蔣昌科，龔 放

miR-148a在5-aza誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞心肌樣分化中的調(diào)控作用及機(jī)制*

蔣昌科，龔 放

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院兒科，重慶402160）

目的：探討miR-148a在5-aza誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)（hMSCs）成心肌樣分化中的表達(dá)及miR-148a對(duì)hMSCs體外成心肌樣分化的生物學(xué)作用。方法：免疫熒光檢測5-aza誘導(dǎo)hMSCs分化后心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC表達(dá)水平；qRT-PCR和Western blot分別檢測miR-148a和DNMT1在hMSCs成肌樣分化中的表達(dá)水平。利用Lipofectamine TM 2000將miR-148a mimics和miR-148a inhibitor分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hMSCs，Western blot檢測心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC的蛋白表達(dá)水平。利用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miR-148a的靶基因結(jié)合位點(diǎn)利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)鑒定其對(duì)靶基因3’UTR的結(jié)合序列。通過DNMT1 shRNA和miR-148a inhibitors共轉(zhuǎn)到hMSCs中，研究miR-148a在hMSCs成心肌樣分化中的調(diào)控作用。結(jié)果：hMSCs經(jīng)5-aza誘導(dǎo)分化后，心肌細(xì)胞特性標(biāo)志物α-MHC蛋白水平明顯上調(diào)。miR-148a在hBMSCs成肌樣分化中顯著性增加（p＜0.01），DNMT1表達(dá)水平顯著降低。過表達(dá) miR-148a能提高h(yuǎn)BMSC中心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC表達(dá)水平，而抑制miR-148a則能降低其水平（p＜0.01）。DNMT1沉默可以阻斷miR-148a對(duì)hMSCs的誘導(dǎo)成肌樣分化作用。結(jié)論：miR-148a在hMCCs成肌樣分化中表達(dá)上調(diào)，通過靶定和調(diào)控DNMT1基因的表達(dá)，并對(duì)hMSCs心肌向分化具有正向調(diào)控作用。

miR-148a；骨髓間充質(zhì)；心肌樣分化；DNMT1

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是骨髓內(nèi)除造血干細(xì)胞之外的另一類干細(xì)胞，是骨髓造血微環(huán)境的重要組成部分，由于其比較原始，在一定條件下可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞，并且具有免疫耐受性且來源于自體骨髓，由其誘導(dǎo)而成的組織進(jìn)行移植不會(huì)出現(xiàn)免疫排斥和倫理道德問題，因此在組織工程細(xì)胞移植的研究中，MSCs是繼造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞后的又一研究熱點(diǎn)，體外培養(yǎng)擴(kuò)增后的MSCs是組織工程中理想的種子細(xì)胞［1］。目前，心腦血管疾病是威脅人類健康的主要疾病之一，而心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，缺乏分化和增殖的能力，一旦損傷便不能再生［2］，因此，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞，并利用體外組織工程技術(shù)構(gòu)建工程化心肌組織如心臟瓣膜，為臨床上心臟疾病的治療提供全新的治療思路和策略，控制和優(yōu)化MSCs心肌向分化具有深遠(yuǎn)意義。

MSCs分化是多基因參與和多階段累積的復(fù)雜過程，它涉及細(xì)胞發(fā)育過程中眾多基因在不同時(shí)間和空間上的時(shí)序精確表達(dá)，并受多種轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞內(nèi)分子的調(diào)控。作為廣泛存在的可對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的重要分子，微小RNA（microRNA，miRNA）參與到生物體的生長、發(fā)育、衰老和死亡等多種過程的調(diào)控［3］。近年來，其在干細(xì)胞的增殖分化中所起的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注。microRNA是一類內(nèi)源性的19～22個(gè)核苷酸的動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)自然產(chǎn)生的單鏈非編碼小RNA，是重要的細(xì)胞基因調(diào)控因子，它主要通過與靶基因信使RNA（message RNA，mRNA）的 3’端非編碼區(qū)域（untranslated region，UTR）上的位點(diǎn)互補(bǔ)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［4，5］。研究在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌向分化過程中異常表達(dá)的miRNA并明確其在MSCs心肌向分化過程中的作用，有助于MSCs的定向分化控制條件的研究，具有重要的臨床意義。

