張燕靈，李靖宇，劉建利，劉雅琴，張翼飛，趙 吉，鄧 蔚

(1. 北方民族大學 生物科學與工程學院, 銀川 750021； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境科學研究院， 呼和浩特 010010； 3. 內(nèi)蒙古大學 環(huán)境與資源學院, 呼和浩特 010021)

基于高通量測序技術對沙湖水體細菌多樣性的分析

張燕靈1，李靖宇1，劉建利1，劉雅琴1，張翼飛2，趙 吉3，鄧 蔚1

(1. 北方民族大學 生物科學與工程學院, 銀川 750021； 2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)環(huán)境科學研究院， 呼和浩特 010010； 3. 內(nèi)蒙古大學 環(huán)境與資源學院, 呼和浩特 010021)

為了解沙湖水體中細菌群落結構和多樣性，采用E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒提取水樣總DNA，對細菌群落的16S rRNA基因的V4～V5區(qū)進行MiSeq測序，利用Mothur軟件和R語言進行細菌群落結構及多樣性的分析。共得到427 975條優(yōu)化序列，在97%的相似水平下對OTU進行統(tǒng)計分析，得到20門，50綱，95目，161科，276屬。樣點A、B、C、D的OTU分別為497、496、487和511。優(yōu)勢類群為變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)。沙湖水體中細菌群落結構復雜，但不同位點細菌群落結構的組成以及多樣性差異不顯著。

細菌群落；沙湖；水體；MiSeq測序

細菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在湖泊的物質循環(huán)和能量流動中起著重要作用。由于傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術限制，利用平板培養(yǎng)法測定的細菌類群數(shù)量只能占到湖泊中實際存在的細菌總數(shù)的1%～10%[1]。近年來，高通量測序技術的發(fā)展，為細菌多樣性研究開辟了新的途徑，不斷革新著我們對細菌多樣性的認識。高通量測序可獲得的基因序列以百萬甚至億萬計，不但分辨率高，而且可以同時分析上百個不同的樣品，是分析自然界中細菌群落結構組成和相對豐度的重要工具[2]。目前，許多學者對寧夏沙湖的浮游植物和浮游動物進行了研究報道[3-5]，但是關于沙湖水體的細菌群落結構和多樣性的研究還未見報道。據(jù)此，本研究通過高通量測序技術對寧夏沙湖細菌群落開展研究，從而了解沙湖不同位點的細菌群落的結構、豐度和多樣性，為深入認識湖泊的生物地球化學循環(huán)提供細菌生態(tài)學視角。

1 材料與方法

1.1 材料

供試水樣取自寧夏回族自治區(qū)平羅縣沙湖旅游區(qū)(38°47′N～38°50′N，106°20′E～106°23′E)。水體樣品的采集時間為2015年10月2日，根據(jù)沙湖的形狀選取12個取樣點A1～A3，B1～B3，C1～C3，D1～D3(圖1)。將水樣運回實驗室保存于4℃冰箱備用。取樣點作圖利用Landsat 8影像，2014年10月23日下載于美國地質調(diào)查局(www.usgs.gov)，利用band5、band4、band3 3個波段合成假彩色影像圖，然后和band8融合為分辨率為15 m的最終影像圖。利用arcgis10.0，疊加取樣點坐標即為取樣示意圖。

圖1 沙湖采樣點設定

1.2 方法

1.2.1 水樣基因組總DNA提取及擴增

每個點樣品取2.5 L水樣后經(jīng)0.22 μm濾膜(直徑150 mm; Millipore)過濾，并將濾膜在無菌條件下剪碎。然后采用E.Z.N.A.?water DNA Kit試劑盒(Omega, USA)，參照說明書提取沙湖水體細菌DNA。提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

20 μL PCR反應體系：2.0 μL 2.5×10-3mol/L dNTPs，0.8 μL 0.5×10-5mol/L 338F (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)，0.8 μL 0.5×10-5mol/L 806R (5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′) ，2.0 μL 10×緩沖液，0.2 μL BSA，10 ng模板以及0.2 μL，5 U/μLrTaq聚合酶，最后加ddH2O到20 μL。

反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，28個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

獲得的PCR產(chǎn)物使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收；使用Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)進行定量并將每個樣品按測序量比例混合，然后根據(jù)標準流程進行Illumina MiSeq雙端測序。

