許甘霏， 官 妍

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院， 合肥 230038)

表皮葡萄球菌總RNA小量提取方法比較

許甘霏1， 官 妍2

(1. 安徽大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230601； 2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué) 中西醫(yī)結(jié)合臨床學(xué)院， 合肥 230038)

表皮葡萄球菌屬于革蘭氏陽性細菌，因細胞壁較厚、難破裂等特點致使其總RNA提取的難度增大，而總RNA提取效率和提取質(zhì)量等對分子生物學(xué)相關(guān)研究起著關(guān)鍵的作用。因此，以表皮葡萄球菌ATCC35984為實驗菌株，分別使用Trizol裂解聯(lián)用研磨珠破碎法、單酶酶解法、雙酶酶解法、液氮研磨法等4種細胞壁破碎方法，對其總RNA進行提取，對比提取效果，旨在尋找一種高效穩(wěn)定的總RNA提取方法。結(jié)果顯示，雙酶裂解法和液氮研磨法提取的表皮葡萄球菌總RNA完整性好、純度高、重復(fù)性好，可有效提高表皮葡萄球菌總RNA提取質(zhì)量。

表皮葡萄球菌；總RNA；提取方法

近年來，隨著人工瓣膜、關(guān)節(jié)置換、插管等醫(yī)療技術(shù)臨床應(yīng)用的增多，留置在患者體內(nèi)的生物材料感染逐漸成為這些技術(shù)引起的并發(fā)癥之一[1]。其中，由表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)引起的感染是臨床上最常見感染之一。表皮葡萄球菌是人體皮膚和黏膜的主要共生菌，是一種常見的條件致病菌，同時也是醫(yī)院交叉感染的重要來源[2]；其可在體內(nèi)黏附材料表面形成生物被膜，致使其對抗菌藥物不敏感，并最終導(dǎo)致表皮葡萄球菌在患者體內(nèi)難以清除[3]。因此，有關(guān)表皮葡萄球菌的基礎(chǔ)研究已引起科研工作者的足夠重視，而提取高質(zhì)量的表皮葡萄球菌總RNA，是進行一系列后續(xù)基礎(chǔ)實驗如實時熒光定量PCR分析、cDNA文庫的合成、微陣列基因差異表達分析等的先決條件[4]。目前，關(guān)于革蘭氏陽性細菌總RNA提取的商業(yè)化試劑盒很多，但這些試劑盒難以滿足不同種屬細菌尤其是表皮葡萄球菌總RNA的抽提要求，實驗過程中提取的表皮葡萄球菌細胞RNA總量少、品質(zhì)低，在菌體生長的各階段特別是菌體對數(shù)生長早期，通常需要大量培養(yǎng)菌體以用于總RNA的制備。因此，建立快速、高效、高質(zhì)量表皮葡萄球菌總RNA提取方法可為該菌的相關(guān)研究提供便利。

表皮葡萄球菌屬于革蘭氏陽性細菌，其細胞壁層較厚，含有致密的肽聚糖層，因而其細胞壁難破裂，是導(dǎo)致其細胞總RNA提取總量少、品質(zhì)低的主要原因。而選擇合適的方法，促進細胞壁的完全破裂成為提取表皮葡萄球菌總RNA的關(guān)鍵步驟。因此，本文以表皮葡萄球菌ATCC35984為實驗材料，采用單酶酶解、雙酶酶解、液氮研磨等方法破碎細胞壁，以商業(yè)化的Trizol試劑盒法做對照，比較這4種細胞壁破碎方法對表皮葡萄球菌細胞總RNA抽提效果的影響，為后續(xù)的表皮葡萄球菌分子生物學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

