肌細(xì)胞置于六孔板中，加入DHE、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基，放入37℃恒溫箱中避光培養(yǎng)30 min，然后緩沖液沖洗3次，熒光顯微鏡下檢測活性氧的水平。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞的凋亡率 取各組H9C2心肌細(xì)胞，胰酶消化，使細(xì)胞的濃度為1×106個/ml，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，緩沖液清洗3次，加入5 μl Annexin V-FITC/PI，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4Western blot檢測Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表達(dá)量 取各組細(xì)胞置于EP管中，每管加入300 μl蛋白裂解液，12 000 r/min離心10 min，加入5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min左右，BCA法測定提取的蛋白質(zhì)濃度。10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF上，5%的脫脂牛奶封閉30 min，加入一抗孵育過夜后TBST清洗3遍，加入二抗孵育 2 h，滴加電化學(xué)發(fā)光顯色液測定灰度值，與內(nèi)參β-actin的灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測細(xì)胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的測定 按照細(xì)胞提取RNA試劑盒說明書進(jìn)行操作，提取細(xì)胞中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測細(xì)胞完整性和純度，調(diào)整RNA濃度，-80℃保存。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)Gene bank上IL-1β和IL-6的序列設(shè)計PCR引物，TNF-α的引物上游序列為5-CATTCCTGCTCGTGGCGGGG-3，下游序列為5-CGACGTGGGCTACG-GGCTTG-3，IL-6的引物上游序列為5-GTCTCGAGC-CCACCAGGAACG-3，下游序列為5-AGGGAAGGCAGTGGCTGTCAAC-3。定量PCR的反應(yīng)程序為預(yù)變性94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火50℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，40 cycle，終延伸72℃ 5 min ，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，實驗重復(fù)3次，取其平均數(shù)，用2-ΔΔCt法計算各組mRNA的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1Western blot檢測PHB蛋白的表達(dá)量 Western blot檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3-PHB和空載質(zhì)粒后PHB蛋白的表達(dá)水平。如圖1、表1所示，pCDNA3-PHB組、pCDNA3-NC組、Normal組蛋白的相對表達(dá)量分別為(1.625±0.249)、(0.762±0.094)、(0.813±0.096)；與Normal組相比，pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞中PHB蛋白的相對表達(dá)量明顯增高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，pCDNA3-NC組和Normal組間差異不明顯(P>0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染后H9C2心肌細(xì)胞中PHB蛋白的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of PHB protein in transfected H9C2 cellsNote: 1.Normal group;2.pCDNA3-NC group;3.pCDNA3-PHB group.

GroupsPHBrelativeexpressionNormal0.813±0.096pCDNA3-NC0.762±0.094pCDNA3-PHB1.625±0.2491)

Note：Compared with normal group,1)P<0.05.

2.2PHB對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中活性氧的影響 二氫乙啶(Dihydroethidium，DHE)染色高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，可通過流式細(xì)胞術(shù)檢測反映，見圖2。如表2所示，Control組中ROS的值為(0.998±0.036)，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組的相對值分別為(4.013±0.365)、(4.168±0.401)、(1.963±0.124)；經(jīng)統(tǒng)計分析，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平明顯高于Control對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞內(nèi)ROS的水平顯著低于HG組、HG+pCDNA3-NC組(P<0.05)。

2.3PHB對高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞的凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測PHB過表達(dá)對高糖環(huán)境下的H9C2心肌細(xì)胞凋亡率的影響。結(jié)果如圖3、表3所示，Control組、HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞的凋亡率分別為(8.132±0.561)%、(25.385±2.487)%、(26.159±2.169)%、(16.487±1.952)%；與Control組相比，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞的凋亡指數(shù)顯著增高(P<0.05)；與HG+pCDNA3-NC組相比，HG+pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞的凋亡率明顯降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+pCDNA3-NC組心肌細(xì)胞凋亡率沒有顯著差異(P>0.05)，HG+pCDNA3- PHB組可顯著降低心肌細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。

圖2 PHB對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞活性氧(ROS)的影響Fig.2 Effect of PHB to cardiomyocytes reactive oxygen species(ROS) under high glucoseNote: A.Control group;B.HG group;C.HG+pCDNA3-NC group;D.HG+pCDNA3-PHB group.

