黃惠明， 李珊珊， 楊 敏， 林霜霜， 吳維堅(jiān)， 林洪濤， 林振宇， 邱 彬， 鄭開(kāi)斌

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所， 福建 漳州 363000； 2. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350116)

響應(yīng)面法優(yōu)化洋金花中東莨菪堿的提取

黃惠明1， 李珊珊1， 楊 敏1， 林霜霜1， 吳維堅(jiān)1， 林洪濤1， 林振宇2， 邱 彬2， 鄭開(kāi)斌1

(1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所， 福建 漳州 363000； 2. 福州大學(xué)化學(xué)學(xué)院， 福建 福州 350116)

運(yùn)用響應(yīng)面法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 對(duì)洋金花中東莨菪堿在超聲提取過(guò)程中的各因素進(jìn)行考察優(yōu)化. 采用HPLC法測(cè)定東莨菪堿的質(zhì)量濃度， 以鹽酸濃度、 提取時(shí)間、 液料比為考察因素， 東莨菪堿提取率為響應(yīng)值， 用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)提取工藝實(shí)驗(yàn)， 建立預(yù)測(cè)方程， 優(yōu)化提取工藝. 結(jié)合實(shí)際可操作性， 確定最佳提取條件為： 鹽酸濃度3 mol·L-1， 提取時(shí)間43 min， 液料比25 mL·g-1. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差為2.76%， 相關(guān)性良好， 說(shuō)明對(duì)洋金花中東莨菪堿的提取進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化合理可行.

響應(yīng)面法； 洋金花； 東莨菪堿； 提取

0 引言

白花曼陀羅(DaturametelL.)， 又名洋金花、 大喇叭花、 山茄子等. 春季花開(kāi)后， 采其鮮花， 曬干或低溫干燥， 即為中藥“洋金花”, 此品辛、 溫、 有毒， 可作為麻醉劑[1-3]. 洋金花的化學(xué)成分主要有東莨菪堿、 莨菪堿等莨菪烷型生物堿， 是其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病起作用的化學(xué)基礎(chǔ)[4-5]. 響應(yīng)面法(response surface methodology， RSM)是一種條件尋優(yōu)的實(shí)驗(yàn)方法[6-7]， 通過(guò)進(jìn)行一系列設(shè)定好的實(shí)驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)前需合理選取不同因素水平的條件)獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 擬合出方程， 最后將函數(shù)以圖形的方式表現(xiàn)出來(lái)直觀地選擇實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)參數(shù). 實(shí)驗(yàn)參考2015版《中國(guó)藥典》[8]， 采用超聲法提取洋金花中東莨菪堿， 以高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)其含量[9-10]. 運(yùn)用響應(yīng)面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 對(duì)提取過(guò)程中的各因素進(jìn)行考察研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料

洋金花購(gòu)自漳州市騰信化玻儀器有限公司， 經(jīng)福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院吳水金老師鑒定, 為白花曼陀羅的干燥花； 乙腈(色譜純，φ≥99.9%)； 磷酸鈉(分析純，w≥98%)； 十二烷基硫酸鈉(分析純，w≥99%)； 三氯甲烷(分析純，φ≥99%)； 磷酸(分析純，φ≥85%)； 濃氨水(分析純，φ=25%～28%)； 東莨菪堿氫溴酸鹽(C12H21NO4·HBr3H2O，w≥98%).

高效液相色譜儀(型號(hào)Thermo Ultimate-3000， 美國(guó)賽默飛世爾公司)； 液相自動(dòng)進(jìn)樣器(型號(hào)Alias， 荷蘭Spark公司)； 超聲提取器(型號(hào)KQ-300DE， 昆山市超聲儀器有限公司)； 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)RE-52AA， 上海亞榮生化儀器廠)； 酸度計(jì)(型號(hào)Thermo orion model 818， 美國(guó)賽默飛世爾公司)； 分析天平(Sartorius BSA系列， 德國(guó)賽多利斯公司).

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件為Design-Expert 8.0.5b.

2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

2.1 試劑制備

磷酸鈉溶液： 精密稱取磷酸鈉27.15 g， 十二烷基硫酸鈉5.107 g， 溶于水， 磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0， 定容于1 L容量瓶中， 配制成0.07 mol·L-1磷酸鈉溶液(含0.017 5 mol·L-1十二烷基硫酸鈉).

