李亞梅 關(guān)晏星 陳學(xué)忠 張青 張慶 章夢芝

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131I-B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用

李亞梅 關(guān)晏星 陳學(xué)忠 張青 張慶 章夢芝

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科 南昌 330006）

人類表皮生長因子受體2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2)是乳腺癌最重要的致病基因。本文探討131I標(biāo)記的HER-2特異結(jié)合小分子模擬肽B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷作用。采用溴代琥珀酰亞胺法(N-Bromide Succinimide, NBS)進(jìn)行131I標(biāo)記B2-S22-AFA，測定標(biāo)記率、放化純度、穩(wěn)定性及免疫活性。用Western Blot法和免疫組化法測定人乳腺癌SKBR3及MDA-MB-231Her-2細(xì)胞HER-2表達(dá)，觀察不同濃度表皮生長因子(Epidermal Growth Factor, EGF)條件下B2-S22-AFA對細(xì)胞生長的抑制率。設(shè)B2-S22-AFA組（B2-S22-AFA終濃度1 μg?mL–1）、131I-B2-S22-AFA組（131I-B2-S22-AFA終濃度144 kBq?μg–1?mL）、131I組（131I終濃度144 kBq?mL–1）、陰性對照組及試劑空白組，每組EGF終濃度均5.0 pg?mL–1，采用四唑鹽比色法(Methyl Thiazolyl Tetrazolium, MTT)測定SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性，觀察131I-B2-S22-AFA、B2-S22-AFA及131I作用不同時(shí)間對兩種細(xì)胞生長的抑制率。結(jié)果顯示，HER-2在SKBR3細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)，在MDA-MB-231細(xì)胞呈弱（或低）表達(dá)。131I-B2-S22-AFA標(biāo)記率、放化純度及比活度分別為64.8%–79.6%、95.0%–97.6%、151.7 MBq?mg–1，在37 °C血清中放置4 h、12 h、24 h、48 h、72 h的放化純度分別95.4%、93.5%、91.4%、88.2%、77.4%，131I-B2-S22-AFA與SKBR3細(xì)胞及MDA-MB-231細(xì)胞的最大結(jié)合率分別(66.47±3.24)%和(3.89±0.81)%（3次）。當(dāng)EGF存在時(shí)，B2-S22-AFA可明顯抑制SKBR3細(xì)胞生長；無EGF時(shí)，B2-S22-AFA無此作用。131I-B2-S22-AFA對SKBR3細(xì)胞的殺傷作用較B2-S22-AFA和131I明顯增強(qiáng)（均＜0.05），B2-S22-AFA對SKBR3細(xì)胞殺傷作用顯著高于131I (＜0.05)，131I-B2-S22-AFA和B2-S22-AFA對MDA-MB-231細(xì)胞均無殺傷作用。綜上所述，131I-B2-S22-AFA可顯著加強(qiáng)、加速B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的特異性殺傷作用。

乳腺癌，同位素標(biāo)記，131I-B2-S22-AFA，表皮生長因子受體2

乳腺癌是全球婦女最常見的惡性腫瘤之一，我國乳腺癌的死亡率呈逐年上升趨勢[1]。研究證明[2]，人類表皮生長因子受體2 (Human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2)與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、放化療抵抗及不良預(yù)后密切相關(guān)，HER-2靶向治療已經(jīng)成為乳腺癌生物治療的主要手段，其中針對HER-2受體胞外結(jié)合區(qū)的抗腫瘤生物靶向治療藥物人源化抗HER-2單克隆抗體赫賽汀的臨床應(yīng)用顯示出良好的臨床效果，但由于分子量大，難以到達(dá)實(shí)體瘤深部，療效受到限制，大規(guī)模臨床使用后又發(fā)現(xiàn)了耐藥的產(chǎn)生。本研究在Berezov等[3]研究成果的基礎(chǔ)上，對具有同樣阻斷HER-2功能的小分子多肽B2-S22-AFA進(jìn)行131I標(biāo)記，觀察其在體外對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞SKBR3的生物和放射性雙重靶向殺傷作用，為HER-2陽性乳腺癌靶向治療研究增添新手段，為提高乳腺癌HER-2生物靶向治療效果的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及器材