表皮葡萄球菌標準菌株ATCC35984(強產(chǎn)膜株)，購于中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑和儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB，杭州微生物試劑有限公司)；溶菌酶(北京索萊寶科技有限公司)；溶葡萄球菌酶(上海生工生物工程股份有限公司)；Trizol(上海生工生物工程股份有限公司)；研磨珠(法國Bertin Technologies公司)；DNaseⅠ(寶生物工程有限公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計(上海龍尼科儀器有限公司)；核酸電泳系統(tǒng)(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；凝膠成像系統(tǒng) Tanon-1600(上海天能科技有限公司)；PCR儀(德國艾本德股份公司)；恒溫搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)；高速冷凍離心機(日立公司)；OneDrop微量紫外分光光度計(南京五義科技有限公司)；Precellys 24多功能樣品均質(zhì)器(法國Bertin Technologies公司)；QuantStudio TM 6 FlexqRT-PCR儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基和緩沖液

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基TSB(g/L)：胰蛋白胨17.0，植物蛋白胨3.0，氯化鈉5.0，磷酸氫二鉀2.5，葡萄糖2.5，pH 7.3±0.2，1×105Pa滅菌15 min。TSB固體培養(yǎng)基在以上培養(yǎng)基中加入瓊脂粉15.0 g滅菌制備。

TE緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0。

變性液：4 mol/L 硫氰酸胍，25 mol/L 檸檬酸鈉·2H2O，0.5%(m/V)月桂基肌酸鈉，0.1 mol/L β-巰基乙醇，現(xiàn)配現(xiàn)用，每次使用前加入7.2 μL β-巰基乙醇/1 mL變性液。

1.3.2 表皮葡萄球菌的培養(yǎng)及菌體制備

在超凈工作臺，用接種環(huán)蘸取保存于-70℃的表皮葡萄糖球菌菌液，直接在TSB固體培養(yǎng)基平板上劃線，37℃條件下培養(yǎng)12 h后，挑取單克隆于5 mL新鮮TSB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)于37℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌體密度OD600=1.6時，分別收集1 mL或8 mL(用于液氮研磨法)菌液備用。

收集的菌液在8000 r/min、4℃條件下離心1 min后收集菌體，并用500 μL含DEPC的無菌水漂洗1次，10 000 r/min離心1 min后再次收集菌體并重懸于100 μL TE緩沖液中備用。

1.3.3 細胞壁裂解及總RNA的抽提

收集并重懸于100 μL TE緩沖液中的表皮葡萄糖球菌菌體按照以下4種方法處理：1)Trizol試劑裂解聯(lián)用研磨珠破碎法。向樣品中加入1 mL Trizol；稱取0.3 g Glass Beads 放入專用Ep管中，同時將樣品轉(zhuǎn)移至專用Ep管中，靜置5 min，待充分裂解；使用Precellys 24多功能樣品均質(zhì)器高速勻漿15～30 s。2)單酶酶解。加入溶菌酶(終濃度3 mg/mL)，室溫孵育15 min。3)雙酶酶解。加入溶葡萄球菌酶(終濃度100 μg/mL)和溶菌酶(終濃度100 μg/mL)，渦旋震蕩1 min，37℃孵育10 min。4)液氮研磨。將重懸于100 μL TE緩沖液中的表皮葡萄糖球菌菌體轉(zhuǎn)移至10 mL Ep管中，加液氮適量并使用直徑0.5 cm的研棒研磨菌體至粉末狀。

后續(xù)實驗中，向上述方法1)加入200 μL氯仿，渦旋震蕩15 s，靜置5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min使溶液分層；RNA溶于上層水相中，小心吸取上層水相(約600 μL)至另一新的離心管，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，靜置10 min；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，4℃、12 000 r/min離心3 min，棄上清，將樣品靜置于超凈工作臺內(nèi)吹干；加入30～50 μL RNase-Free無菌水溶解RNA，-70℃保存。