1.2.2 Illumina MiSeq測序數(shù)據(jù)分析

利用Trimmomatic和FLASH軟件，過濾read尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質量值低于20，從窗口開始截取后端堿基，過濾質控后50 bp以下的read；根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。進一步運用RDP Classifier 軟件包進行系統(tǒng)發(fā)育分析，在97%置信度下將每個樣品中的所有16S rRNA基因序列進行分類，獲得門、綱、目、科和屬各水平下的分類單元。Alpha多樣性分析采用mothur[7]version v.1.30.1指數(shù)分析，設置指數(shù)評估的OTU相似水平為97%，計算多樣性指數(shù)：菌群豐度指數(shù)，Chao和Ace；菌群多樣性指數(shù)，Shannon和Simpson；深度指數(shù)，Coverage。應用R語言進行PCA統(tǒng)計分析和作圖，其中一個點代表一個樣品，顏色和形狀相同的點同屬于一個組，兩個點之間的距離越遠表示兩個樣本組成差異越大。

2 結果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)分析

通過各樣品中細菌的16S rRNA 基因 V4-V5 區(qū)測序，12個樣品測得的高質量序列為427 975條，其中A1為37 018，A2為38 758，A3為31 082，B1為31 032，B2為32 579，B3為43 747，C1為34 558，C2為33 599，C3為38 466，D1為29 210，D2為39 143，D3為38 783。如圖2所示，由Shannon-Wiener 指數(shù)結合測序深度繪制的12個樣品曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映樣本中絕大多數(shù)的細菌信息。

圖2 樣品Shannon-Wiener曲線圖

2.2 沙湖水體細菌群落結構

由細菌樣本聚類樹與柱狀圖組合分析可知樣本中細菌的組成、相對豐度及樣本間基于群落組成的層次聚類[9]。如圖3-A所示，在細菌分類學門水平上，高通量測序發(fā)現(xiàn)沙湖水樣12個取樣點擁有7個相同的優(yōu)勢細菌類群(豐度>0.7%為優(yōu)勢類群)，它們分別是變形菌門(Proteobacteria)、藍細菌門(Cyanobacteria)、放線菌(Actinobacteria)、擬桿菌(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、綠彎菌門(Chloroflexi )。

各取樣點的細菌群落差異各不相同，這種差異體現(xiàn)在某些種群的相對豐度上，由圖3-A可知，A1和A2的細菌群落結構最為相似，各細菌的相對豐度分別為：變形菌門，A1為32.13%，A2為29.72%；藍細菌門，A1為15.38%，A2為22.09%；放線菌，A1為29.19%，A2為27.17%；擬桿菌，A1為12.19%，A2為11.1%；厚壁菌門，A1為4.72%，A2為3.51%；疣微菌門，A1為2.97%，A2為2.52%；綠彎菌門，A1為1.73%，A2為1.87%。對于相對豐度<0.7%的弱勢細菌類群，A1中的細菌總量為1.68%，A2為1.75%。其次為B1和B2，各細菌的相對豐度分別為：變形菌門，B1為24.85%，B2為26.36%；藍細菌門，B1為21.62%，B2為17.18%；放線菌，B1為23.95%，B2為28.4%；擬桿菌，B1為20.98%，B2為17.12%；厚壁菌門，B1為3.18%，B2為2.88%；疣微菌門，B1為2.66%，B2為4.1%；綠彎菌門，B1為1.09%，B2為2.2%。對于相對豐度<0.7%的弱勢細菌類群，B1中的細菌總量為1.67%，B2為1.77%。而C2中的各種細菌相對豐度與其他取樣點相差最大。C2中的各細菌相對豐度分別為：變形菌門為35.29%，藍細菌門為27.47%，放線菌為7.77%，擬桿菌為19.88%，厚壁菌門為1.41%，疣微菌門為4.47%，綠彎菌門為2.63%，弱勢細菌總量為1.09%。

圖3 沙湖水體細菌在門水平的高通量相對豐度及相似性

如圖3-B所示，同一區(qū)域3個樣點的測序數(shù)據(jù)看成一個整體，水樣A、B、C和D的細菌群落最為相似的是C和B，其次為D，而A和其他的相差最大，但差異不顯著。各細菌的相對豐度分別為：變形菌門，A為32.65%，B為22.77%，C為26.06%，D為27.61%；藍細菌門，A為15.09%，B為26.56%，C為30.36%，D為24.78%；放線菌，A為27.71%，B為22.48%，C為12.96%，D為12.98%；擬桿菌，A為13.52%，B為18.82%，C為20.35%，D為18.46%；厚壁菌門，A為4.97%，B為2.67%，C為2.35%，D為7.17%；疣微菌門，A為2.45%，B為3.59%，C為4.47%，D為3.66%；綠彎菌門，A為1.8%，B為1.54%，C為2.02%，D為3.44%。劣勢細菌總量分別為：A為1.82%，B為1.56%，C為1.43%，D為1.9%。