HER-2高親和力模擬肽B2-S22-AFA（序列為：YCFPDEEGACY）的合成與純化（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，純度98%以上）；細(xì)胞株SKBR3和MDA-MB-231（中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫）；重組人表皮生長因子(Epidermal Growth Factors, EGF)（美國Cytolab公司產(chǎn)品）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（北京中杉生物公司產(chǎn)品）；抗-HER-2單克隆抗體（美國Milipore公司產(chǎn)品）；無載體Na131I（中國原子能科學(xué)院同位素所生產(chǎn)）；N-溴代琥珀酸亞胺(N-Bromide Succinimide, NBS)、Sephadex G-25、MTT（4,5-二甲基噻唑-2-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）、胰蛋白酶和DMSO（二甲基亞砜）均美國Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清（美國Hyclone公司產(chǎn)品）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gebico公司產(chǎn)品）；0.22mm濾膜（美國Millipor產(chǎn)品）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Costar公司產(chǎn)品）。GC-911型γ免疫計(jì)數(shù)儀（合肥中佳光電儀器公司產(chǎn)品）；酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀2550（美國BIO-RAD公司產(chǎn)品）；RM-905A放射性活度計(jì)（中國科學(xué)計(jì)量研究院產(chǎn)品）；高速低溫冷凍離心機(jī)（美國SIGMA公司產(chǎn)品）；CPA64型電子天平（美國Sartorius公司產(chǎn)品）；倒置顯微鏡（美國Leica公司生產(chǎn)）；DHZ-C型可調(diào)式恒溫振蕩儀（江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠生產(chǎn)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞復(fù)蘇后，加RPMI 1640培養(yǎng)液（內(nèi)含2 mmol?L?1谷氨酰胺，100 U·mL?1的青霉素和鏈霉素，對SKBR3細(xì)胞培養(yǎng)另加滅活的10%新生小牛血清，對MDA- MB-231細(xì)胞培養(yǎng)另加10%胎牛血清）置于37 °C、5% CO2、95%濕度的孵箱培養(yǎng)，每24 h換液一次，每2?3 d（細(xì)胞覆蓋率達(dá)70%?80%）傳代一次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，根據(jù)培養(yǎng)基中酚紅顏色判斷細(xì)胞代謝狀態(tài)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人乳腺癌細(xì)胞表面HER-2表達(dá)水平測定

采用Western Blot和免疫組化法測定人乳腺癌SKBR3、MDA-MB-231細(xì)胞表面HER-2表達(dá)水平。

免疫組化(Immunohistochemistry, IHC)法：對數(shù)生長期的SKBR3細(xì)胞、MDA-MB-2321細(xì)胞，胰酶消化，以(5?10)×104細(xì)胞數(shù)分別接種于放好滅菌爬片的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，孵箱培養(yǎng)24 h，磷酸鹽緩沖液漂洗，加4%多聚甲醛固定30 min，漂洗，3% H2O2孵育15 min，再漂洗。用10%的山羊血清封閉30min，傾去封閉液，滴加一抗（兔抗HER-2抗體）200 μL，4 °C孵育過夜?？瞻讓φ沼肞BS代替一抗，均漂洗后滴加二抗（山羊抗兔）200 μL，37 °C結(jié)合30 min。漂洗袪除游離抗體，滴加二氨基聯(lián)苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)底物顯色液，避光孵育5?10 min，自來水沖洗，蘇木素復(fù)核15?30 s，封片，顯微鏡下觀察并采集圖像。由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師綜合陽性細(xì)胞所占比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析[4]。陽性細(xì)胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞數(shù)小于10%者計(jì)0分，10%?40%者計(jì)1分，40%?70%者計(jì)2分，大于等于70%者計(jì)3分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不著色者計(jì)0分，淡黃色者計(jì)1分，棕黃色者計(jì)2分，黃褐色者計(jì)3分。兩種評分相加：0?1分為不表達(dá)(?)，2分為弱陽性表達(dá)(+)，3?4分為陽性表達(dá)(2+)，5?6分為強(qiáng)陽性表達(dá)(3+)。

蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)法：對數(shù)生長期的SKBR3細(xì)胞、MDA-MB-2321細(xì)胞接種于平皿培養(yǎng)板，培養(yǎng)至細(xì)胞長滿整壁，收集細(xì)胞，加細(xì)胞裂解液RIPA 100 μL，12000 r?min?1，離心20 min。取上清，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定SKBR3、MDA-MB-231細(xì)胞表面蛋白含量，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對照，取等量蛋白將二種細(xì)胞蛋白上樣SDS-PAGE膠孔進(jìn)行電泳。電泳完畢電轉(zhuǎn)印，5%脫脂奶粉封閉，4 °C過夜，依次與一抗（鼠抗人HER-2抗體）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG）作用，分別采用電化學(xué)發(fā)光免疫檢測法(Electrochemical Luminescence, ECL)及DAB染色法進(jìn)行Western印跡分析。