本研究基于前期通過miRNA芯片，篩選出5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）誘導(dǎo) MSCs分化后表達(dá)異常的微小 RNA-148a（microRNA-148a，miR-148a），通過生物信息學(xué)預(yù)測，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNA methyltransferase 1，DNMT1）是 miR-148a的潛在靶基因，揭示miR-148a通過靶向DNMT1在MSCs心肌向分化過程中的調(diào)控作用，提升其心肌向分化的效率和效能，為真正實(shí)現(xiàn)MSCs移植替代受損心肌組織，改善心功能促進(jìn)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株來源

骨髓源自重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院血液內(nèi)科行骨髓穿刺檢查的患者，已排除腫瘤、傳染病以及其他血液系統(tǒng)疾病。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，組織來源對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

L-DMEM（Invitrogen），TRIzol（Invitrogen），青霉素 ／鏈霉素（Invitrogen），5-aza（Sigma），胎牛血清（GBI-CO），miRNA分 離 試 劑 盒 （Applied Biosystems），NanoVue plus（GE Healthcore），miRNA mimics和引物（金唯智），Western blot抗體（Santa Cruz），cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa），熒光定量 PCR試劑盒（Applied Biosystems）。

Tab.1PCR primer sequence

1.3 細(xì)胞分離與培養(yǎng)

采用密度梯度離心法進(jìn)行分離。將胸骨穿刺抽取的3～5 ml骨髓移入分離管，與 percoll以1∶1混合，2 500 r／min離心30 min，吸取中間乳白色云霧狀細(xì)胞層，PBS洗細(xì)胞兩次，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)液重懸，以1 500 r／min離心10 min，棄上清，獲得人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）。利用含有10%胎牛血清、1%雙抗和1%L-谷氨酰胺的L-DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代培養(yǎng)，4 d后半量換液，原代培養(yǎng)約7 d后按1∶3傳代，第3代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.4 hMSCs的成肌樣分化誘導(dǎo)

將hMSCs接種于6孔板中，待細(xì)胞融合到80%～90%，用 3μmol／L 5-aza分別孵育 12 h、24 h、48 h后換完全細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，電鏡下細(xì)胞胞漿出現(xiàn)散在肌絲樣結(jié)構(gòu)。

1.5 hMSCs中miR-148a過表達(dá)和抑制

將生長良好、處于對(duì)數(shù)生長期的hMSCs接種至6孔板中，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分為3組，分別為對(duì)照組（control）、抑制組（miR-148a inhibitors）及過表達(dá)組（miR-148a mimics）。待到細(xì)胞生長至融合度達(dá)60%～70%時(shí)，棄上清，用含有Lipofectamine 2000的無血清Opti-MEM稀釋的 control mimics／miR-148a inhibitors／miR-148a mimics，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染6 h后換正常的完全細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 RNA的提取和qRT-PCR

取100 ml培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞常規(guī)方法進(jìn)行提取總RNA，用分光光度計(jì)測定RNA含量，-80℃保存。取總RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA，以實(shí)時(shí)定量miRNA特異引物和第一鏈cDNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)，U6和βactin為內(nèi)參照。參照GenBanK數(shù)據(jù)庫，采用Primer primer5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)引物（表1）。由金唯智公司合成，反應(yīng)條件參考產(chǎn)品說明書。

1.7 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

通過 targetscan，miRase等軟件預(yù)測DNMT1 mRNA的3’-UTR片段與 miR-148a有結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)DNMT1 3’-UTR序列設(shè)計(jì)特異性引物以及突變型引物，以人的DNMT1 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再將PCR產(chǎn)物與psiCHECK-2 vector經(jīng)酶切后純化、連接、轉(zhuǎn)化以酶切鑒定。構(gòu)建野生型和突變型DNMT1 3’-UTR-熒光素酶報(bào)告載體，然后與 miR-148a mimics、control mimics或者miR-148a inhibitors共轉(zhuǎn)到293細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染3 d后收獲細(xì)胞。按Promega公司雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書檢測細(xì)胞熒光素酶活性。計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性＝熒火蟲熒光素酶活性值／海腎熒光素酶活性值。

