高蔚娜，蒲玲玲，韋京豫，辛中豪，王亞雯，石塔拉，李 天，郭長江

MAPKs抑制劑對大鼠肝細胞GSH代謝相關(guān)酶的影響*

高蔚娜，蒲玲玲△，韋京豫，辛中豪，王亞雯，石塔拉，李 天，郭長江△

（軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津300050）

目的：觀察絲裂原活化的蛋白激酶（MAPKs）抑制劑對大鼠肝細胞谷胱甘肽（GSH）代謝的影響，確定哪條途徑與GSH代謝相關(guān)。方法：體外培養(yǎng)BRL大鼠肝細胞，以c-Jun NH2-末端激酶（JNK）途徑抑制劑SP600125、p38途徑抑制劑SB203580、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1／2（ERK1／2）途徑抑制劑PD98659處理24 h，采用MTT法測定細胞活力，高效液相色譜法測定細胞內(nèi)GSH含量，Luminex法測定JNK和磷酸化JNK（p-JNK）的蛋白表達，采用試劑盒測定GSH代謝酶活性。結(jié)果：SP600125濃度 ＞5μmol／L，SB203580濃度 ＞20μmol／L，PD98659濃度 ＞40μmol／L時，細胞活力受抑制；SP600125能顯著減少大鼠肝細胞內(nèi)還原型GSH的含量，SB203580和PD98659作用不明顯；SP600125顯著減少磷酸化JNK（p-JNK）蛋白表達，顯著增強谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活力。結(jié)論：JNK MAPK途徑參與了大鼠肝細胞GSH的代謝。

MAPKs抑制劑；谷胱甘肽；代謝；BRL細胞株

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是細胞內(nèi)最重要的低分子抗氧化劑之一，能清除活性氧及其他非氧自由基，避免蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA等大分子發(fā)生過氧化損傷；能與多種致癌物、毒素和藥物及內(nèi)源性親電子體及其代謝物結(jié)合，在異生化物的脫毒過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。一旦GSH的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，各類GSH依賴酶系失活、對氧化自由基的清除作用減弱，就會引起大分子和臟器損傷。研究顯示，肝臟損傷與GSH水平降低密切相關(guān)［1-2］，如果在損傷時采用一些物質(zhì)延緩GSH水平降低，將會是很有效的防治策略。

絲裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）屬于絲氨酸和蘇氨酸蛋白激酶家族，在真核生物中高度保守，與細胞的生存、死亡、增殖、分化等重要生命過程密切相關(guān)。MAPKs家族包括 c-Jun NH2-末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK），細胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1／2（extracellular signalregulated kinase 1／2，ERK1／2），以及 p38［3］。MAPKs將細胞外刺激轉(zhuǎn)化后，通過磷酸化底物級聯(lián)反應，活化細胞內(nèi)轉(zhuǎn)導途徑。已有研究顯示，內(nèi)源性GSH代謝與MAPKs途徑有關(guān)［4］，但在大鼠肝細胞上是否也有類似作用的報道很少。

本研究體外培養(yǎng)大鼠肝細胞，選擇3種MAPKs抑制劑，分別為JNK途徑抑制劑SP600125、p38途徑抑制劑SB203580、ERK途徑抑制劑PD98659，觀察究竟是哪一條或那幾條途徑與GSH代謝有關(guān)，并研究這條途徑對GSH代謝相關(guān)酶，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）和γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶（γ-glutamate cysteineligase，γ-GCL）活性的影響，為下一步尋找該途徑的激活劑以減輕肝臟損傷打下實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

BRL細胞株（Baffalo rat liver）為正常大鼠肝細胞（中國科學院上海生命科學院）。將BRL細胞以4×105cells／ml的密度接種到含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，用 MAPKs抑制劑：SP600125（Sigma-Aldrich，美 國）、SB203580（Sigma-Aldrich，美 國）、PD98659（Sigma-Aldrich，美國）分別干預。干預完成后，棄培養(yǎng)液后加0.125%胰酶消化細胞，1 000 r／min、5 min離心收集細胞沉淀進行下一步實驗。