1.2.3 B2-S22-AFA的131I標(biāo)記及質(zhì)量鑒定

采用溴代琥珀酰亞胺法：首先用0.1 mol?L?1PBS (pH 7.4)溶解B2-S22-AFA和NBS，依次加入B2-S22-AFA 0.5 mg/0.2 mL、Na131I 55.5 MBq/ 0.2mL、NBS 2 μg/5 μL，室溫下振蕩60 s，反應(yīng)結(jié)束。三氯醋酸沉淀法測定標(biāo)記率：取標(biāo)記反應(yīng)液5μL、5% BSA 50 μL及5%三氯醋酸0.2 mL，混勻，2000 g離心5 min，測定每管（雙復(fù)管）總放射性計(jì)數(shù)()，吸去上清，測沉淀放射性計(jì)數(shù)()。計(jì)算標(biāo)記率(Labeling Rate, LR)：

L=(/)×100% (1)

采用Sephadex G-25凝膠柱層析過濾純化標(biāo)記反應(yīng)液，以每分鐘15滴的速度分部收集淋洗液，共收集60管，每管1 mL（約20滴），測定每管放射性，將測量結(jié)果對管次作圖，得到131I-B2-S22-AFA洗脫曲線，收集放射性活度最高的蛋白峰管的洗脫液即為純化后的標(biāo)記產(chǎn)品131I-B2-S22-AFA。標(biāo)記產(chǎn)品用新華1號濾紙點(diǎn)樣，以丙酮:生理鹽水體積比為1:1的混合液作展開劑，做上行紙層析，將層析完后的層析紙從下到上逐段剪開（每段1.0 cm），分別測量放射性，131I-B2-S22-AFA濃聚部位的放射性計(jì)數(shù)(counts per minute, cpm)即cpm與紙層析點(diǎn)樣的總放射性計(jì)數(shù)cpm比值即為131I-B2-S22-AFA的放化純度(Radiochemical Purity, RCP)。

=cpm/cpm×100% (2)

另將131I-B2-S22-AFA加入人血清中37 °C水浴箱分別放置4 h、12 h、24 h、48 h、72 h，測定RCP，觀察穩(wěn)定性。取131I-B2-S22-AFA 100 μL和10 μL分別測定其蛋白含量（紫外分光光度法）和放射性活度（計(jì)數(shù)法），計(jì)算131I-B2-S22-AFA比活度（放射性活度/單位蛋白量）。采用細(xì)胞結(jié)合法檢測131I- B2-S22-AFA的免疫活性：取50 μL131I-B2-S22-AFA分別加入過量的SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞中（均(5?6)×105)，于 37 °C孵育2 h，離心后，分別測定上清液（為游離131I）放射性計(jì)數(shù)(cpm)和沉淀（為與細(xì)胞結(jié)合的131I-B2-S22-AFA）的放射性計(jì)數(shù)(cpm)。計(jì)算細(xì)胞結(jié)合率(Binding Rate of Cells, BRC)：

乙型肝炎時(shí)現(xiàn)在世界上感染人數(shù)最多的疾病,我國大約有9.75%的乙肝病毒攜帶者,該疾病傳播速度快,死亡率高。根據(jù)研究分析,當(dāng)前乙肝病毒會引起肝硬化、肝癌等嚴(yán)重疾病,這是患者死亡的主要原因。乙型肝炎的臨床傳播是通過血液和皮膚黏膜進(jìn)行的,如果醫(yī)院對血制品進(jìn)行嚴(yán)格的控制,對輸血過程進(jìn)行規(guī)范化管理,就能夠讓乙肝病毒傳播減少[3]。日常的擁抱、握手和用餐并不會導(dǎo)致乙肝病毒傳播。為了減少乙肝病毒的感染率,現(xiàn)在臨床中最重要的就是對乙肝病毒復(fù)制情況進(jìn)行檢測,方便臨床對癥下藥治療,提升患者的治愈率。

=cpm/ (cpm+cpm)×100% (3)