1.8 Western blot

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取15 μg蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入兔源一抗 DNMT1（1∶500）、α-MHC（1∶800）、CD90（1∶300）、CD29（1∶500）4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入二抗鼠抗兔 IgG（1∶2 000）室溫孵育 1.5 h，TBST洗膜后，加入ECL超敏發(fā)光劑，X線片曝光，顯影，定影。

1.9 細(xì)胞免疫熒光

取轉(zhuǎn)染后的hMSCs細(xì)胞接種于預(yù)先放置蓋玻片的12孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片待細(xì)胞貼壁48 h后用4%的多聚甲醛固定30 min，吸去固定液用PBS洗3遍，加 10%羊血清、0.3%TritonX-100、0.1%疊氮化鈉的封閉液，37℃封閉1 h。吸去封閉液，加入稀釋好（1∶100）的一抗：熒光標(biāo)記小鼠α-MHC（FITC標(biāo)記），4℃孵育過夜。吸去一抗PBS洗3次，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，DAPI染細(xì)胞核，熒光封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)均用均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用Graphpad統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ANOVA方差分析，比較組區(qū)間差異。

2 結(jié)果

2.1 5-aza誘導(dǎo) hMSCs成肌樣分化過程中 miR-148a和DNMT1的表達(dá)

hMSCs在5-aza誘導(dǎo)條件下，qRT-PCR檢測心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC的表達(dá)水平。結(jié)果表明，隨著5-aza誘導(dǎo)的時(shí)間增加，α-MHC表達(dá)水平明顯升高（p＜0.01，圖1A）。免疫熒光分析得到同樣的結(jié)果（圖1B）。同時(shí)，我們對(duì)miR-148a和 DNMT1的表達(dá)水平也進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，隨著5-aza誘導(dǎo)時(shí)間的延長，miR-148a的表達(dá)明顯提高（圖 1C），但是DNMT1的蛋白表達(dá)水平顯著性降低（p＜0.01，圖1D）。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們將以 5-aza（3μmol／L）誘導(dǎo)48 h為實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行分析。

Fig.1 Expression of miR-148a and DNMT1 in the process of myogenic differentiation induced by 5’-aza in hMSCs A：mRNA level ofα-MHC in differentiation groups；B：Cell immunofluorescence detection ofα-MHC in differentiation groups；C：Expression of miR-148a in differentiation groups；D：Expression of DNMT1 in differentiation groups；E：Expression of DNMT1 in different groups；w0：Control group；w3：5’-aza induced group**p＜0.01 vs control group

2.2 MiR-148a對(duì)hMSCs成肌樣分化的影響

為了進(jìn)一步研究miR-148a在hMSCs成肌樣分化中的生物學(xué)調(diào)控作用，將細(xì)胞分成3組：對(duì)照組（control）、抑制組（miR-148a inhibitors）和過表達(dá)組（miR-148a mimics），圖 2A顯示轉(zhuǎn)染 miR-148a inhibitors后，miR-148a的表達(dá)明顯降低，反之，轉(zhuǎn)染miR-148a mimics能顯著上調(diào) miR-148a水平（p＜0.01）。同時(shí)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物的表達(dá)。結(jié)果顯示，miR-148a的上調(diào)可以提高心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC的mRNA和蛋白表達(dá)水平，與之相反，miR-148a的水平降低能下調(diào)心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC的 mRNA和蛋白表達(dá)水平（p＜0.01，圖 2B，C），即miR-148a促進(jìn)hMSCs的成肌樣分化。

2.3 MiR-148a的靶基因檢測結(jié)果

利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫篩選潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)DNMT1的3’-UTR區(qū)是 miR-148a的潛在結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miR-148a可以直接靶定DNMT1。結(jié)果表明miR-148a可以抑制野生型DNMT1的表達(dá)，但是miR-148a不能抑制突變型DNMT1的表達(dá)（表2），說明 DNMT1是miR-148a的靶定基因。