氫溴酸東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)液： 精密稱取東莨菪堿氫溴酸鹽0.101 4 g， 加蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中， 制成標(biāo)準(zhǔn)液(東莨菪堿氫溴酸鹽質(zhì)量濃度為0.993 3 mg·mL-1).

流動(dòng)相： 乙腈-0.07 mol·L-1磷酸鈉溶液(體積比1∶2).

色譜條件： C18色譜柱(Thermo Fisher， 5 μm， 4.6 mm×250 mm)； 以乙腈-0.07 mol·L-1磷酸鈉溶液為流動(dòng)相； 進(jìn)樣量20 μL， 柱溫25 ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm； 理論板數(shù)以氫溴酸東莨菪堿峰計(jì)算應(yīng)大于3 000. 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品色譜圖見(jiàn)圖1, 其中，m東莨菪堿=m氫溴酸東莨菪堿/1.445.

圖1 氫溴酸東莨菪堿標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC圖Fig.1 Reference substance and sample chromatograms of scopolamine hydrobromide

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取適量標(biāo)準(zhǔn)液分別配制質(zhì)量濃度為0.2， 0.4， 0.5， 0.6， 0.9， 1.0 mg·mL-1的氫溴酸東莨菪堿， 進(jìn)樣， 測(cè)定峰面積， 以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)， 峰面積(Y)為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程為Y=187.2ρ-0.047 5(r=0.999 9). 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 氫溴酸東莨菪堿質(zhì)量濃度在0.20～0.99 mg·mL-1范圍內(nèi)與其峰面積呈良好的線性關(guān)系.

2.3 精密度及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

在上述色譜條件下， 取氫溴酸東莨菪堿質(zhì)量濃度為0.4 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液， 重復(fù)進(jìn)樣5次， 測(cè)得峰面積的RSD為1.7%.

精密稱取供試樣品約1 g， 共5份， 按以上方法處理、 測(cè)定， 得東莨菪堿的平均提取率為0.33%， RSD為1.8%.

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確移取已知質(zhì)量濃度的樣品提取液3份， 分別加入與樣品中東莨菪堿質(zhì)量濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品， 測(cè)定其加標(biāo)回收率， 結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 氫溴酸東莨菪堿加標(biāo)回收率Tab.1 Recoveries of scopolamine hydrobromide

3 東莨菪堿提取率的測(cè)定

精密稱取洋金花粉末約1 g(過(guò)300 μm篩)， 置錐形瓶中， 加入鹽酸溶液， 超聲處理(270 W， 頻率40 kHz)， 放冷， 過(guò)濾， 用相同濃度鹽酸溶液10 mL分?jǐn)?shù)次洗滌濾渣和濾器， 合并濾液和洗液， 用濃氨水調(diào)節(jié)pH值至9.0， 用三氯甲烷振搖提取4次， 每次10 mL， 合并提取液， 回收溶劑至干， 殘?jiān)昧鲃?dòng)相溶解， 轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中， 定容. 樣品使用前均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾. 精密吸取樣品溶液20 μL， 注入液相色譜儀， 測(cè)定.

4 Box-Behnken 響應(yīng)面法

4.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考2015版《中國(guó)藥典》， 在前期預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 采用響應(yīng)面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)， 對(duì)鹽酸濃度(A)、 提取時(shí)間(B)、 液料比(C)進(jìn)行考察， 設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面， 共選取19個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)， 因素水平、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2、 3.

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels of the method

表3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.3 Design and results of Box-Behnken experiment

續(xù)表3

StdRunA cHCl/mol·L-1 B t/min C 液料比/mL·g-1 D m洋金花/g R 提取率/% 181(-1)10(-1)15(0)0．99970．1422791(-1)30(0)25(1)0．99930．179419102(0)30(0)15(0)1．00400．31333111(-1)50(1)15(0)1．00100．24479122(0)10(-1)5(-1)0．99950．15145131(-1)30(0)5(-1)1．00100．156611142(0)10(-1)25(1)1．00000．16212153(1)10(-1)15(0)0．99960．268613162(0)30(0)15(0)1．00300．32906173(1)30(0)5(-1)1．00300．250917181(-1)30(0)30(1．5)?1．00600．195218192(0)15(-0．75)?15(0)1．00000．2157