1.2.4131I -B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞殺傷作用

EGF促細(xì)胞生長的有效濃度測定：采用MTT法測定細(xì)胞增殖活性，取SKBR3和MDA-MB-231單細(xì)胞懸液種于96孔培養(yǎng)板中，每孔103個(gè)細(xì)胞，設(shè)三個(gè)復(fù)孔，按前述條件孵箱培養(yǎng)4h，待細(xì)胞貼壁后，設(shè)不同濃度EGF組（experimental group, eg，EGF終濃度分別0.15 pg?mL?1、0.31 pg?mL?1、0.63pg?mL?1、1.25 pg?mL?1、2.5 pg?mL?1、5 pg?mL?1、10 pg?mL?1、20 pg?mL?1[5]），陰性對照組（negative control group, ncg，為單純細(xì)胞）及試劑空白組（reagent blank group, rbg，僅1640培養(yǎng)液，作為吸光度值的零點(diǎn)），每孔總體積200 μL，孵箱培養(yǎng)96 h后，加入20 μL濃度為5 mg?mL?1的MTT，繼續(xù)孵育4 h，吸棄上清，每孔加250 μL DMSO，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長下測定其光吸收值(OD490)。計(jì)算細(xì)胞存活率(Survival Rate of Cell, SRC)，繪制EGF對兩種細(xì)胞生長的劑量-效應(yīng)曲線，為后續(xù)研究選擇EGF濃度提供參考。

RC(%)=[(OD490(eg)?OD490(rbg))/(OD490(ncg)?

OD490(rbg))]×100 % (4)

B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用：取上述兩種乳腺癌細(xì)胞的單細(xì)胞懸液分別種于96孔培養(yǎng)板中，每孔103個(gè)細(xì)胞(100 μL)，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，孵箱培養(yǎng)4 h。設(shè)EGF組（濃度分別5 pg?mL?1、10pg?mL?1、20 pg?mL?1），B2-S22-AFA組（取5μg?mL?1的B2-S22-AFA[6]，加入100 μL/孔）、EGF加B2-S22-AFA組、陰性對照組及試劑空白組，每孔最終體積為200 μL，均培養(yǎng)48 h，采用MTT法測定細(xì)胞增殖活性，比較B2-S22-AFA對兩種乳腺癌細(xì)胞生長的抑制率(The Inhibitory Rate of Cell Growth, IRCG)。

IRCG(%)=[( OD490(ncg)?OD490(rbg))?(OD490(eg)?

OD490(rbg))/(OD490(ncg)?OD490(rbg))]×100% (5)

131I-B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞的殺傷作用：取上述兩種乳腺癌細(xì)胞的單細(xì)胞懸液分別種于96孔培養(yǎng)板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞(100 μL)，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，孵箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)B2-S22-AFA組（加入B2-S22-AFA的終濃度為1μg?mL?1）、131I-B2-S22-AFA組（加入131I-B2-S22- AFA的終濃度144 kBq/1 μg?mL?1）、131I組（加入131I的終濃度為144 kBq?mL?1）、陰性對照組及試劑空白組，每組EGF終濃度均5.0 pg?mL?1，每孔最終體積200 μL。各組孵箱培養(yǎng)分別24 h、48 h、72 h、96 h后，采用MTT法測定細(xì)胞增殖活性。計(jì)算不同時(shí)間各組抑制率，比較131I-B2-S22-AFA、B2-S22-AFA及131I對兩種不同乳腺癌細(xì)胞生長的抑制率。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞表面HER-2表達(dá)水平

免疫組化檢測結(jié)果顯示，SK-BR-3細(xì)胞HER-2表達(dá)強(qiáng)陽性(3+)，MDA-MB-231細(xì)胞HER-2表達(dá)陰性（圖1）。Western Blot法檢測，ECL和DAB兩種顯色方法佐證的結(jié)果相同：均見SKBR3在蛋白量40mg時(shí)已出現(xiàn)條帶，條帶粗細(xì)均與上樣蛋白量呈正相關(guān)；MDA-MB-231在蛋白量達(dá)160mg時(shí)仍未出現(xiàn)條帶（圖2）。

圖1 IHC分析示SK-BR-3細(xì)胞HER-2表達(dá)(3+)(a)和MDA-MB-231細(xì)胞HER-2表達(dá)(?)(b)(×400)

圖2 乳腺癌SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞表面HER-2蛋白表達(dá)分析 (a) ECI方法，(b) DAB法

