何連軍 呂偉德 楊菊妹

1杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江省杭州市 310018 2磐安縣人民醫(yī)院 浙江省金華市 322300

多花黃精活性多糖提取分離及含量測(cè)定研究

何連軍1呂偉德1楊菊妹2

1杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 浙江省杭州市 310018 2磐安縣人民醫(yī)院 浙江省金華市 322300

目的：對(duì)多花黃精活性多糖的提取分離方法進(jìn)行試驗(yàn)，確定最佳的提取分離方法，并對(duì)提取分離后的粗多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。方法：采用超聲輔助水浴提取，醇沉分離得到多花黃精粗多糖。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在488nm波長(zhǎng)處，采用苯酚-硫酸法對(duì)多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：葡萄糖在20～100mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r＞0.999），RSD為0.23%～1.51%，平均加樣回收率為100.2%。測(cè)定結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的多花黃精活性多糖含量存在較大的差異。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確高，可用于多花黃精多糖提取分離及含量測(cè)定的分析研究。

多花黃精；多糖；苯酚-硫酸法；紫外-可見分光光度

黃精為百合科多年生草本植物，按形狀不同，主要分為滇黃精、黃精和多花黃精等，習(xí)稱“大黃精”、“雞頭黃精”、“姜形黃精” ，其中以多花黃精的質(zhì)量最佳、藥效最好[1]。多花黃精又名姜形黃精，屬于黃精中的優(yōu)質(zhì)品種，中藥取其干燥根莖入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎等功效。黃精多糖是黃精重要的化學(xué)組成部分，是黃精的主要生物活性成分。

目前，植物多糖含量測(cè)定方法尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，常用的方法有滴定法、分光光度法(UV-Vis)、高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、高效毛細(xì)管電泳(HPCE)、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAEC-PAD）[2]等。多糖含量測(cè)定最經(jīng)典的方法是滴定法和分光光度法，其他方法主要用于測(cè)定多糖水解后單糖的組成。黃精多糖的提取方法有熱水浸提法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、減壓內(nèi)部沸騰法等[3]，其中最常用的是熱水浸提法。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多花黃精活性多糖的提取分離方法進(jìn)行了研究，確定了最佳的提取分離條件。并以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法對(duì)多糖的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便快速，準(zhǔn)確度高，可作為多花黃精活性多糖提取分離及含量測(cè)定的分析研究。

1 儀器、試劑與材料

UV-1800紫外-可見分光光度計(jì)；DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī)；AR223CN電子天平；HP550-S數(shù)顯電加熱板；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；TGL-16M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；DZF-6050MBE真空干燥箱；DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；KQ3200E超聲波清洗器；旋渦振蕩器；明澈-D 24UV純水/超純水一體化系統(tǒng)。

乙醇、苯酚、濃硫酸等試劑均為分析純；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%）；實(shí)驗(yàn)室用水為電阻率≥18.2 MΩ·cm超純水。

多花黃精根莖新鮮樣品分別購自河南、安徽、四川、浙江和江西。

2 方法與結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

精密稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，置于100mL量瓶中，以超純水溶解并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.2 多花黃精粗多糖樣品的制備