Fig.2 miR-148a promotes hMSCs myogenic differentiation A：mRNA level of miR-148a in differentiation groups；B：mRNA level ofα-MHC in differentiation groups；C：Cell immunofluorescence detection ofα-MHC in differentiation groups（×40）；N：Control group；mimics：miR-148a mimics group；inhibitors：miR-148a inhibitors group**p＜0.01 vs control group

2.4 沉默DNMT1對(duì)miR-148a在hMSCs分化作用的影響

設(shè)計(jì)并合成DNMT1-shRNA研究敲除DNMT1后miR-148a在hMSCs成肌樣分化中的作用，分成3組：對(duì)照組（control），miR-148a抑制組（miR-148a inhibitors），DNMT1敲降組（miR-148a inhibitors+DNMT1-shRNA）進(jìn)行探究分析。我們首先利用 qRTPCR檢測miR-148a的表達(dá)水平，結(jié)果如表3所示，miR-148a在miR-148a抑制組和DNMT1敲降組是顯著性降低。利用qRT-PCR和Western blot分析三組細(xì)胞中DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，DNMT1在miR-148a抑制組中表達(dá)顯著增加，但是在DNMT1敲降組中表達(dá)明顯降低（表3，圖4A）。隨后我們利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物（α-MHC）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物（CD90，CD29）的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，miR-148a inhibitors能抑制心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-MHC的表達(dá)水平，但是能提高h(yuǎn)MSCs表面標(biāo)志物（CD90，CD29）的表達(dá)水平然而，在DNMT1敲降后出現(xiàn)與miR-148a inhibitors相反的作用（表3，圖4B）。綜上說明沉默DNMT1能夠阻止miR-148a的成肌樣作用。

Fig.4A Protein expression levels of DNMT1 by miR-148a inhibitors and miR-148a inhibitors+DNMT1-shRNA administration

Fig.4B Protein expression levels of intracellular related molecules by miR-148a inhibitors and miR-148a inhibitors+DNMT1-shRNA administration α-MHC：α-myosin heavy chain

3 討論

利用誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)能夠獲得患者需要或者疾病特異的多能干細(xì)胞，可以避免移植過程中的免疫排斥問題。但目前人骨髓干細(xì)胞在心肌定向分化以及心肌再生領(lǐng)域的研究目前尚處于探索階段，誘導(dǎo)分化效率較低，分化機(jī)制不明等問題一直困擾著臨床探究。本研究利用5-aza誘導(dǎo)骨髓干細(xì)胞成肌樣分化，探究miR-148a在這一過程中的作用。

我們的研究結(jié)果表明，在5-aza誘導(dǎo)hMSCs成肌樣分化過程中，miR-148a是顯著上調(diào)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-148a是通過靶定DNMT1促進(jìn)5-aza誘導(dǎo)的hMSCs成肌樣分化，沉默 DNMT1能阻止 miR-148a對(duì)hMSCs成肌樣分化的生物學(xué)調(diào)控作用。因此，本研究明確miR-148a在5-aza誘導(dǎo)hMSCs成肌樣分化的分子機(jī)制。

Tab.3 Expression levels of intracellular related molecules by miR-148a inhibitors and miR-148ainhibitors+DNMT1-shRNA administration