2.2 131I-B2-S22-AFA鑒定

采用NBS法碘-131標(biāo)記B2-S22-AFA的標(biāo)記率為64.8%?79.6%，經(jīng)SephadexG-25凝膠柱層析過濾純化標(biāo)記反應(yīng)液后得到明顯的雙峰曲線，即產(chǎn)品131I-B2-S22-AFA峰高、尖、窄，131I鹽峰低平，未見131I-B2-S22-AFA損傷峰和聚合峰（圖3）。131I-B2-S22-AFA放化純度為95.0%?97.6%，比活度為151.7 MBq?mg?1。37 °C血清中放置4 h、12 h、24 h、48 h、72 h的放化純度分別95.4%、93.5%、91.4%、88.2%、77.4%。131I-B2-S22-AFA與HER-2高表達(dá)的SKBR3細(xì)胞和HER-2低或不表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞最大結(jié)合率分別(66.47±3.24)%和(3.89±0.81)%（3次）。

圖3 131I標(biāo)記HER2模擬肽(131I-B2-S22-AFA)洗脫曲線

2.3 EGF對兩種乳腺癌細(xì)胞生長促進(jìn)作用的有效濃度測定

EGF對SKBR3和MDA-MB-231細(xì)胞生長均有促進(jìn)作用，但在相同EGF濃度下對HER-2高表達(dá)的SKBR3作用明顯強(qiáng)于MDA-MB-231細(xì)胞，當(dāng)其濃度為5 pg?mL?1時(shí)，對兩種細(xì)胞均有明顯的促生長作用（圖4）。

2.4 B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用

圖4 EGF作用于SKBR3、MDA-MB-231細(xì)胞的劑量效應(yīng)曲線

2.5 131I-B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)SKBR3細(xì)胞的殺傷作用

表1顯示在131I-B2-S22-AFA與B2-S22-AFA化學(xué)量相同的條件下，131I-B2-S22-AFA組對HER-2高表達(dá)SKBR3細(xì)胞作用各時(shí)相的抑制率均顯著高于未標(biāo)記B2-S22-AFA組和游離131I組(＜0.05)；131I-B2-S22-AFA組和B2-S22-AFA組對SKBR3細(xì)胞生長的抑制率分別在48 h和72 h達(dá)到最大（圖6），131I-B2-S22-AFA的最高抑制率(67.01±3.22)%顯著高于B2-S22-AFA的最高抑制率(49.25±0.374)%，<0.05。未標(biāo)記B2-S22-AFA組對SKBR3細(xì)胞作用各時(shí)相的抑制率均顯著高于游離131I（均<0.05）。

圖5 EGF不同濃度下B2-S22-AFA對兩種細(xì)胞生長的影響 (a) SKBR3細(xì)胞，(b) MDA-MB-231細(xì)胞

表1 不同處理組作用不同時(shí)間對SKBR3細(xì)胞生長的抑制率

注：(1)與(2)比較、(1)與(3)比較及(2)與(3)比較均<0.05

Note: Comparison between (1) and (2), (1) and (3), (2) and (3), all<0.05.

圖6 各藥物組對HER-2高表達(dá)SKBR3細(xì)胞生長的時(shí)間-抑制曲線

顯微鏡下觀察碘-131標(biāo)記與未標(biāo)記B2-S22- AFA組SKBR3細(xì)胞生長狀態(tài)，顯示B2-S22-AFA組細(xì)胞生長狀態(tài)差，細(xì)胞透明度減低，核顆粒明顯增多，染色質(zhì)增粗呈松解狀態(tài)，但細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變。131I-B2-S22-AFA組大部分細(xì)胞分解、核碎裂，形態(tài)不規(guī)則、細(xì)胞碎片多（圖7、8）。131I-B2-S22-AFA作用的MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形、條形或多角形，生長狀態(tài)良好（×400倍）（圖9）。

圖7 B2-S22-AFA作用SKBR3細(xì)胞48 h后，鏡下細(xì)胞生長狀態(tài)差，細(xì)胞透明度減低，核顆粒明顯增多，染色質(zhì)增粗呈松解狀態(tài)，但細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變（×400倍）

圖8 131I-B2-S22-AFA作用SKBR3細(xì)胞48 h后，鏡下大部分細(xì)胞分解、核碎裂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞碎片多見（×400倍）

圖9 131I-B2-S22-AFA作用48 h后，MDA-MB-231細(xì)胞鏡 下細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形、條形或多角形，生長狀態(tài)良好（×400倍）

表2顯示131I-B2-S22-AFA對HER-2低表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞生長的各時(shí)相抑制率均極低，小于10.0%，其與游離131I作用無顯著差異（均>0.05）；B2-S22-AFA對MDA-MB-231細(xì)胞生長無抑制作用。

表2 不同處理組不同作用時(shí)間對MDA-MB-231細(xì)胞生長的抑制率

注：24 h、48 h、72 h：(1)與(2)比較，(2)與(3)比較，<0.05；(1)與(3)比較，>0.05；96 h：(1)與(2)比較，(2)與(3)比較，(1)與(3)比較，均>0.05

Notes: 24 h, 48 h, 72 h: comparison between (1) and (2), (2) and (3),<0.05; (1) and (3),>0.05; 96 h: comparison between (1) and (2), (2) and (3), (1) and (3),>0.05.