2.4PHB對高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表達(dá)量的影響 結(jié)果如圖4、表4所示，Control組、HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞中Bax/Bcl-2的相對表達(dá)量分別為(0.462±0.048)、(1.698±0.459)、(1.586±0.874)、(0.823±0.091)；剪切的c-caspase3蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.985±0.084)、(2.456±0.358)、(2.511±0.478)、(1.652±0.625)；蛋白激酶B(AKt)蛋白的相對表達(dá)量分別為(0.991±0.074)、(0.982±0.083)、(0.987±0.086)、(0.979±0.085)；磷酸化AKt(p-AKt)蛋白的相對表達(dá)量分別為(2.783±0.464)、(0.974±0.079)、(0.989±0.084)、(1.578±0.365)；與Control組相比，HG組、

GroupsROSrelativevalueControl0.998±0.036HG4.013±0.3651)HG+pCDNA3-NC4.168±0.4011)HG+pCDNA3-PHB1.963±0.124

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

GroupsApoptoticrateofcardiomyocytes(%)Control8.132±0.561HG25.385±2.4871)HG+pCDNA3-NC26.159±2.1691)HG+pCDNA3-PHB16.487±1.952

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞中Bax/Bcl-2(P<0.05)、c-caspase3(P<0.05)的相對表達(dá)量顯著增加，p-AKt蛋白的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與HG組相比，HG+pCDNA3-NC組心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2、c-caspase3、p-AKt蛋白的相對表達(dá)量差異沒有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞中Bax/Bcl-2和c-caspase3蛋白的相對表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，p-AKt表達(dá)明顯升高。

2.5qRT-PCR檢測細(xì)胞中TNF-α mRNA和IL-6 mRNA含量的測定 結(jié)果如表5所示，Control組、HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組細(xì)胞的TNF-α mRNA為(2.623±0.286)、(5.592±0.550)、(5.650±0.591)、(3.672±0.344)；IL-6mRNA為(1.877±0.262)、(4.156±0.480)、(4.298±0.552)、(3.112±0.421)。與Control組相比，HG組、HG+pCDNA3-NC組、HG+pCDNA3-PHB組心肌細(xì)胞的TNF-α mRNA、IL-6 mRNA顯著增高(P<0.05)；與HG組相比，HG+pCDNA3-NC組心肌細(xì)胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA沒有顯著差異(P>0.05)，HG+pCDNA3-PHB組可顯著降低心肌細(xì)胞中TNF-α mRNA、IL-6 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。

圖3 PHB對高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡率的影響Fig.3 Effect of PHB to cardiomyocytes apoptosis rate under high glucoseNote: A.Control group;B.HG group;C.HG+pCDNA3-NC group;D.HG+pCDNA3-PHB group.

GroupsProteinrelativeexpressionBax/Bcl-2c-caspase3AKtp-AKtControl0.462±0.0480.985±0.0840.991±0.0742.783±0.464HG1.698±0.4591)2.456±0.3581)0.982±0.0830.974±0.0791)HG+pCDNA3-NC1.586±0.8741)2.511±0.4781)0.987±0.0860.989±0.0841)HG+pCDNA3-PHB0.823±0.0911.652±0.6250.979±0.0851.578±0.365

Note：Compared with control group,1)P<0.05.

圖4 Western blot檢測心肌細(xì)胞Bax/Bcl-2、c-caspase3、AKt、p-AKt蛋白表達(dá)量Fig.4 Expression of Bax/Bcl-2，c-caspase3，AKt and p-AKt protein in cardiomyocytes by Western blotNote: 1.Control group;2.HG group;3.HG+pCDNA3-NC group;4.HG+pCDNA3-PHB group.

GroupsTNF-αIL-6Control2.623±0.2861.877±0.262HG5.592±0.5501)4.156±0.4801)HG+pCDNA3-NC5.650±0.5911)4.298±0.5521)HG+pCDNA3-PHB3.672±0.3443.112±0.421

Note：Compared with Control group,1)P<0.05.