2.3 沙湖水體細菌多樣性

如表1所示，在97%相似度下，A、B、C、D的ace指數(shù)分別為509、511、502和516，chao指數(shù)分別為514、512、509和521，Ace指數(shù)和Chao指數(shù)均表明取樣點D的物種總數(shù)最多，而A、B、C、D的Shannon指數(shù)分別為4.47、4.24、4.46和4.62，Simpson指數(shù)分別為0.022、0.0383、0.0331和0.0243，Shannon指數(shù)表明取樣點D的物種種類最多，而Simpson指數(shù)表明取樣點A的物種種類最多。所有取樣點的Coverage均大于99%，說明本次測序結果能代表樣本的真實情況。

表1 不同樣品細菌群落的豐度和多樣性指數(shù)

注：NT表示沒有檢測不同樣品之間的顯著性；P<0.05表示顯著

Rank-abundance[10]曲線是分析物種豐度和物種均勻度的一種方式，如圖4所示，在97%相似度的OTU下，D的細菌豐度最高，其次為A，而C的細菌豐度最低。并且D的細菌種類分布最均勻，而C的細菌種類分布最不均勻。

圖4 高通量測序分析沙湖水體細菌多樣性

2.4 主成分分析

通過PCA分析不同樣本OTU(97%相似性)組成來反映樣本間的差異[8]。本研究中PC1貢獻度為65.66%，PC2貢獻度為12.24%，累計貢獻率高達77.9%，是變異的主要來源，可以解釋變量的絕大部分信息。如圖5所示，樣品A1、A2、B1和B2中的細菌群落結構相似；樣品C3和樣品D3距離最近，說明兩個取樣點間細菌群落結構最為相似；樣品C2和樣品A1在PC2軸方向上間隔最大，說明兩個取樣點的細菌群落結構差異較大，且PC2是導致兩個取樣點差異的主要因素；A1和B3距離較大，說明兩個取樣點的細菌群落結構差異較大，且PC1是導致兩個取樣點差異的主要因素。

圖5 主成分分析

3 討論

細菌多樣性是湖泊生態(tài)系統(tǒng)中食物鏈和食物網(wǎng)的重要組成部分，驅動著湖泊生態(tài)系統(tǒng)中絕大多數(shù)生物活性元素的生物地球化學循環(huán)[11]。本研究采用高通量測序技術對沙湖水體細菌多樣性進行了分析，根據(jù)沙湖面積的大小及其形狀以及邱小琮等[4]的報道，布設了12個采樣點，共獲得427 975條優(yōu)化序列，覆蓋度數(shù)據(jù)達99%以上，可以反映沙湖水體細菌群落組成的真實情況。優(yōu)勢類群主要是變形菌門、藍細菌門、放線菌門和擬桿菌門等4大類群，占細菌總量的80%以上。這與任麗娟等[11]報道的在湖泊水體中主要以變形菌門、藍細菌門、擬桿菌門、放線菌門和疣微菌門等5個淡水細菌門類基本一致，說明這些類群在湖泊水體生物地球化學循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。但在不同的取樣位點，以上四大類群細菌相對豐度變化沒有明顯規(guī)律，這可能與湖泊面積大小以及水體流動造成營養(yǎng)物質、光照、氧氣以及微生物分散程度不同等密切相關。這些因素會影響水體中微生物的多樣性以及均勻度， 本研究中shannon指數(shù)范圍在4.24～4.62之間，與淺水淡水湖泊——鄱陽湖類似[12](表層水體細菌多樣性shannon指數(shù)為4.18)，明顯低于養(yǎng)殖水體[13](shannon指數(shù)范圍在4.82～5.33)，高于青藏高原東北部10個湖區(qū)細菌多樣性[14](shannon指數(shù)范圍在0.56～1.48)，這也說明湖泊水體中微生物多樣性的高低會受到不同區(qū)域、湖泊類型、富營養(yǎng)化程度、海拔高低等因素的影響，或者不同尺度條件下微生物多樣性差異也會大不相同。在微生物群落結構組成上，與未受到嚴重污染的我國最大的淡水湖泊——鄱陽湖[12]相比，沙湖水體中除了優(yōu)勢類群變形菌門、擬桿菌門和放線菌門外，藍細菌門出現(xiàn)且相對含量較高，這與當?shù)毓まr(nóng)業(yè)經(jīng)濟的發(fā)展，特別是農(nóng)田灌溉退水以及水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)等使得過量營養(yǎng)鹽進入沙湖，致使沙湖水體的富營養(yǎng)化所致[15]。本研究通過MiSeq測序技術對沙湖水體進行測序，首次全面揭示了寧夏沙湖水體內(nèi)的細菌的豐度和多樣性分析。這些結果將為沙湖水體質量的預測和理解沙湖水體中物質的生物地球化學循環(huán)提供理論基礎。

[1]柴麗紅, 崔曉巧, 彭 謙, 等.青海兩鹽湖細菌多樣性研究[J]. 細菌學報, 2004, 44(3):271-275.