3 討論

針對HER-2高表達(dá)乳腺癌的分子影像診斷和靶向治療一直是乳腺癌研究的熱點(diǎn)。B2-S22-AFA為具有11個(gè)氨基酸組成的多肽，可特異結(jié)合HER-2受體的胞外結(jié)合域，阻止配體或各種生長因子（如EGF）與HER-2結(jié)合，從而抑制配體介導(dǎo)的受體活化后導(dǎo)致的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和增殖。赫賽汀的主要作用機(jī)制也即在于此，其聯(lián)合化療藥物的臨床應(yīng)用已作為目前HER-2高表達(dá)乳腺癌的首選治療方案。但是赫賽汀價(jià)格昂貴，對心臟有一定的毒副作用，且由于抗體分子量大，難以到達(dá)實(shí)體瘤深部，減弱治療效果；鼠源性單抗用于人體還可產(chǎn)生人抗鼠抗體(Human Anti Mouse Antibody, HAMA)的不良反應(yīng)等。利用小分子多肽模仿抗HER-2抗體與HER-2結(jié)合，同樣可達(dá)到治療目的，并且與單抗相比，小分子多肽具有以下優(yōu)點(diǎn)：1) 可化學(xué)合成，制備方便、經(jīng)濟(jì)；2) 不僅修飾或放射性標(biāo)記過程等苛刻條件對其生物活性影響小，而且利用化學(xué)方法還可優(yōu)化其與受體結(jié)合的親和力，使之具有更好的特異性分布和藥物動力學(xué)性質(zhì)[5]；3)由于分子量小，引起人體免疫反應(yīng)的可能性較小，血漿清除快，可較快濃集于靶器官，較易達(dá)到腫瘤組織深部，提高療效。Berezov等[3]的研究證實(shí)，模擬肽B2-S22-AFA與乳腺癌細(xì)胞HER-1、HER-2、HER-3均具有高結(jié)合親和力，尤其與HER-2結(jié)合的親和力最高，并且與HER-2特異結(jié)合后可阻止二聚體的形成，明顯抑制HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的增殖。這與本研究中B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用研究結(jié)果基本一致。

EGF是潛在的有絲分裂因子，當(dāng)惡性腫瘤高表達(dá)EGFR時(shí)，其通過與靶細(xì)胞受體結(jié)合，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在惡性腫瘤的發(fā)生及生長中起一定的作用。本研究中B2-S22-AFA對乳腺癌細(xì)胞生長的抑制作用研究顯示：在EGF存在的條件下，B2-S22-AFA對體外培養(yǎng)的SKBR3細(xì)胞生長有明顯抑制作用，并隨EGF濃度的增加，抑制率減低，在無EGF的條件下，對SKBR3細(xì)胞生長則無抑制作用。B2-S22-AFA對HER-2低表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞的生長無論有否EGF存在，均無明顯抑制作用。另見B2-S22-AFA對SKBR3細(xì)胞生長不同時(shí)間的抑制率均顯著高于游離131I（均<0.05）。表明B2-S22-AFA通過阻斷EGF促細(xì)胞生長作用特異性抑制HER-2高表達(dá)細(xì)胞的生長。分析其機(jī)制，考慮主要如下：1) HER-2胞外區(qū)分4個(gè)亞區(qū)，Ⅰ、Ⅲ亞區(qū)是配體結(jié)合部位，Ⅳ亞區(qū)是受體與受體結(jié)合部位。受體與配體結(jié)合后，Ⅳ區(qū)更易與游離受體或受體-配體復(fù)合物結(jié)合形成受體二聚體，而HER受體二聚體的形成則是引起信號傳導(dǎo)、導(dǎo)致乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展的重要因素。B2-S22-AFA是根據(jù)HER-2受體4亞區(qū)設(shè)計(jì)的，當(dāng)受體與配體（如EGF等）結(jié)合形成受體-配體復(fù)合物后，B2-S22-AFA才能與受體的4亞區(qū)結(jié)合，阻止受體二聚體的形成，阻斷細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。EGF是旁分泌生長因子，SKBR3細(xì)胞不分泌，所以培養(yǎng)液中需加入一定濃度EGF，B2-S22-AFA才能發(fā)揮作用。2) 當(dāng)EGF濃度過高時(shí)，B2-S22-AFA的抑制作用難以抵抗EGF的促生長作用，則其對SKBR3細(xì)胞生長的抑制作用減弱。