將上述方法2)～4)中溶液及沉淀轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入1 mL變性液；加入100 μL 2 mol/L的醋酸鈉，1 mL酚，200 μL氯仿-異丙醇，渦旋震蕩10 s，冰上放置15 min；4℃、12 000 r/min離心10 min使溶液分層；小心吸取上層水相至另一新的離心管，加入等體積的預(yù)冷異丙醇；4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀1次，4℃、12 000 r/min離心3 min，棄上清；待乙醇揮發(fā)干凈后，加入40 μL RNase-Free無菌水溶解沉淀；加入10 μLDNaseⅠ反應(yīng)液(含RecombinantDNaseⅠ 10 U、RNaseInhibitor 20 U、5 μL 10×DNaseⅠ Buffer)；混勻后在37℃條件下反應(yīng)30 min，將溶液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1 mL變性液，再進行一輪抽提；待RNA樣品吹干后加30～50 μL RNase-free無菌水溶解RNA，-70℃保存。

1.3.4 總RNA的質(zhì)量及完整性檢測

所提總RNA的純度采用One Drop微量分光光度計對其吸光值及濃度進行測定，分別記錄260 nm、230 nm、280 nm處的OD值，并計算OD260/OD280及OD260/OD230。根據(jù)所測的濃度，取相同含量的RNA于1.0 %的變性瓊脂糖凝膠上150 V穩(wěn)壓電泳6～10 min，取出EB染色 6～10 min，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察成像。

1.3.5 cDNA第一條鏈的合成及管家基因gryB的擴增

反轉(zhuǎn)錄按照寶生物(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成表皮葡萄球菌的cDNA第一鏈。取表皮葡萄球菌cDNA進行PCR，PCR擴增表皮葡萄球菌gryB片段。引物(上游引物5′-AGCGGTTCGTAAAAGACCGGGTATG-3′，下游引物5′-CCTGCTAATGCCTCGTCAATAC-3′)，cDNA模板經(jīng)94℃變性7 min，按照94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 15 s程序擴增28個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取RNA完整性

瓊脂糖凝膠電泳是檢測RNA質(zhì)量和完整性的重要方法[5]，圖1為4種實驗方法抽提總RNA的檢測結(jié)果。Trizol裂解聯(lián)用研磨珠破碎法提取的RNA完整性較差，只有一條帶可見；單酶酶解法未能提取出表皮葡萄球菌的RNA；雙酶酶解法提取的RNA，23S和16S條帶清晰可見。液氮研磨法可以得到完整的RNA，23S和16S條帶清晰可見且無降解，23S帶接近于16S帶亮度的兩倍，沒有拖尾現(xiàn)象，說明得到了很好質(zhì)量的RNA樣品。

圖1 不同方法提取表皮葡萄球菌總RNA的電泳圖

A：Trizol裂解聯(lián)用研磨珠破碎法；B：單酶酶解法；C：雙酶酶解法；D：液氮研磨法

2.2 不同提取方法抽提總RNA的純度和濃度

測定不同方法獲得RNA樣品的OD230、OD260和OD280，雙酶酶解法以及液氮研磨法提取表皮葡萄球菌總RNA的OD260/OD280分別為2.06±0.18和1.98±0.05；OD260/OD230分別為2.13±0.07和2.22±0.13(表1)。雙酶酶解法和液氮研磨法所提取RNA純度較高，并有效除去了蛋白、多糖、酚類物質(zhì)，可以用于后續(xù)實驗。但后者提取的RNA濃度均顯著優(yōu)于前者。

表1 4種不同總RNA提取方法對表皮葡萄球菌提取效果的比較

2.3 表皮葡萄球菌RNA樣品的cDNA合成及質(zhì)量

將表皮葡萄球菌總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板進行擴增gryB片段，進一步檢測所提取的RNA的質(zhì)量。電泳結(jié)果顯示，雙酶酶解法與液氮研磨法均可得到100 bp左右的帶，與預(yù)期結(jié)果(108 bp)一致(圖2)。這說明所提取的RNA具有較強的反轉(zhuǎn)錄活性，能夠更好滿足后續(xù)實驗要求。