取新鮮多花黃精根莖樣品洗凈，晾干，切成薄片，放在干燥箱中60℃烘干，粉碎后過60目篩，低溫保存。稱取多花黃精粉末樣品20g，加95%乙醇200mL回流2h脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取1h，過濾，減壓濃縮濾液至50mL，離心，取上清液，在攪拌下慢慢加入200mL無水乙醇，靜置過夜，離心，用無水乙醇清洗沉淀二次，真空干燥得多花黃精粗多糖。精密稱取粗多糖樣品10mg，置于100mL量瓶中，以超純水溶解并定容至刻度，搖勻，備用。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和多花黃精粗多糖樣品溶液各1.0mL置于10mL具塞刻度比色管，分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸（與液面垂直懸空加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混勻），放在旋渦振蕩器上使反應(yīng)液充分混勻，然后將比色管放在100℃水浴中反應(yīng)20min，取出后用冰水浴迅速冷卻至室溫，在200～600nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)用分光光度計(jì)進(jìn)行掃描，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液均在488nm 波長(zhǎng)處有最大吸收峰，故選488nm作為本實(shí)驗(yàn)的測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL分 置 于 10mL具塞刻度比色管中，補(bǔ)加水至1.0mL，配制成濃度分別為0.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。分別加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻后迅速加入5.0mL濃硫酸，靜止10min。放在旋渦振蕩器上使反應(yīng)液充分混勻，然后將比色管放在100℃水浴中反應(yīng)20min，取出后用冰水浴迅速冷卻至室溫。以空白溶液為參比，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以葡萄糖糖質(zhì)量濃度c(mg/L )為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為A=0.0081c-0.0192，相關(guān)系數(shù)r= 0.9991。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在20～100mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.60mL6份置于10mL具塞刻度比色管中，按2.4項(xiàng)下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度值的RSD為0.23%。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取多花黃精粗多糖樣品溶液1.0mL，按2.4項(xiàng)下的方法顯色，在488nm波長(zhǎng)處，以空白溶液為參比，每隔半小時(shí)測(cè)定一次吸光度，連續(xù)測(cè)定3h，計(jì)算吸光度值的RSD為0.57%，結(jié)果表明，在3h內(nèi)樣品溶液吸光度穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取多花黃精粗多糖樣品10mg至100mL量瓶中，平行6份，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。分別精密吸取樣品溶液1.0mL，按2.4項(xiàng)下方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算吸光度值的RSD為1.51%。結(jié)果表明，方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取多花黃精粗多糖樣品10mg，置于100mL容量瓶中，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。精密吸取粗多糖樣品溶液0.50mL共6份置于10mL具塞刻度比色管中，分別 精密加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.50mL，混勻后，按2.4項(xiàng)下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算葡萄糖的回收率，結(jié)果見表1。由表中可知，葡萄糖的加樣回收率在98.5%～102.3%，RSD為1.56%，表明本方法有良好的準(zhǔn)確度。

2.9 多花黃精提取分離方法試驗(yàn)

2.9.1 提取方法的選擇

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，分別采用煎煮、加熱回流和100℃水浴超聲提取1h，過濾，減壓濃縮濾液至50 mL，離心，取上清液，在攪拌下慢慢加入200mL無水乙醇，使含醇量達(dá)80%，靜置過夜，離心，用無水乙醇清洗沉淀二次，真空干燥得多花黃精粗多糖。稱取粗多糖樣品10mg，按上述2.4項(xiàng)下方法顯色，在488nm波長(zhǎng)處，以空白溶液為參比測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖的含量，并按下式計(jì)算多糖得率：

結(jié)果表明煎煮提取多糖得率最低，加熱回流和超聲水浴得率差不多，但超聲水浴在1h內(nèi)就能達(dá)到較好的提取效果，而加熱回流需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能達(dá)到相同的效果，操作也相對(duì)復(fù)雜。因此，本實(shí)驗(yàn)選用沸水浴超聲輔助提取多花黃精中的多糖。

2.9.2 提取用水量試驗(yàn)

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200 mL回流2 h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以10、20、30倍量的超純水，100℃水浴超聲提取1h，再按2.9.1項(xiàng)下方法處理并測(cè)定多糖的含量，計(jì)算多糖得率。結(jié)果表明，以10倍量水提取多糖得率較低，以20和30倍水量提取多糖得率差不多。因此，本實(shí)驗(yàn)選用20倍水量作為提取溶劑。

2.9.3 提取溫度試驗(yàn)