1.2 實驗設(shè)計

用胰酶消化BRL細胞株，離心洗滌2次，加入完全培養(yǎng)基配制成細胞懸液，密度（5～10）×104cells／ml，將細胞懸液接種于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板。待細胞貼壁后用不同濃度的 MAPKs抑制劑：SP600125、SB203580、PD98659進行干預，每組設(shè) 4～8個復孔，以 0μmol／L濃度孔為對照組。干預 24 h后，檢測指標。

1.3 細胞活力測定

MTT法。按照馮建［5］等人的方法進行。以96孔板培養(yǎng)細胞，處理24 h后，小心吸掉96孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗2遍后加入含20μl MTT溶液（5 mg／ml）的完全培養(yǎng)液 200μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h后，棄培養(yǎng)液，用DMSO溶解細胞內(nèi)的紫藍色結(jié)晶，再用酶標儀檢測各孔490 nm的吸光度值。

1.4 GSH含量測定

以75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)細胞24 h后，用胰酶消化，離心收集 BRL細胞后，采用王曉娜等人的方法［6］裂解細胞，沉淀蛋白，離心取上清。取130μl上清用于測定還原型GSH，再取130μl上清用于測定總GSH。進一步處理后，采用高效液相色譜法測定反應液中GSH的含量。

1.5 JNK和磷酸化JNK（p-JNK）的表達

采用Luminex法測定BRL細胞中JNK和p-JNK的蛋白表達情況。以6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細胞24 h后，用預冷的PBS洗滌細胞兩次，每孔加入預冷的0.3 ml 1×MILLIPLEX?MAP Lysis Buffer裂解細胞。按照 Merck公司的 2-Plex Phospho／Total JNK Magnetic Bead Kit操作說明書測定裂解液中JNK和p-JNK的蛋白表達情況。分別以處理組JNK、p-JNK和對照組JNK、p-JNK熒光比值確定蛋白的表達水平。

1.6 GSH代謝酶 GSH-Px、GR、GST和γ-GCL的活力

按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學處理

結(jié)果均以均值±標準差（ˉx±s）表示，使用SPSS 18.0軟件進行方差分析（ANOVA），GR活性系數(shù)、GSH-Px、GST原始數(shù)據(jù)開平方，GCL取對數(shù)后進行 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MAPKs抑制劑對BRL細胞活力的影響

MTT結(jié)果顯示，JNK途徑抑制劑SP600125濃度＞5μmol／L，p38途徑抑制劑 SB203580濃度 ＞20 μmol／L，ERK途徑抑制劑 PD98659濃度 ＞40μmol／L時，細胞活力受抑制（表1）。

Tab.1 Cell viability after MAPKs inhibitors treatment in rat hepatocytes（OD value，ˉx±s，n＝4）

2.2 MAPKs抑制劑對GSH水平的影響

為了確定作用劑量，選擇適當濃度進一步研究MAPKs抑制劑對BRL細胞中GSH含量的影響。結(jié)果表明，只有JNK途徑抑制劑SP600125能顯著減少大鼠肝細胞內(nèi)還原型 GSH的含量（p＜0.05），SB203580和 PD98659作用不明顯。因此確定SP600125的劑量為 5μmol／L（表 2，表 3），進行后續(xù)實驗。

Tab.3 The effects of SB203580 and PD98659 on GSH content in rat hepatocytes（μmol／g，ˉx±s，n＝4）

2.3 SP600125對JNK和p-JNK蛋白表達情況的影響

SP600125有效抑制 p-JNK的表達（p＜0.05），而對JNK蛋白的表達有促進作用（p＜0.05，表4）。

Tab.4 The effects of SP600125 on JNK and p-JNK protein expressions in rat hepatocytes（ˉx±s，n＝4）

2.4 SP600125對GSH代謝酶活性的影響

5μmol／L SP600125顯著增強大鼠肝細胞GSHPx活性（p＜0.05，表 5），對 GR、GCL、GST活性影響不明顯。

Tab.5 The effects of SP600125 on GSH metabolic enzymes in rat hepatocytes（ˉx±s，n＝4）

3 討論

從目前的結(jié)果來看，MAPKs途徑抑制劑的濃度不宜過高，否則會抑制大鼠肝細胞的活力。5μmol／L和10μmol／L的JNK途徑抑制劑SP600125顯著減少細胞內(nèi)還原型GSH含量，另外兩種抑制劑對GSH含量影響不明顯；結(jié)合MTT結(jié)果和GSH含量數(shù)據(jù)，確定 SP600125的劑量為 5μmol／L。