3 討論

PHB屬于細(xì)胞膜蛋白超家族蛋白之一，在正常人體細(xì)胞中廣泛存在，發(fā)揮多種作用，是一種進(jìn)化保守、表達(dá)廣泛的基因。研究顯示，PHB在細(xì)胞的能量代謝、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用[9,10]。PHB是常見的分子伴侶，可以通過抑制丙酮酸羧化酶的作用，調(diào)控細(xì)胞新陳代謝[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PHB過表達(dá)可調(diào)節(jié)新陳代謝的氧化磷酸化轉(zhuǎn)化為無氧酵解，降低糖分解，從而改善體內(nèi)糖代謝[12]。PHB可作用于細(xì)胞周期中重要的轉(zhuǎn)錄因子E2F從而抑制細(xì)胞的增殖[13]。同時PHB還可與多種抗凋亡因子結(jié)合從而調(diào)控細(xì)胞的凋亡[11]。成年心肌細(xì)胞屬于非再生型細(xì)胞，無增殖能力，細(xì)胞若長期受損或者凋亡將會導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失，嚴(yán)重影響心室的收縮與舒張功能，是心臟功能障礙的重要原因之一。本實驗發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡，但PHB過表達(dá)后拮抗高糖促進(jìn)凋亡細(xì)胞的作用，說明PHB的表達(dá)量在一定程度上抑制糖尿病心肌細(xì)胞的凋亡，有助于緩解糖尿病心肌病的惡化。

活性氧(ROS)是機(jī)體受到刺激時產(chǎn)生的一組不穩(wěn)定、含氧的活性分子化合物的統(tǒng)稱，具有較高的化學(xué)活性，對生物體以及細(xì)胞的生理活動起重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)機(jī)體處于生理狀態(tài)下且無外界刺激時，ROS的分泌量較少，對調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、免疫、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理過程有重要作用。有研究證明當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)下或者受到某些因素的刺激下，ROS的分泌量增多，可與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、細(xì)胞器、DNA等分子相互作用，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞受到損傷或者促進(jìn)其凋亡，從而誘導(dǎo)疾病的產(chǎn)生[14]。Fiorini等[15]的研究報道指出高濃度的ROS和抗氧化損傷防御系統(tǒng)的缺陷可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，這為藥物誘導(dǎo)ROS的生成治療疾病提供了理論依據(jù)。據(jù)報道ROS可通過介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的凋亡過程[16]。TNF-α 和IL-6是重要的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，并參與某些自身免疫病的病理損傷。本實驗結(jié)果顯示，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)H9C2心肌細(xì)胞中的ROS、TNF-α 、IL-6的生成增多，但PHB過表達(dá)可以改善高糖環(huán)境下ROS、TNF-α 、IL-6的生成，說明PHB可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞體內(nèi)的ROS、TNF-α 、IL-6的生成從而影響心肌細(xì)胞的凋亡率，但具體的作用機(jī)制還不完全清楚。

Bax和 Bcl-2是調(diào)控細(xì)胞凋亡過程的重要因子，位于細(xì)胞質(zhì)中，其中Bax促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，Bcl-2抑制細(xì)胞的凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被激活引起促凋亡蛋白Bax的活性，使線粒體膜的通透性增加，大量細(xì)胞色素C穿過膜組織進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。但當(dāng)Bax活性增強(qiáng)時，Bcl-2可與其形成異源二聚體減少線粒體膜的通透性，抑制Bax的促凋亡作用[18]。因此二者的比例對細(xì)胞凋亡途徑起到重要作用。c-caspase3是細(xì)胞凋亡途徑的核心蛋白酶，在各種凋亡程序中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[19]。根據(jù)多方研究表明機(jī)體異常狀態(tài)下激活磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號通路[20，21]，調(diào)節(jié)其下游的多種效應(yīng)分子從而促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。本實驗結(jié)果顯示高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中Bax蛋白、c-caspase3蛋白的表達(dá)量增加，Bcl-2蛋白、p-AKt蛋白的表達(dá)量降低；PHB可通過調(diào)節(jié)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞中Bax/Bcl-2的比值和PI3K/Akt信號通路，降低c-caspase3蛋白的相對表達(dá)量，降低細(xì)胞的凋亡率。

綜上所述，PHB過表達(dá)通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路、ROS、Bax/Bcl-2、c-caspase3的表達(dá)量，抑制炎癥反應(yīng)，降低心肌細(xì)胞凋亡率，防止DCM進(jìn)一步惡化，為DCM治療新方法的創(chuàng)建提供理論依據(jù)。

[1] 王洪光，簿其秀，王竹文.亞麻酸改善高血壓老年患者血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用機(jī)制[J].中國免疫學(xué)雜志，2016，32(11)：1678-1681.

