米旭光 李首慶 劉 磊 蘆小單 方艷秋 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心,長春 130021)

p21蛋白激活激酶4在乳腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用研究①

米旭光 李首慶 劉 磊 蘆小單 方艷秋 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)診治實(shí)驗(yàn)中心,長春 130021)

目的探討p21蛋白激活激酶4(PAK4)在乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用。方法在乳腺癌MCF7細(xì)胞中超表達(dá)PAK4，而在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中干擾PAK4表達(dá)，通過遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測其對乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響，熒光定量法和免疫印跡分析檢測PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，免疫印跡法檢測EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子Snail、Slug表達(dá)量變化。結(jié)果MCF7細(xì)胞超表達(dá)PAK4后，細(xì)胞的遷移侵襲能力顯著增加，并且上皮標(biāo)志分子E-Cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志分子N-Cadherin和Vimentin蛋白則表達(dá)上調(diào)，EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄激活因子Slug表達(dá)量增加；MDA-MB-231細(xì)胞中，抑制內(nèi)源PAK4表達(dá)能顯著降低細(xì)胞的遷移侵襲能力，上調(diào)E-Cadherin蛋白表達(dá)，下調(diào)N-Cadherin、Vimentin和Slug蛋白的表達(dá)。結(jié)論P(yáng)AK4通過上調(diào)Slug促進(jìn)乳腺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可作為抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子靶點(diǎn)。

乳腺癌；p21蛋白激活激酶4；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

發(fā)生轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要因素，乳腺癌轉(zhuǎn)移常伴隨著對常規(guī)療法的耐受，因此極難治愈，五年生存率低于25%，平均生存時(shí)間只有18～30個(gè)月[1，2]。p21激活激酶4(p21-activated kinase，PAK4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，進(jìn)化上高度保守，在正常乳腺組織中低水平表達(dá)，在大多數(shù)乳腺癌中異常高表達(dá)，促進(jìn)了乳腺腫瘤惡性進(jìn)展，與腫瘤發(fā)生的多種標(biāo)志現(xiàn)象密切相關(guān)，如非停泊性生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活、轉(zhuǎn)移和侵襲等[3-5]。有研究顯示PAK4蛋白在乳腺腫瘤惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，另外PAK4過表達(dá)會(huì)使上皮來源的乳腺癌去上皮特征發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化[6]。因此，PAK4可能是乳腺癌中EMT發(fā)生的關(guān)鍵基因，故探索PAK4與乳腺癌EMT的關(guān)系機(jī)制，對于乳腺癌的治療干預(yù)及新治療靶點(diǎn)的發(fā)掘具有重要的科學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 Transwell小室購自Corning公司、基質(zhì)膠購自Sigma公司、Lip2000購自Thermo公司、鼠抗PAK4、GAPDH、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自CST公司、pRNAT-U6.1/Hygro-PAK4干擾載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、熒光定量試劑購自Roche公司、其他化學(xué)試劑購自北京化工。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞和乳腺癌MCF7細(xì)胞，用含10%新生牛血清(Corning公司)的DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，添加含青霉素100 U/ml，鏈霉素100 μg/ml，37℃ 5%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)傳代。

1.2.2脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染 在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種1×106個(gè)細(xì)胞,24 h后將細(xì)胞培養(yǎng)液換成無雙抗血清的不完全培養(yǎng)液。在250 μl無雙抗血清培養(yǎng)液中按說明書比例混合脂質(zhì)體與待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，室溫孵育20 min，將混合液加入到細(xì)胞中并混勻。培養(yǎng)5 h后，將培養(yǎng)液換成完全培養(yǎng)液。

1.2.3免疫印跡分析 細(xì)胞總蛋白加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min,選擇12%SDS-PAGE預(yù)制膠進(jìn)行常規(guī)電泳，轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)印膜封閉24 h，洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次，標(biāo)記一抗(1 000倍稀釋)室溫1.5 h，洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次，標(biāo)記羊抗鼠/兔二抗(1 000倍稀釋)，洗液清洗轉(zhuǎn)印膜3次，ECL顯影。