到目前為止，已有約1 000個(gè)動(dòng)物的miRNA被報(bào)道，其中約30%的基因被預(yù)測為miRNA的靶基因，能夠被miRNA所直接調(diào)控［6-8］。有研究表明，許多miRNA在心臟發(fā)育及心肌細(xì)胞分化過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用［9］。例如，miRNA-1能夠通過Notch信號(hào)通路的DLL-1配體調(diào)控胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化，并促進(jìn)心肌縫隙鏈接蛋白 connexin43的表達(dá)［10，11］，過表達(dá) miRNA-1后，骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)心肌重要轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKx2.5和MEF2C以及心肌特異蛋白cTnI表達(dá)均有明顯上調(diào)，心肌特異蛋白cTnI表明miRNA-1能夠促進(jìn)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化［12］。另有研究表明，miR-16能夠通過抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白CDK6的表達(dá)而使細(xì)胞周期阻滯于GI期，降低S期和G2／M期細(xì)胞的百分含量，從而促進(jìn)微環(huán)境中MSCs向心肌表型細(xì)胞分化［13］。此外，miR-148-3p能夠在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝病治療起關(guān)鍵性作用［14］。miR-148a對(duì)于干細(xì)胞的增殖和分化有著重要調(diào)節(jié)［15，16］。因此，miR-48a對(duì)細(xì)胞分化有重要調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-148a在hMSCs被5’-aza誘導(dǎo)后顯著性增加。然后，miR-148a mimics轉(zhuǎn)染hMSCs后，發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)hMSCs成肌樣分化。我們還發(fā)現(xiàn)hMSCs成肌樣分化后，DNMT1的水平顯著性降低。進(jìn)而利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證DNMT1是miR-148a的靶基因。最后發(fā)現(xiàn)，通過沉默DNMT1可以阻止miR-148a促進(jìn)hMSCs成肌樣分化。以上結(jié)果表明，miR-148a是通過靶定DNMT1促進(jìn)hMSCs成肌樣分化。

綜上，我們的研究表明在hMSCs心肌向分化的過程中，miR-148a能促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌向分化，miR-148a的正調(diào)節(jié)作用是通過抑制DNMT1的轉(zhuǎn)錄后翻譯起作用的。本研究為基因修飾增強(qiáng)hMSCs的成肌樣分化能力提供新的靶點(diǎn)，也加深我們對(duì)5-aza誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成肌樣分化的分子機(jī)制的理解，為真正實(shí)現(xiàn)MSCs移植替代受損心肌組織，改善心功能促進(jìn)臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Regulation and mechanism of miR-148a on cardiomyocyte differentiation induced by 5-aza in mesenchymal stem cells

JIANG Chang-ke，GONG Fang
（Department of Pediatrics，Yongchuan Hospital Affiliated to Chongqing Medical University，Chongqing402160，China）

Objective：To investigate the expression of miR-148a in the process of myocardial differentiation of human mesenchymal stem cells（hMSCs）induced by 5-azacytidine（5-aza）and study the effects of miR-148a on myocardial differentiation of hMSCs.Methods：The immunofluorescence analysis was used to detect the expressionsof the associated mark genes of cardiac specific protein（α-MHC）in the processof myocardial differentiation of hMSCs induced by 5-aza.qRT-PCR and Western blot were used to analysis the expressions of miR-148a and DNA methyltransferase1（DNMT1）after myocardial differentiation of hMSCs，respectively.The expression ofα-MHCafter transfection with synthetic miR-148 mimics and miR-148ainhibitor wasexamined by Western blot.Weused bioinformatics analysis to predict the potential target of miR-148a，and thedual luciferase report gene system wasused to verify the predication.After co-transfected with DNMT1 shRNA and miR-148a inhibitors，hMSCs were used to explore the regulatory role and mechnism of miR-148a in the process of myocardial differentiation of hMSCs.Results：α-MHCwas increased significantly after induced by 5-azacytidine.miR-148a was increased significantly in cardiomyocyte differentiation of hMSCs，while the gene and protein expression levels of DNMT1 weredecreased significantly in this progress（p＜0.01）.The expression ofα-MHCwasup-regulated significantly in hMSCs when miR-148a wasinduced into cardiomyocytedifferentiation and overexpressed.Instead，downregulation of miR-148asuppressedα-MHCexpression（p＜0.01）.Knockdown of DNMT1 blocked the role of miR-148a in differentiation of hMSCs.Conclusion：miR-148a was upregulated in cardiomyocyte differentiation of hMSCs，and miR-148a promoted myocardial differentiation of hMSCs via targeting DNMT1.

miR-148a； mesenchymal stem cells； cardiac differentiation； DMNT1

R329.2

A

1000-6834（2017）06-514-06

10.12047／j.cjap.5570.2017.122

2015年重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2015jcyjA10042）；2015年重慶市永川區(qū)自然科學(xué)基金計(jì)劃項(xiàng)目（Ycstc，2015nc5003）

2017-02-24

2017-10-17

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