樊紅琨，羅天霞，楊 陽，王國慶，常 歡，馬小芳，喬 鵬，章 茜

（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南鄭州450001）

慢性心衰大鼠心肌2型小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道及Junctophilin 2表達(dá)的改變*

樊紅琨，羅天霞，楊 陽，王國慶，常 歡，馬小芳，喬 鵬，章 茜△

（鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，河南鄭州450001）

目的：檢測慢性心力衰竭模型大鼠心肌細(xì)胞膜2型小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+（SK2）通道和Junctophilin 2（JP2）蛋白表達(dá)的變化，為人類心力衰竭機(jī)制的研究和針對(duì)性的治療提供新思路。方法：10只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（5只）和手術(shù)組（5只），手術(shù)組采用腹主動(dòng)脈縮窄的方法制備慢性心衰模型，假手術(shù)組大鼠分離腹主動(dòng)脈后不進(jìn)行縮窄術(shù)。每周觀察各組大鼠心電圖的變化，稱量大鼠的體重，之后殺死大鼠取心臟和肺稱重，計(jì)算心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)；提取心臟組織蛋白，用Western blot的方法檢測心肌SK2通道和JP2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：術(shù)后第8周，手術(shù)組大鼠心電圖ST段抬高或T波高聳；并且與假手術(shù)組相比，手術(shù)組大鼠心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)均顯著增加；心肌組織SK2通道的表達(dá)顯著增加，JP2表達(dá)下降（P均＜0.05）。結(jié)論：慢性心衰模型大鼠心肌JP2蛋白表達(dá)減小，SK2通道表達(dá)增加。

慢性心衰；SK2通道；JP2；大鼠

chronic heart failure； SK2 channels； JP2； rat

心力衰竭（heart failure，HF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，可分為慢性和急性兩大類。其中，肌漿網(wǎng)的鈣循環(huán)異常是HF發(fā)病的主要原因之一［1］。Ryanodine受體 2（RyR2）是位于心肌肌漿網(wǎng)上的一種鈣釋放通道，通過調(diào)節(jié)心肌的興奮收縮耦聯(lián)在HF中發(fā)揮重要的作用，目前RyR2已成為HF治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。心肌內(nèi)小電導(dǎo)-Ca2+-激活K+通道（small-conductance calcium-activated potassium channel SK，KCa2）是幾乎存在于所有可興奮細(xì)胞的非電壓依賴性、唯一通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+激活的K+通道，是參與動(dòng)作電位復(fù)極化末期過程的重要離子通道［2］。我們之前的研究表明心肌SK2通道功能與RyR2活性有關(guān)，RyRs敏感的Ca2+釋放通道與SK2通道之間具有功能耦聯(lián)［3］，并且這種耦聯(lián)可能是通過 Junctophilin 2（JP2）發(fā)揮作用的［4，5］，JP2主要存在于骨骼肌和心肌，具有膜耦聯(lián)復(fù)合物（junctional membrane complexes，JMCs）的特性，在耦聯(lián)細(xì)胞膜與肌質(zhì)網(wǎng)離子通道交通中起作用。有研究報(bào)道慢性HF大鼠心肌內(nèi)JP2的表達(dá)水平下降［6］。由此可知，調(diào)節(jié)心肌鈣穩(wěn)態(tài)的 RyR2和構(gòu)成 JMCs的 JP2均可能與慢性HF相關(guān)，而與二者有相互作用的SK2在慢性HF中的作用未見報(bào)道。

本研究用腹主動(dòng)脈狹窄的方法制作SD大鼠慢性HF模型，首先驗(yàn)證心肌組織 JP2的表達(dá)變化，進(jìn)一步檢測心肌組織SK2通道的表達(dá)。為SK2和JP2在慢性HF中的作用提供直接的證據(jù)，為HF藥物靶向治療提供新的視點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔多克隆SK2抗體購自以色列 Alamone labs試劑公司；兔多克隆抗JP2抗體購自美國Sigma公司；辣根過氧化酶山羊抗兔lgG、蛋白預(yù)染Marker和ECL化學(xué)發(fā)光試劑購自中國北京康為公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

健康成年SD大鼠10只，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（生產(chǎn)許可證 SCXK（豫）2011-0012，使用許可證 SYXK（豫）2011-0012）雌雄不拘，體重200～220 g。動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)于通風(fēng)暗室房間，以日光燈控制光照周期（12 h：12 h），室溫保持在22～24℃，飼以普通飼料（購自河南實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）和飲用水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后將動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組（n＝5）和手術(shù)組（n＝5）。手術(shù)組大鼠行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)，假手術(shù)組大鼠分離腹主動(dòng)脈后不進(jìn)行縮窄術(shù)。