圖 2 RT-PCR擴增gryB的部分序列

M：low MW DNA Marker-A；1：雙酶酶解法樣品擴增產(chǎn)物；2：液氮研磨法擴增產(chǎn)物

3 結(jié)論

表皮葡萄球菌是一種革蘭氏陽性細菌，其細胞壁是由厚且致密的肽聚糖和磷壁酸組成，而肽聚糖的肽鏈通過5個甘氨酸互相交聯(lián)，不易裂解[7]，一般溫和的破壁方法很難將其完全破碎；同時，相對于動植物等真核細胞而言，細菌細胞的RNA含量少，半衰期很短，很容易降解[6]。因此，細胞壁的有效裂解是提取高質(zhì)量表皮葡萄球菌總RNA的關(guān)鍵。目前，在細菌總RNA提取的商業(yè)化試劑盒中，所提到細胞壁裂解方法大多數(shù)是使用單酶(溶菌酶，終濃度3 mg/mL)室溫酶解法，但是，我們前期實驗表明，這些試劑盒采用的方法并不適用于表皮葡萄球菌。

本研究中，我們選擇采用雙酶酶解和物理法(液氮研磨)兩種方法破碎細胞壁。采用溶菌酶(終濃度100 μg/mL)和溶葡萄球菌酶(終濃度100 μg/mL)在37℃(酶的最適溫度)條件下孵育15 min，能順利提取表皮葡萄球菌的RNA。雙酶解法和液氮研磨法得到的RNA均能夠進行反轉(zhuǎn)錄并順利擴增出管家基因，可以用于后續(xù)的分子生物學(xué)實驗。但是，這兩種方法也存在自身的優(yōu)點和不足。例如，溶葡萄球菌酶價格較為昂貴，且酶與細胞的孵育會影響RNA的質(zhì)量[8]；液氮研磨法經(jīng)濟快速，可充分破碎細胞壁，RNA電泳檢測結(jié)果顯示也可得到清晰的RNA條帶，但因抽提研磨過程中為方便操作，使用的樣品的量一般為雙酶法提取所需量的5倍以上。Trizol試劑盒是市場上常見的試劑盒之一，研磨珠破碎聯(lián)用Trizol試劑盒法是革蘭氏陽性細菌及真菌總RNA提取較為成熟的方法之一[9-10]，本研究中該方法沒有提取到RNA，其具體原因尚不清楚，可在之后的工作中繼續(xù)優(yōu)化實驗條件。

總之，本研究通過比較幾種表皮葡萄球菌RNA的提取方法，建立了可以獲得高質(zhì)量RNA的實驗方法，為后續(xù)表皮葡萄球菌分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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ComparisonofmethodsfortotalRNAextractionfromStaphylococcusepidermidis

XU Gan-fei1, GUAN Yan2

(1. School of Life Science, Anhui University, Hefei 230601; 2. Clinical College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230038, China)

The efficiency and quality of extracted total RNA play a key role in molecular biology research.Staphylococcusepidermidis, a gram-positive bacterium, possesses thick cell wall, which is hard to rupture and difficult to extract its total RNA. In this study, different strategies including single enzyme disruption, combined enzyme disruption etc. were compared in order to obtain an efficient and stable method for total RNA extraction fromS.epidermidisATCC35984. Results showed that the total RNA extracted by liquid nitrogen grinding or combined enzyme disruption exhibited relatively better integrity, purity and repeatability.

Staphylococcusepidermidis; total RNA; extraction method

2016-10-25；

2016-11-02

安徽省自然科學(xué)基金項目(No.1508085MH200)；安徽省教育廳自然科學(xué)研究項目(No.KJ2013Z163)

許甘霏，博士研究生，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)研究, E-mail:xuganfei_ahu@163.com

官 妍，教授，從事細菌、真菌生物被膜方向的研究，E-mail:guanyan0726@sina.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.097

Q933

B

2095-1736(2017)06-0097-04