[2] Fang Q,Wang J,Wang L,etal.Attenuation of inflammatory response by a novel chalcone protects kidney and heart from hyperglycemia-induced injuries in type 1 diabetic mice[J] .Toxicol Appl Pharmacol,2015,288(2):179-191.

[3] Yilmaz S,Canpolat U,Aydogdu S,etal.Diabetic cardiomyopathy;summary of 41 years[J].Korean Circ J,2015,45(4),266-272.

[4] He C,Jin ZS,Zhang HZ,etal.Improvement of hedysarum polybotrys polysacchcaideon on myocardial damage of db/db mice with diabetic cardiomyopathy[J].Chin J Clin Pharmacol,2017,33(5),418-422.

[5] Li Z,Feng H.Research of prohibitin on mitochondrial biological functions[J].Tianjin Science Technol,2016,43(4),37-40.

[6] Wang Q,Leader A,Tsang BK.Follicular stage-dependent regulation of apoptosis and steroidogenesis by prohibitin in rat granulosa cells[J].J Ovarian Res,2013,6(1):23-23.

[7] Zhou TB,Zeng ZY,Qin YH,etal.Less expression of prohibitin is associated with increased paired box 2(pax2)in renal interstitial fibrosis rats[J].Int J Mole Sci,2012,17(2):189-196.

[8] Fang W,Feng H.Biological functions of PHB and the relationship with mitochondrial oxidative phosphorylation[J].Tianjin Sci Technol,2016,43(4)：41-45.

[9] Peng YT,Chen P,Ouyang RY,etal.Multifaceted role of prohibitin in cell survival and apoptosis[J].Apoptosis,2015,20(9):1135-1149.

[10] Zhong X,Song X,Wang N,etal.Molecular identification and characterization of prohibitin from echinococcus granulosus[J].Parasitol Res,2016,115(2):897-902.

[11] Fang W,Feng H.Research progress of the relationship between PHB and carbohydrate metabolism and fat metabolism[J].Tianjin Science and Technology,2016,43(5)：30-33.

[12] Qi X,Zhang Y,Ji H,etal.Knockdown of prohibitin expression promotes glucose metabolism in eutopic endometrial stromal cells from women with endometriosis[J].Reprod Biomed Online,2014,29(6)：761-770.

[13] Pellicelli M,Picard C,Wang DS,etal.E2f1 and tfdp1 regulate pitx1 expression in normal and osteoarthritic articular chondrocytes[J].PLoS One,2016,11(11)：e0165951.

[14] Kang SW,Lee S,Lee EK.ROS and energy metabolism in cancer cells:alliance for fast growth[J].Arch Pharm Res,2015,38(3)：338-345.

[15] Fiorini C,Cordani M,Gotte G,etal.Onconase induces autophagy sensitizing pancreatic cancer cells to gemcitabine and activates Akt/mTOR pathway in a ROS-dependent manner[J].Biochim Biophys Acta,2015,1853(3):549-560.

[16] Li L,Li M,Li Y,etal.Exogenous H2S contributes to recovery of ischemic post-conditioning-induced cardioprotection by decrease of ROS level via down-regulation of NF-κB and JAK2-STAT3 pathways in the aging cardiomyocytes[J].Cell Biosci,2016,6(1)：26-32.

[17] Niu ZR,Xu XN,Chen YC,etal.Protective effect of Salvianolic acid A against isoproterenol-induced myocardial infarction in mice[J].Chin Pharmacol Bull,2015,31(12)：1667-1674.