取多花黃精粉末20g，加95%乙醇200 mL回流2 h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，分別以40℃、60℃、80℃、100℃水浴超聲提取1h，再按2.9.1項(xiàng)下方法處理并測(cè)定多糖的含量，計(jì)算多糖得率。結(jié)果表明，100℃水浴超聲提取多糖得率最高。

2.9.4 提取時(shí)間及次數(shù)試驗(yàn)

取多花黃精粉末20g，加95%的乙醇200mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水，以100℃水浴超聲提取，分別提取0.5h、1h、2h，提取次數(shù)分一次河兩次，再按2.9.1項(xiàng)下方法處理并測(cè)定多糖的含量，計(jì)算多糖得率。結(jié)果表明，以1h提取兩次多糖得率最高。

2.9.5 醇沉濃度試驗(yàn)

取多花黃精粉末100g，加95%乙醇1000mL回流2h 脫脂，過濾，干燥得多花黃精藥渣。藥渣以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取兩次，每次1h，過濾，合并濾液，減壓濃縮濾液至250mL，離心，取上清液，平均分為5份，在攪拌下分別慢慢加入無水乙醇，使含醇量達(dá)50%、60%、70%、80%、90%，再按2.9.1項(xiàng)下方法處理并測(cè)定多糖的含量，計(jì)算多糖得率。結(jié)果表明含醇量達(dá)80%時(shí)，多糖得率最高。

2.10 樣品的測(cè)定

精密稱取六批不同產(chǎn)地的多花黃精粗多糖樣品各10mg，置于100mL量瓶中，用超純水稀釋并定容至刻度，搖勻。分別精密吸取樣品溶液1.0mL，按2.4項(xiàng)下的方法顯色，以空白溶液為參比，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算粗多糖中多糖的含量，并按2.9.1項(xiàng)下的公式計(jì)算多糖得率，結(jié)果見表2。

結(jié)果表明，不同產(chǎn)地和來源的多花黃精活性多糖含量和得率存在較為明顯的差異，其中以河南伏牛山野生的多花黃精多糖含量和得率最高。

表1：加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

表2：不同產(chǎn)地多花黃精多糖含量和得率

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)多花黃精活性多糖的提取分離方法進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果表明，多花黃精經(jīng)無水乙醇回流脫脂后，以20倍量的超純水100℃水浴下超聲提取兩次，每次1h，濾液經(jīng)減壓濃縮，離心，取上清液加無水乙醇使含醇量達(dá)80%左右時(shí)，得到的粗多糖得率最高。同時(shí)，采用苯酚-硫酸法對(duì)多花黃精粗多糖的含量進(jìn)行了測(cè)定，考察了方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率等。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)便快速，精密度高，重復(fù)性好，準(zhǔn)確可靠，可作為多花黃精活性多糖提取分離和含量測(cè)定的分析研究。

本實(shí)驗(yàn)還對(duì)不同來源和產(chǎn)地的多花黃精多糖的含量進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地和來源的多花黃精活性多糖含量和得率存在較為明顯的差異，其中以河南伏牛山野生多花黃精含量和得率最高。由于不同產(chǎn)地的多花黃精品種不同，而且生長(zhǎng)地域海拔、氣候等條件千差萬別，造成其多糖含量也各不相同，不同產(chǎn)地及品種的多花黃精其多糖活性和臨床作用是否一致，還需要作進(jìn)一步研究。

[1]中國藥典[S].一部,2015.

[2]何連軍,干雅平,呂偉德,饒君鳳,楊菊妹,余家勝.高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定多花黃精多糖的單糖組成[J].中草藥,2017,48(08):1671-1676.

[3]任奕. 黃精多糖提取工藝研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)科技與裝備,2017(07):57-58.

浙江省科技廳分析測(cè)試科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C37020)。

何連軍（1971-），男，碩士學(xué)位。高級(jí)實(shí)驗(yàn)師/高級(jí)工程師。研究方向?yàn)樯V、光譜分析技術(shù)研究。