GSH是細胞內(nèi)外關(guān)鍵性的保護性抗氧化劑。參與GSH代謝的4種酶中，GSH-Px以GSH為底物，清除自由基和脂質(zhì)過氧化物，GSH本身被氧化成GSSG；GST催化GSH與內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)源性親電子體以及各種異生化合物的結(jié)合。GR將GSSG再生成GSH。GCL是GSH從頭合成的限速酶［7］。因此GSH-Px和 GST消耗GSH，而 GR和 GCL生成 GSH，這四種酶發(fā)揮著維持GSH穩(wěn)態(tài)的作用。研究表明，JNK信號轉(zhuǎn)導途徑對于氧化還原穩(wěn)態(tài)發(fā)揮特別重要的作用［8-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，JNK途徑抑制劑SP600125能夠顯著抑制大鼠肝細胞中p-JNK蛋白表達，說明JNK途徑受抑制；與此同時，GSH含量顯著降低，GSH-Px活性顯著增強，說明JNK途徑參與了GSH的代謝，GSH含量降低的直接原因是由于GSH-Px酶活性的增加。Utsugi等人的研究表明，JNK途徑通過影響GSH穩(wěn)態(tài)來調(diào)節(jié)一些物質(zhì)的生成［10］，還可能參與GSH的氧化修飾［11］。在體外實驗，JNK抑制劑增強沒食子酸減少GSH的作用，促進GSH的耗竭［12］，說明JNK抑制劑具有減少細胞GSH的作用。這與我們的結(jié)果非常類似。研究顯示，SP600125還具有減少大鼠肺細胞凋亡、抑制人冠狀動脈平滑肌細胞遷移的作用［13，14］，這在一定程度上可能會抵消細胞內(nèi)由于GSH減少造成的不良反應。綜上所述，JNK途徑參與了GSH的代謝。根據(jù)我們的實驗結(jié)果，預防性使用JNK途徑激活劑有可能增加肝臟內(nèi)GSH的水平，從而減輕肝臟損傷，因此選用JNK途徑激活劑進行下一步的驗證更具實際意義。這一結(jié)果也為我們深入研究保肝護肝的化合物，如類黃酮等物質(zhì)的保護機制打下了堅實的實驗基礎(chǔ)。

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Effects of MAPKs inhibitors on GSH metabolic enzymes in rat hepatocytes

GAO Wei-na，PU Ling-ling△，WEI Jing-yu，XIN Zhong-hao，WANG Ya-wen，SHI Ta-la，LI Tian，GUO Chang-jiang△
（Department of Nutrition，Institute of Health and Environmental Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Tianjin 300050，China）

Objective：To investigate the effects of mitogen-activated protein kinases（MAPKs）inhibitors on glutathione（GSH）metabolism，and to explore the pathway related to GSH metabolism.Methods：BRL rat hepatocytes were treated by c-Jun NH2-terminal kinase（JNK），p38，and extracellular signal-regulated kinase1／2（ERK1／2）inhibitors：SP600125，SB203580 and PD98659，respectively，for 24 h.MTT method was used to measure hepatocytes viability.The content of GSH was determined by high performance liquid chromatography.The protein expressions of JNK and phosphorylated JNK（p-JNK）was tested by Luminex method.Activities of GSH metabolic enzymes were detected by commercial kits.Results：Hepatocytes vitality was inhibited when the concentrations of SP600125，SB203580 and PD98659 were higher than 10μmol／L，20μmol／L，and 40μmol／L，respectively；SP600125 decreased the content of GSH in hepatocytes，while SB203580 and PD98659 had no effect.SP600125 reduced p-JNK protein expression，and enhanced GSH-Px activity significantly.Conclusion：JNK MAPK pathway takes part in the GSH metabolism in hepatocytes.

MAPKs inhibitor； glutathione； metabolism； BRL cell line

R151.2

A

1000-6834（2017）06-497-04

10.12047／j.cjap.5488.2017.118

國家自然科學基金面上項目（81372988）；天津市應用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃（青年基金項目，13JCQNJC11800）

2016-08-19

2017-05-21

△【通訊作者】Tel：022-84655429；E-mail：pulingling＠163.com；guocjtj＠126.com