陳 然，江 璞，劉玲燕，高 媛，楊欣欣，蔡卓長，范小芳，龔永生，毛孫忠

Apelin對改善小鼠低氧性肺動脈高壓的作用及與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關系*

陳 然，江 璞，劉玲燕，高 媛，楊欣欣，蔡卓長，范小芳，龔永生，毛孫忠Δ

（溫州醫(yī)科大學低氧醫(yī)學研究所，浙江溫州325035）

目的：探討外源性apelin對小鼠慢性低氧性肺動脈高壓的作用及其機制。方法：SPF級雄性apoE基因敲除（apoE-KO）小鼠30只，隨機均分為3組（n＝10），即常氧組、低氧組和低氧+apelin組，apelin組小鼠每天于低氧前經(jīng)腹腔注射apelin-13（10 nmol／（kg·d）），其他組腹腔注射相同體積的生理鹽水。采用常壓連續(xù)低氧方法（9%～11%O2，23 h／d）復制慢性低氧性肺動脈高壓模型。低氧3周后，采用右心導管法測定小鼠右心室壓（RVSP）和右心室與左心室加室間隔重量比［RV／（LV+S）］，Elisa法檢測血漿中高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和總膽固醇（TC）的含量；real-time PCR法檢測肝組織中三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）、清道夫受體B1（SR-B1）、低密度脂蛋白受體（LDLR）和3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGCR）等基因的表達。Western blot法檢測小鼠肺組織中過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）蛋白的表達。結果：①低氧組小鼠RVSP、RV／（LV+S）較常氧組分別高87%、85%（P均＜0.05），apelin組小鼠 RVSP、RV／（LV+S）較低氧組分別低 39%、33%（P均＜0.05）。②apelin組小鼠血漿中HDL-C含量、HDL／LDL比值分別較hypoxia組高21%、20%（P均＜0.05），而血漿中TC、LDL-C含量兩組間無顯著差異（P均＞0.05）。③apelin組小鼠肝組織中LDLR、SR-B1、ABCA1基因表達分別較低氧組上調(diào)241%、112%、69%（P均＜0.05），而HMGCR基因表達下調(diào)45%（p＜0.05）。④apelin組小鼠肺組織中 PPARγ蛋白表達較低氧組上調(diào)47%。結論：Apelin可降低小鼠低氧性肺動脈高壓，其機制與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關。

apelin；脂質(zhì)代謝；肺動脈高壓；低氧；小鼠

Apelin是血管緊張素II 1型受體相關蛋白的配體。研究發(fā)現(xiàn)，apelin防治低氧性肺動脈高壓的作用可能與抗氧化應激、NO途徑、抑制自噬等有關［1，2］，但具體機制仍未完全明了。新近研究表明，脂質(zhì)代謝異常參與小鼠低氧性肺動脈高壓的形成［3］。有研究報道，作為一類脂肪因子，apelin通過抑制脂肪形成、促進脂肪分解等機制，在減肥、抗糖尿?。?］中發(fā)揮作用，尚不清楚apelin防治低氧性肺動脈高壓的作用是否與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關。

本實驗用載脂蛋白 E基因敲除（apoE gene knockout，apoE-KO）小鼠復制低氧性肺動脈高壓模型，觀察外源性apelin對小鼠慢性低氧性肺動脈高壓的作用，以及對肺組織過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ）蛋白表達和肝組織脂質(zhì)代謝相關基因表達的影響，旨在探討apelin改善低氧性肺動脈高壓的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

SPF級雄性apoE-KO小鼠（以C57BL／6為背景）由美國Feinstein研究所shu fang liu實驗室惠贈，體重20～25 g。小鼠血漿高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、總膽固醇（total cholesterol，TC）等 Elisa試劑盒、apelin-13均購自美國 Phoenix Pharm Inc.；PPARγ抗體購自 Abcam公司；Quantscript RT Kit和Real Master Mix（Probe）購自天根生化科技有限公司。

1.2 動物分組及模型的制備

SPF級雄性apoE-KO小鼠30只，隨機均分為3組（n＝10），即常氧組、低氧組和低氧+apelin組，apelin組小鼠每天于低氧前經(jīng)腹腔注射apelin-13（10 nmol／（kg·d）），其他組腹腔注射相同體積的生理鹽水。采用常壓連續(xù)低氧方法（9%～11%O2，CO2＜3%，23 h／d）連續(xù)3周，復制慢性低氧性肺動脈高壓小鼠模型，常規(guī)飼料喂養(yǎng)；常氧組自由呼吸空氣，其它條件相同。