1.3 大鼠心衰模型的制備

用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.04 ml／kg體重），將大鼠仰臥位固定。在劍突下做腹部正中切口，打開腹腔，將內(nèi)臟器官移至右側(cè)，找到左腎及腎動(dòng)脈，在腎動(dòng)脈分支以上用玻璃分針鈍性分離腹主動(dòng)脈，在其下方穿線，將針頭平行置于腹主動(dòng)脈上，在上方0.5～1 cm處進(jìn)行結(jié)扎，緩慢抽出針頭。將內(nèi)臟器官歸位關(guān)腹。術(shù)后腹腔注射慶大霉素2.4×104U／（kg·d），共 3 d。

1.4 大鼠心電圖監(jiān)測

每只大鼠術(shù)前稱重并測量四肢導(dǎo)聯(lián)心電圖，1～7周每周記錄一次心電圖；第8周，每3 d測量一次心電圖；8周末給大鼠稱重并測量心電圖后處死。

1.5 大鼠心臟取材

8周末大鼠測量心電圖后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0.04 ml／kg體重），暴露心臟，快速取出心臟和肺稱重，計(jì)算心臟重量指數(shù)（心臟重量／體重）和肺系數(shù)（肺重量／體重）。通過大鼠癥狀表現(xiàn)、心電圖、心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)判斷模型制備是否成功，制備成功的大鼠取出心臟后放入液氮中，提取心臟組織蛋白做Western blot。

1.6 Western blot的檢測

以1∶9的比例在心臟中加入組織勻漿液制備蛋白樣品，用BCA法測定心肌組織蛋白的含量。各組吸取40μg樣品注入上層濃縮凝膠的梳孔中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g／L脫脂牛奶-TBST室溫封閉，加入兔多克隆抗SK2抗體（1∶300稀釋）或鼠單克隆抗JP2抗體（1∶300稀釋），4℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔 IgG（1∶8 000）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光曝光顯影。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，應(yīng)用 SPSS 10.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩樣本均數(shù)的比較采用 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 心衰模型大鼠癥狀表現(xiàn)

術(shù)后第5周，與假手術(shù)組相比，有2個(gè)手術(shù)組大鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快，日?；顒?dòng)遲緩，口唇發(fā)紺，瞳孔增大，眼球突出。第8周剩余3個(gè)手術(shù)組大鼠與假手術(shù)組大鼠相比，均出現(xiàn)上述癥狀。

2.2 大鼠心電圖變化

術(shù)前分別給10只大鼠測心電圖，結(jié)果正常（圖1A）。術(shù)后觀察各組大鼠心電圖，結(jié)果顯示與術(shù)前比較，從第2周到第8周假手術(shù)組大鼠心電圖均無明顯變化（圖1B），而手術(shù)組大鼠在第4周有1只大鼠心電圖出現(xiàn)變化，有2只在第6周出現(xiàn)變化，到第8周心電圖均出現(xiàn)不同程度的變化，有4只表現(xiàn)為ST段凸面向上抬高（圖1C），有1只表現(xiàn)為T波高聳，提示手術(shù)組大鼠在心電圖上均出現(xiàn)心衰的表現(xiàn)。

Fig.1 Electrocardiogram（EEG）in sham operated and operated ratsA：Before the operation；B：Sham operated groups before execution at 8 weeks；C：Operated groups before execution 8 weeks

2.3 大鼠心肺重量變化

術(shù)前手術(shù)組大鼠體重為（210±10）g，假手術(shù)組為（202±13）g，兩組體重幾乎相同。術(shù)后8周處死前稱重，手術(shù)組大鼠體重增加較少，均值為（260±21）g；假手術(shù)組大鼠體重（292±19）g增加較多，兩組無顯著性差異。取心臟和肺稱重，計(jì)算的心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)如表1所示。與假手術(shù)組相比，手術(shù)組大鼠的心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)均顯著增高（p＜0.01）。

Tab.1 The cardiac mass index and lung index in rats（ˉx±s，n＝5）

2.4 大鼠心肌SK2通道和JP2蛋白的表達(dá)

提取心肌組織蛋白，用Western blot的方法檢測SK2和JP2蛋白表達(dá)水平。如圖2顯示，手術(shù)組和假手術(shù)組的大鼠心肌組織均在約60 KD和74 KD處有印跡條帶。與假手術(shù)組（0.33±0.06）相比，手術(shù)組大鼠心肌組織 SK2通道的表達(dá)（1.26±0.23，p＜0.05）；JP2蛋白表達(dá)（0.26±0.02）顯著低于假手術(shù)組（0.86±0.06，p＜0.05）。