放射性核素碘-131是標(biāo)記蛋白和多肽類的最常用放射性核素[7?9]，易于獲得、價(jià)格便宜，主要發(fā)射β射線，半衰期較長(8.04 d)，有利于發(fā)揮治療作用，此外還可發(fā)射γ射線，用于治療后顯像觀察療效。為進(jìn)一步提高B2-S22-AFA的生物靶向殺傷作用，本研究采用NBS法制備碘-131標(biāo)記的B2-S22-AFA (131I-B2-S22-AFA)，進(jìn)一步觀察該放射性藥物對HER-2高表達(dá)乳腺癌細(xì)胞的放射性和生物靶向雙重殺傷效果。

碘-131標(biāo)記結(jié)果顯示，產(chǎn)品標(biāo)記率較高，放化純度高(95.0%?97.6%)，體外37 °C血清中放置24 h、48 h、72 h的放化純度仍可分別達(dá)到91.4%、88.2%、77.4%，表明較不易分解或脫標(biāo)記，穩(wěn)定性較好。131I-B2-S22-AFA與HER-2高表達(dá)的SKBR3細(xì)胞和HER-2低或不表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞最大結(jié)合率分別為(66.47±3.24)%和(3.89±0.81)%（3次），表明其仍保留有高特異性免疫結(jié)合活性。分析原因，考慮來自兩方面：一是NBS標(biāo)記方法簡單，氧化劑作用溫和，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行，對小分子多肽損傷??；二是該小分子肽兩端各含一個(gè)酪氨酸殘基，可直接標(biāo)記，既有利于獲得較高的131I 標(biāo)記率，也不易影響原有生物活性；另外該小分子多肽呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，較穩(wěn)定，不易被血清中蛋白酶分解。選擇NBS法131I標(biāo)記如此小的短肽，國內(nèi)目前尚未見文獻(xiàn) 報(bào)道。

131I -B2-S22-AFA靶向殺傷作用研究結(jié)果顯示：131I-B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)SKBR3細(xì)胞生長不同時(shí)間的抑制率均顯著高于未標(biāo)記B2-S22-AFA和游離131I（均<0.05）；131I-B2-S22-AFA對SKBR3細(xì)胞生長抑制作用的時(shí)間明顯快于B2-S22-AFA（兩者達(dá)最大抑制率時(shí)間分別48 h和72 h），131I-B2-S22-AFA對MDA-MB-231生長的抑制作用低，與游離131I的作用無顯著差異（均>0.05）。顯微鏡觀察也證實(shí)131I-B2-S22-AFA作用的SKBR3細(xì)胞大部分分解、核碎裂，形態(tài)不規(guī)則，表明有明顯細(xì)胞殺傷。131I -B2-S22-AFA 作用的MDA-MB-231細(xì)胞，形態(tài)規(guī)則，呈梭形、條形或多角形，生長狀態(tài)良好，無損傷。B2-S22-AFA作用的SKBR3細(xì)胞生長狀態(tài)差，細(xì)胞透明度不高，核顆粒明顯增多，染色質(zhì)增粗呈松解狀態(tài)，但細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變，表明其殺傷作用明顯不如131I-B2-S22-AFA。

綜上所述，B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)SKBR3細(xì)胞具有特異性生物殺傷作用，131I-B2-S22-AFA可進(jìn)一步明顯加強(qiáng)、加速B2-S22-AFA的靶向殺傷作用，131I -B2-S22-AFA對HER-2高表達(dá)乳腺癌SKBR3細(xì)胞具有放射性和生物性雙重靶向殺傷作用。

HER-2既是乳腺癌的治療靶點(diǎn)[10?12]，也是HER-2陽性乳腺癌顯像的示蹤分子。我們最近尚采用放射性核素99mTc標(biāo)記此模擬肽，成功制備了HER-2放射性配體99mTc-TP1623，對HER-2高表達(dá)乳腺癌（SKBR3細(xì)胞接種）小鼠顯像研究證明，該標(biāo)記多肽能靶向聚集在腫瘤部位，靶/非靶比值最高達(dá)到5.18[13]。本文研究結(jié)果為進(jìn)一步放射性核素標(biāo)記該模擬肽的體內(nèi)靶向治療實(shí)驗(yàn)研究提供理論依據(jù)。為提高乳腺癌HER-2生物靶向治療效果的研究奠定基礎(chǔ)。