1.2.4熒光定量分析 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用SYBR Green法定量檢測PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)量。按試劑說明書要求制備反應(yīng)管，ABI 7500中95℃預(yù)變性30 s，然后40循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)(95℃ 5 s，60℃ 34 s)，同時(shí)熔解曲線分析，結(jié)果與內(nèi)參作比表示mRNA拷貝數(shù)。定量檢測引物序列PAK4、E-Cadherin、N-Cadherin、Vimentin和GAPDH[7,8]。

1.2.5遷移、侵襲能力的檢測 換用無血清的DMEM培養(yǎng)基24 h后重懸細(xì)胞，在Transwell小室中接種200 μl細(xì)胞(濃度1×105ml-1)(侵襲實(shí)驗(yàn)則在小室內(nèi)預(yù)鋪Matrigel膠)，在下室中加入600 μl含有20%血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h。PBS沖洗小室，95%的乙醇固定小室，擦除小室內(nèi)黏附的細(xì)胞后結(jié)晶紫染色，顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野(200×)，記錄穿透小室的細(xì)胞數(shù)量，取平均值，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)，每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1超表達(dá)PAK4促進(jìn)乳腺癌MCF7細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 在乳腺癌MCF7細(xì)胞中，超表達(dá)PAK4后，免疫印跡分析PAK4蛋白質(zhì)表達(dá)量變化，PAK4蛋白質(zhì)(圖1A)表達(dá)量增加；遷移(圖1B)和侵襲(圖1C)能力較對照顯著增強(qiáng)。進(jìn)一步通過熒光定量及免疫印跡檢測EMT相關(guān)標(biāo)志分子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化(圖2)，上皮標(biāo)志分子E-Cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志分子N-Cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)。

2.2干擾PAK4表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞EMT的影響 在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中，抑制內(nèi)源PAK4表達(dá)后，免疫印跡分析PAK4蛋白質(zhì)表達(dá)(圖3A)減少；遷移(圖3B)和侵襲(圖3C)能力較對照顯著降低。進(jìn)一步，通過熒光定量及免疫印跡檢測EMT相關(guān)標(biāo)志分子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)變化(圖4)，上皮標(biāo)志分子E-Cadherin表達(dá)上調(diào)，而間質(zhì)標(biāo)志分子N-Cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)。

圖1 超表達(dá)PAK4對乳腺癌MCF7細(xì)胞的影響Fig.1 Effect of exogenous PAK4 expression in MCF-7 cellsNote: A.The protein expression of PAK4 in MCF7 cells transfected with Pc-PAK4;B.Number of migrated cells;C.Number of invaded cells.**.P<0.01.

圖2 超表達(dá)PAK4誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生EMTFig.2 Effect of exogenous PAK4 expression induces mesenchymal phenotype in MCF-7 cellsNote: A.Relative mRNA change;B.Protein expression.**.P<0.01.

圖3 干擾PAK4表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of silencing of PAK4 in MDA-MB-231 cells in breast cancerNote: A.The protein expression of PAK4 in MDA-MB-231 cells transfected with PAK4 shRNA;B.Number of migrated cells;C.Number of invaded cells.*.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 干擾PAK4表達(dá)對乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞EMT的影響Fig.4 Effect of silencing of PAK4 suppresses mesench-ymal phenotype in MDA-MB-231 cellsNote: A.Relative mRNA change;B.Protein expression.*.P<0.05；**.P<0.01.

2.3PAK4對乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響 進(jìn)一步，通過免疫印跡檢測PAK4對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響，在乳腺癌MCF7細(xì)胞超表達(dá)PAK4后(圖5A)，Slug表達(dá)升高；乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞抑制內(nèi)源PAK4表達(dá)后(圖5B)，Slug表達(dá)降低。

圖5 PAK4對乳腺癌細(xì)胞EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響Fig.5 Effect of PAK4 on EMT of in breast cancer cellsNote: The protein expression of Snail and Slug in MCF-7 cells or MDA-MB-231 cells transfected with Pc-PAK4 or PAK4 shRNA.