[2]RINKE C, SCHWIENTEK P, SCZYRBA A, et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter[J]. Nature, 2013, 499(7459):431-437.

[3]崔安琪,翟 昊,于洪賢.寧夏沙湖浮游動物群落結構及多樣性[J].東北林業(yè)大學學報,2015,43(9):121-124.

[4]邱小琮,趙紅雪.寧夏沙湖浮游植物群落結構及多樣性研究[J]. 水生態(tài)學雜志, 2011,32(1):20-26.

[5]朱明瑩,于洪賢,馬成學,等. 沙湖浮游植物多樣性分析及水質評價[J].水產(chǎn)學雜志,2015,28(3):39-43.

[6]WANG P, CHEN B, YUAN R, et al. Characteristics of aquatic bacterial community and the influencing factors in an urban river[J]. Science of the Total Environment, 2016, 569-570:382-389.

[7]SCHLOSS P D, GEVERS D, WESTCOTT S L. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies[J]. PLoS One, 2011, 6(12): e27310.

[8]WANG Y, SHENG H F, HE Y, et al. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater, intertidal wetland, and marine sediments by using millions of illumina tags[J]. Applied Environmental Microbiology, 2012, 78(23):8264-8271.

[9]SRINIVASAN S, HOFFMAN N G, MORGAN M T, et al. Bacterial communities in women with bacterial vaginosis: high resolution phylogenetic analyses reveal relationships of microbiota to clinical criteria[J]. PLoS One, 2012, 7(6): e37818.

[10]BATES S T, CLEMENTE J C, FLORES G E, et al. Global biogeography of highly diverse protistan communities in soil[J]. The ISME Journal, 2012, 7(3):652-659.

[11]任麗娟, 何 聃, 邢 鵬, 等. 湖泊水體細菌多樣性及其生態(tài)功能研究進展[J]. 生物多樣性, 2013, 21(4): 421-432.

[12]寇文伯, 黃正云, 張 杰, 等. 鄱陽湖湖泊細菌群落組成及結構—以松門山為例[J]. 生態(tài)學報，2015, 35(23): 7608-7614.

[13]侯婷婷, 鐘志平, 劉 纓, 等. 青石斑魚海水循環(huán)水養(yǎng)殖水體的細菌群落特征[J]. 微生物學報, 2016, 56(2): 253-263.

[14]李 明, 郭 嘉, 石正國, 等. 春季青藏高原東北部湖泊細菌種類組成[J]. 應用與環(huán)境生物學報, 2013, 19(5):750-758.

[15]邱小琮, 趙紅雪, 孫曉雪. 寧夏沙湖浮游植物與水環(huán)境因子關系的研究[J]. 環(huán)境科學, 2012, 33(7):2265-2271.

BacterialdiversityanalysisinShahuLakebased-onhigh-throughputsequencing

ZHANG Yan-ling1, LI Jing-yu1, LIU Jian-li1, LIU Ya-qin1, ZHANG Yi-fei2, ZHAO Ji3, DENG Wei1

(1. College of Biological Science & Engineering, Beifang Univesity of Nationality, Yinchuan 750021； 2. Inner Mongolia Academy of Environmental Sciences, Hohhot 010010； 3. College of Environment & Resources, Inner Mongolia University， Hohhot 010021, China)

In order to investigate the structure and diversity of microbial community in Shahu Lake, the total DNA of bacteria from water samples was extracted by E.Z.N.A.?Water DNA extraction kit, then the V4-V5 region of 16S rRNA gene was sequenced by MiSeq technology. Mothur software and R language were used to analyze the microbial community structure and diversity. A total of 427975 optimized sequences were obtained, and 20 Phylum, 50 Class, 95 Order, 161 Family, and 276 Genus were predicted at the 97% similarity level. The OTUs for A, B, C and D were 497, 496, 487 and 511, respectively. Proteobacteria, Cyanobacteria, Actinobacteria and Bacteroidetes are dominant groups. The microbial community structure in Shahu Lake is complex, but the composition and diversity of microbial community structure are not significant at different sites.

microbial communities； Shahu Lake； water； MiSeq sequencing

2016-11-15；

2016-11-21

國家自然科學基金(41661053);寧夏自然科學基金(NZ15098);北方民族大學引進人才科研啟動項目(44/4400302502)

張燕靈, 專業(yè)方向為生物工程, E-mail:2806186414@qq.com

李靖宇,博士,講師,研究方向環(huán)境微生物學、微生物生態(tài)學, E-mail: lijingyu1986@126.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.056

Q93

A

2095-1736(2017)06-0056-04