注：括號(hào)中數(shù)據(jù)為因素水平值，其中加*數(shù)據(jù)為軟件設(shè)計(jì)外的實(shí)驗(yàn)取點(diǎn)

4.2 結(jié)果與分析

將上述結(jié)果數(shù)據(jù)利用Design-Expert 8.0.5b軟件對(duì)A、B和C進(jìn)行多元線性回歸及二項(xiàng)式擬合， 得方程：R=-0.184 7+0.161 3A+1.011×10-2B+8.503×10-3C-6.988×10-4AB+1.180×10-3AC+1.773×10-4BC-2.722×10-2A2-1.450×10-4B2-4.384×10-4C2，r2=0.941 1. 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

由表4可知， 依據(jù)F值的大小， 各因素對(duì)提取率影響程度依次為A>B>C. 同時(shí)A、B、C、B2、C2各項(xiàng)都達(dá)到了極顯著水平(P<0.01)，BC項(xiàng)達(dá)顯著水平(P<0.05). 表明3個(gè)因素對(duì)東莨菪堿的提取均有極顯著的影響， 其中液料比和提取時(shí)間交互作用也會(huì)對(duì)東莨菪堿的提取率帶有顯著影響.

表4 方差分析Tab.4 Variance analysis of the method

注：P<0.05為顯著水平，P<0.01為極顯著水平

運(yùn)用軟件將各因素對(duì)東莨菪堿的提取影響繪制成響應(yīng)面及等高線圖(見(jiàn)圖2)， 了解各因素的交互作用對(duì)提取率的影響. 圖2(a)顯示， 提取率隨鹽酸濃度(A)的增加先迅速升高后增幅緩慢， 隨提取時(shí)間(B)的增加先升高后緩慢降低. 圖2(b)顯示， 提取率隨鹽酸濃度(A)的增加先迅速升高后緩慢降低， 隨液料比(C)的增加先升后降. 圖2(c)顯示， 提取率隨提取時(shí)間(B)的增加先升后降， 隨液料比(C)的增加先升后降.

4.3 優(yōu)化工藝和驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 8.0.5b軟件， 對(duì)模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析， 得到洋金花中東莨菪堿的最優(yōu)提取工藝為： 鹽酸濃度3 mol·L-1、 提取時(shí)間42.56 min、 液料比24.46 mL·g-1、 提取率為0.394 6%. 考慮到實(shí)際操作的可行性， 最終確定為鹽酸濃度3 mol·L-1， 提取時(shí)間43 min， 液料比25 mL·g-1， 根據(jù)優(yōu)化工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)， 平行3次， 平均提取率為0.383 7%， 實(shí)際值與預(yù)測(cè)值的偏差為2.76%， 表明其相關(guān)性良好， 說(shuō)明對(duì)洋金花中東莨菪堿的提取進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化合理可行.

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OptimizationontheextractionofscopolaminefromtheflowerofDaturametelL.byresponsesurfacemethodology

HUANG Huiming1, LI Shanshan1, YANG Min1, LIN Shuangshuang1, WU Weijian1, LIN Hongtao1,LIN Zhenyu2, QIU Bin2, ZHENG Kaibin1

(1. Subtropical Agricultural Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Zhangzhou, Fujian 363000, China;2. College of Chemistry, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China)

In this study, the extraction method of scopolamine fromDaturametelL. was the ultrasonic extraction, while its mass concentration was detected by HPLC. Factors in the extraction process were investigated in a series of experiments designed by response surface methodology. Combined with the actual situation and the operable principles, the optimized conditions were as follows: the concentration of hydrochloric acid was 3 mol·L-1, extraction time was 43 min, and the ratio of liquid to solid was 25 mL·g-1. The results displayed that the difference between the real value and the predicted value was 2.76%, showed good correlation, which indicating that the optimization on the extraction of scopolamine from the flower ofDaturametelL. by response surface methodology was reasonable and practicable.

response surface methodology;DaturametelL.; scopolamine； extract

10.7631/issn.1000-2243.2017.05.0770

1000-2243(2017)05-0770-05

O652.1

A

2017-06-08

鄭開(kāi)斌(1966-)， 博士， 研究員， 主要從事作物品質(zhì)育種及芳香藥用植物天然產(chǎn)物方面的研究， 409119296@qq.com

福建省省屬公益類科研院所基本科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2015R1013-4)； 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(YC2017-2)

(責(zé)任編輯： 洪江星)