3 討論

近年我國乳腺癌發(fā)病呈現(xiàn)年輕化態(tài)勢，且發(fā)病率的增長速度也不斷增加[9]。乳腺癌患者死亡的主要原因是發(fā)生轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移常伴隨著對于乳腺癌治療的耐受，極難治愈。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用[10]。EMT作為乳腺癌惡變及轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，找到抑制乳腺癌EMT的分子靶標(biāo)對于突破乳腺癌治療現(xiàn)狀有至關(guān)重要的意義。EMT的發(fā)生與多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活有關(guān)，如Wnt/β-catenin、Hedgehog(Hh)、Smad和PI3K/AKT信號(hào)通路[11]。

p21激活激酶4在大多數(shù)乳腺癌中存在異常高表達(dá)，并促進(jìn)了乳腺腫瘤的惡性進(jìn)展，與乳腺癌的非停泊性生長、存活、轉(zhuǎn)移和侵襲等方面密切相關(guān)[3-5]。乳腺癌MCF7遷移侵襲力較差[12]，在本研究中，通過外源轉(zhuǎn)染表達(dá)PAK4蛋白，顯著提高了MCF7細(xì)胞的遷移侵襲能力，說明PAK4是乳腺癌惡變的關(guān)鍵基因。另外，超表達(dá)PAK能下調(diào)MCF7細(xì)胞中上皮標(biāo)志分子E-Cadherin蛋白的表達(dá)量，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志分子N-Cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)量，說明PAK4在乳腺癌細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮重要作用，其促使乳腺癌細(xì)胞惡變的機(jī)制部分是通過促進(jìn)EMT過程實(shí)現(xiàn)。而進(jìn)一步對EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行檢測，超表達(dá)PAK4能上調(diào)Slug表達(dá)，說明PAK4可能是通過激活Slug進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌發(fā)生EMT。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞惡性度高，遷移侵襲能力強(qiáng)[12]，通過外源轉(zhuǎn)染PAK4 shRNA載體抑制內(nèi)源PAK4蛋白表達(dá)后，MDA-MB-231細(xì)胞的遷移侵襲能力受到抑制，進(jìn)而檢測EMT相關(guān)標(biāo)志分子，發(fā)現(xiàn)E-Cadherin蛋白表達(dá)上調(diào)，而N-Cadherin、Vimentin和Slug蛋白表達(dá)下調(diào)，說明抑制內(nèi)源PAK4表達(dá)使MDA-MB-231細(xì)胞去間質(zhì)化，惡性度降低。這些結(jié)果均證實(shí)PAK4是乳腺癌EMT進(jìn)程的關(guān)鍵分子，PAK4可作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

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StudyofPAK4inducesepithelial-mesenchymaltransitionofbreastcancercells

MIXu-Guang，LIShou-Qing,LIULei,LUXiao-Dan,FANGYan-Qiu,TANYan.

CenterforMedicalTreatmentandDiagnosis,JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To analyze the effect of p21 protein activated kinase 4 (PAK4) on epithelial-mesenchymal transition of breast cancer cells.MethodsThe mRNA and protein expression of PAK4,E-Cadherin,N-Cadherin and Vimentin were detected by qRT-PCR and Western blot in breast cancer cells transfected with pcDNA-PAK4 or siRNA PAK4;The biology behaviors of MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells transfected with pcDNA-PAK4 or siRNA PAK4 were analysed by cell migration assay,invasion assay.ResultsOverexpressing PAK4 could significant increase in the migration and invasion compared with vector-infected cells,decrease the expression of epithelial marker E-cadherin and upregulate the expression of mesenchymal markers N-cadherin and Vimentin in detached MCF7 cells.Silenced PAK4 gene in detached MDA-MB-231 cells could suppress the migration and invasion,decrease the levels of the mesenchymal markers and increased the levels of the epithelial markers at both mRNA and protein levels.ConclusionPAK4 plays a key role in EMT of breast cancer cells,and its promoting EMT effect associated with upregulating the expression of Slug.

Breast cancer;p21 protein activated kinase 4;Epithelial-mesenchymal transition

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.12.003

R735.7

A

1000-484X(2017)12-1771-04

①本文為吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150520047JH)和吉林省科技廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)專項(xiàng)基金(20150622024JC，20160622008JC)。

米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療方面的研究，E-mail:mixg699@163.com。

及指導(dǎo)教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主要從事腫瘤免疫治療方面的研究，E-mail:yq.fang@163.com。

[收稿2017-09-10]

(編輯 許四平 劉格格)