本研究結(jié)果為進(jìn)一步進(jìn)行該標(biāo)記藥物的體內(nèi)靶向治療實(shí)驗(yàn)研究奠定了基礎(chǔ)。

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The killing effect of131I-labeled B2-S22-AFA on breast cancer cells with high HER-2 expression

LI Yamei GUAN Yanxing CHEN Xuezhong ZHANG Qing ZHANG Qing ZHANG Mengzhi

(Department of Nuclear Medicine, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, China)

B2-S22-AFA is a kind of small molecule mimetic polypeptide that can conjugate to epidermal growth factor receptor 2 (HER-2) specifically and has obvious depressant effect on breast cancer cells with overexpressing HER-2.This study aims to investigate the specific killing effect of131I-labeled B2-S22-AFA on breast cancer cell with overexpressing HER-2.131I-B2-S22-AFA was prepared by using N-bromosuccinimide method to measure the labeling efficiency, radiochemical purity, stability, and immunocompetence. The expression levels of HER-2 in SKBR3 and MDA-MB-231 cells were detected by Immunohistochemistry and Western Blot. The inhibitory rate of B2-S22-AFA on cell growth was observed with epidermal growth factors (EGF) at different concentrations. Five groups i.e, B2-S22-AFA group (B2-S22-AFA final concentration: 1μg?mL–1),131I-B2-S22-AFA group (131I-B2-S22-AFA final concentration: 144 kBq/1 μg?mL–1),131I group (131I final concentration: 144 kBq?mL–1), negative control group and reagent blank group, were selected for contrast tests with the final concentration of EGF in each group at 5.0 pg?mL–1. The proliferation and activity of cells were measured by Methyl thiazolyl tetrazolium assay. The inhibitory rates were compared among131I-B2-S22-AFA group, B2-S22-AFA group and131I group in the growth of the two kinds of cells at different time.1) HER-2 receptors were strongly expressed in SKBR3 cells while weakly (low) or no expressed in MDA-MB-231 cells. The radiochemical purity, labeling rate and specific activity of131I-B2-S22-AFA were 95.0%?97.6%, 64.8%?79.6% and 151.7 MBq?mg–1, respectively. Radiochemical purity of131I-B2-S22-AFA was 95.4%, 93.5%, 91.4%, 88.2% and 77.4% when it was placed at 37 °C in serum for 4 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h, respectively. The maximum binding rates of SKBR3 and MDA-MB-231 cells were (66.47±3.24)% and (3.89±0.81)% (tested for 3 times) respectively. 2) The inhibitory effect of B2-S22-AFA on the growth of SKBR3 cells only in the presence of EGF. 3) The killing effect of131I-B2-S22-AFA on SKBR3 cells was significantly stronger than that of B2-S22-AFA and131I (<0.05), and the inhibitory effect of B2-S22-AFA on the growth of SKBR3 cells was significantly higher than that of131I (<0.05).131I-B2-S22-AFA and B2-S22-AFA had no obvious killing effect on MDA-MB-231 cells.131I-B2-S22-AFA can significantly enhance and accelerate the specific killing effect of B2-S22-AFA on breast cancer cells with high HER-2 expression.

Breast cancer, Isotope labeling,131I-B2-S22-AFA, Epidermal growth factor receptor 2

LI Yamei, female, born in1974, graduated from Nanchang University with a master’s degree in 2008,focusing on obstetrics and gynecology imaging

GUAN Yanxing, E-mail: yanxingguan2000@aliyun.com

2017-03-21,

2017-10-19

R817.8

10.11889/j.0253-3219.2017.hjs.40.120301

李亞梅，女，1974年出生，2008年于南昌大學(xué)獲碩士學(xué)位，研究領(lǐng)域?yàn)閶D產(chǎn)科影像學(xué)

關(guān)晏星，E-mail: yanxingguan2000@aliyun.com

2017-03-21，

2017-10-19

Supported by Ganpo Excellence 555 Project and Natural Science Fund Project of Jiangxi Province (No.2007GZY1419)

江西省贛鄱英才555工程項(xiàng)目及江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.2007GZY1419)資助