3 討論

Fig.2 The expression of the Junctophilin 2（JP2）and small conductance Ca2+-activated K+channel subtype 2 proteins（SK2）in the myocardium of rats

實(shí)驗(yàn)采用腹主動(dòng)脈縮窄的方法制備模型，這種方法屬于壓力超負(fù)荷型心肌重構(gòu)模型的一種。縮窄腹主動(dòng)脈后，導(dǎo)致左心室長期處于慢性壓力超負(fù)荷狀態(tài)，出現(xiàn)心肌重構(gòu)，即左室壁厚度增加來維持心功能，但隨著時(shí)間的推移，當(dāng)心臟失代償時(shí)，心肌肥厚不足以抵消后負(fù)荷增加所帶來的影響會(huì)導(dǎo)致HF。本實(shí)驗(yàn)利用此方法制備的HF大鼠模型，與假手術(shù)組相比，大鼠出現(xiàn)呼吸頻率加快，日?；顒?dòng)遲緩，口唇發(fā)紺，并且在8周時(shí)心電圖均出現(xiàn)不同程度的變化，這些結(jié)果均提示大鼠心臟功能出現(xiàn)異常。處死后手術(shù)組大鼠心臟重量指數(shù)和肺系數(shù)均顯著高于假手術(shù)組，建議模型大鼠出現(xiàn)心肌肥厚導(dǎo)致心臟重量增加，可能是左心室肥厚引起，進(jìn)一步引起肺靜脈流出不暢而導(dǎo)致肺淤血出現(xiàn)肺系數(shù)增加。因此，以上結(jié)果均建議已成功建立HF大鼠模型。

本實(shí)驗(yàn)提取HF模型大鼠心肌組織，通過Western方法測定顯示JP2表達(dá)降低。本結(jié)果與他人的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致［7-9］。心肌細(xì)胞的JP2，是耦聯(lián)管膜離子通道與肌質(zhì)網(wǎng)交通的蛋白分子，功能異常影響細(xì)胞膜表面離子通道與細(xì)胞內(nèi)Ca2+的耦聯(lián)，直接影響心肌或骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián)過程，導(dǎo)致收縮不能、心律失常等［7，8］。近年的研究表明 JP2敲減伴隨急性HF發(fā)生，心肌細(xì)胞JMC嚴(yán)重缺失，Ca2+瞬變與肌收縮失同步化。也有研究表明心肌肥厚和心衰的大鼠模型L-型Ca2+通道與RyR2之間的耦聯(lián)效率降低，RyR2 Ca2+釋放與收縮失同步化，而這些異?？赡芘cJP2 mRNA和蛋白的表達(dá)下降有關(guān)［7，9］。由此可見，模型組大鼠心肌 JP2表達(dá)降低進(jìn)一步表明模型制備成功。

SK2是主要存在于心肌細(xì)胞的Ca2+激活的K+通道，參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位的復(fù)極化的構(gòu)成。本實(shí)驗(yàn)和他人實(shí)驗(yàn)結(jié)果已表明心衰大鼠模型心肌組織JP2表達(dá)降低，而實(shí)驗(yàn)室以前的結(jié)果［4，5］提示心肌 JP2和 SK2之間有相互作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討心衰模型大鼠心肌組織SK2通道蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示SK2表達(dá)顯著高于假手術(shù)組。這可能是因?yàn)镠F時(shí)JP2表達(dá)的減少，L-型Ca2+通道與RyR2之間的耦聯(lián)效率降低［7，9］，細(xì)胞內(nèi) Ca2+濃度的改變引起鈣調(diào)蛋白、蛋白激酶或蛋白磷酸化酶的改變，而這些物質(zhì)均可以調(diào)節(jié)SK2通道的功能和表達(dá)［10］，從而引起心肌內(nèi)SK2通道表達(dá)量的變化。因此，本實(shí)驗(yàn)中HF大鼠模型心肌JP2和SK2表達(dá)的改變提示二者可能與HF產(chǎn)生有關(guān)，可作為HF藥物靶向治療的新策略。但在慢性HF產(chǎn)生過程中心肌組織JP2和SK2表達(dá)的變化，還需要進(jìn)一步研究。

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1000-6834（2017）06-523-03

10.12047／j.cjap.5564.2017.124

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81270248）

2017-02-06

2017-10-19

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