[18] Xie RH,Zhou SHJ,Yin M,etal.Effect of N-Acetyl-L-cysteine on protection research in H2O2-Induced mesenchymal stem cells apoptosis[J].Chin Pharmacol Bull,2014,30(1):54-59.

[19] Xiao D,Yang RD,Tian HM,etal.Effect of acupuncture combined hypothermia on Bcl-2,Bax and Caspase-3 expressions of cerebral ischemia reperfusion injury rats[J].J Hunan Univ CM,2016,36(2)：58-61.

[20] Nicolini A,Ferrari P,Kotlarova L,etal.The PI3K-AKt-mTOR pathway and new tools to prevent acquired hormone resistance in breast cancer[J].Cur Pharmaceutical Biotechnol,2015,16(9)：804-815.

[21] Faes S,Dormond O.PI3K and AKT:Unfaithful partners in cancer[J].Int J Mol Sci,2015,16(9)：21138-21152.

StudyeffectsandmechanismofPHBonreactiveoxygenspeciesandapoptosisincardiomyocytesunderhighglucose

LIRui.

Xi′anExternalAffairsInstituteSchoolofMedicine，Xi′an710077,China

Objective:To investigate the effect and mechanism of PHB on the apoptosis of H9C2 cardiomyocytes under high glucose.MethodsSelect pCDNA3-PHB and pCDNA3-NC recombinant plasmid transfect into cardiomyocytes and effected by high glucose.The experiment were divided into four groups:control group,high glucose group(HG group),high glucose+ empty vector group(HG+ pCDNA3-NC group),high glucose+ pCDNA3-PHB plasmid group(HG+ pCDNA3-PHB group).The expression of PHB,Bax/Bcl-2,c-caspase3,AKt and p-AKt protein after transfected were detected by Western blot.ROS were detected under high glucose by DHE staining.The TNF-α mRNA and IL-6 mRNA were detected by Real-time quantitative PCR(qRT-PCR).Flow cytometry was used to detect the apoptotic rate.ResultsThe recombinant plasmid pCDNA3-PHB could increase the expression of PHB.The apoptotic rate of HG group,HG+ pCDNA3-NC group and HG+ pCDNA3-PHB group were significantly higher than control group(P<0.05).Compared with HG group,the apoptotic rate of HG+ pCDNA3-NC group was not significant(P> 0.05),but that of HG+ pCDNA3-PHB group was significantly lower(P<0.05).The levels of ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA，Bax/Bcl-2 and c-caspase3(P<0.05) protein in the HG group,HG+ pCDNA3-NC group,HG+ pCDNA3-PHB group were significantly higher than the control group.Compared with HG group,the level of ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA,Bax/Bcl-2 and c-caspase3 (P>0.05)protein in the HG+ pCDNA3-NC group were no significant difference,but the ROS,TNF-α mRNA,IL-6 mRNA、Bax/Bcl-2 and c-caspase3 (P<0.05)protein in the HG+ pCDNA3-PHB group were significantly decreased.Statistical analysis showed that there was no significant difference of AKt protein in each group(P> 0.05).The relative expression of p-AKt protein in HG group,HG+ pCDNA3-NC group and HG+ pCDNA3-PHB group were significantly lower than that in control group(P<0.05),HG+ pCDNA3-NC group was no significantly different than HG group(P> 0.05),However,HG+ pCDNA3-PHB group was significantly higher than HG group(P<0.05).ConclusionPHB overexpression can inhibit the apoptosis of H9C2 cardiomyocytes in high glucose environment,andreduce the inflammatory response by effected the regulation of PI3K/Akt signaling pathway,reduced ROS,Bax/Bcl-2,c-caspase3 protein levels,that give us a new ideas and methods of DCM.

PHB；Cardiomyocytes；ROS；Bax/Bcl-2；c-caspase3；Akt

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.007

R329.2

A

1000-484X(2017)12-1789-06

①本文受陜西省科技廳社會發(fā)展公關(guān)項目(2016SF-220)資助。

李 蕊(1982年-)，女，碩士,副教授，主要從事慢性病防治方面的研究,E-mail:alaalachong@163.com。

[收稿2017-07-14]

(編輯 許四平 劉格格)