1.3 動物處理與取材

動物飼養(yǎng)3周后，采用異氟烷吸入法麻醉動物，右心導管法檢測右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP），RVSP可間接反映小鼠肺動脈壓。經(jīng)腹動脈取血，收集到含肝素的EP管中，離心取上清，置于-70℃保存。

放血處死動物，取出心臟，分別稱取右心室（right ventricle，RV）和左心室加室間隔（left ventricle plus septum，LV+S）的重量，并計算 RV／（LV+S）的重量比以反映右心室肥大情況。每組隨機取4只小鼠右肺組織各約100 mg用于提取總蛋白，待測PPARγ蛋白的表達。每組隨機取6只小鼠的右肝組織各約100 mg用于提取總RNA，待測脂質(zhì)代謝相關基因的表達。

1.4 血漿HDL、LDL、TC含量檢測（Elisa法）

Elisa試劑盒檢測血漿HDL、LDL、TC含量，按照試劑盒說明書操作。

1.5 肝組織脂質(zhì)代謝相關基因表達水平檢測（realtime PCR法）

經(jīng)Trizol一步法提取肝組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用 TaqMan探針法（TaqMan探針由 ABI公司提供）進行real-time PCR擴增，每個樣本做3個復孔。以10倍稀釋模板梯度樣本進行PCR反應，在目標基因與內(nèi)參照基因（β-actin基因）擴增效率接近100%時，以內(nèi)參照基因標準計算相對定量，采用ΔΔCT法對結果進行分析，計算低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）、三磷酸腺苷結合盒轉(zhuǎn)運體 A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）、清道夫受體 B1（scavenger receptor class B1，SR-B1）、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶 A還原酶（HMG-CoA reductase，HMGCR）等基因的相對表達水平。

1.6 肺組織 PPARγ蛋白表達檢測（Western blot法）

取約100 mg的右肺組織，加入RIPA裂解液1 ml，用玻璃勻漿器研磨制備成勻漿，行蛋白定量。30 μg總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE Bio-Rad電泳分離后，4℃電轉(zhuǎn)膜過夜，經(jīng)封閉后依次加入 PPARγ（1∶400）一抗、二抗，用增強型化學發(fā)光試劑盒，Bio-Rad成像儀拍照，應用 Image Lab 4.0圖像分析軟件進行分析。以GADPH為內(nèi)參照物，計算待測條帶吸光度與內(nèi)參吸光度的相對比值。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示，應用SPSS20.0軟件分析，多組間比較采用one-way ANOVA作統(tǒng)計學處理，組間比較采用 q檢驗。

2 結果

2.1 各組小鼠RVSP和RV／（LV+S）的比較

結果表明，低氧組小鼠 RVSP、RV／（LV+S）較常氧組分別高 87%、85%，Hypoxia+apelin組小鼠RVSP、RV／（LV+S）分別較低氧組低 39%、33%（P均 ＜0.05，表 1）。

Tab.1 Comparison of RVSPand RV／（LV+S）among the three groups（ˉx±s，n＝10）

2.2 各組小鼠血脂含量的比較

結果表明，低氧組小鼠血漿中HDL-C、LDL-C、TC含量與常氧組無顯著差異（P均＞0.05）。Hypoxia+apelin組小鼠血漿中LDL-C、TC含量與低氧組無顯著差異（P均 ＞0.05），HDL-C含量和 HDL／LDL比值分別較低氧組高21%和20%（P均＜0.05，表 2）。

2.3 各組小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關基因表達的比較

結果表明，低氧組小鼠肝組織中 HMGCR、LDLR、ABCA1基因表達分別較常氧組分別上調(diào)68%、82%、29%（P均＜0.05），SR-B1基因表達無顯著差異（P＞0.05）。Hypoxia+apelin組小鼠肝組織中LDLR、SR-B1、ABCA1基因表達分別較低氧組上調(diào)241%、112%、69%（P均＜0.05），而HMGCR基因表達下調(diào)45%（p＜0.05，表3）。

Tab.2 Comparison of the concentrations of lipids in mice plasma among the three groups（ˉx±s，n＝10）

Tab.3 Comparison of HMGCR，LDLR，SR-B1，ABCA1mRNA in liver among the three groups（%β-actin，ˉx±s，n＝6）

2.4 各組小鼠肺組織PPARγ蛋白表達的比較

低氧組小鼠肺組織中PPARγ蛋白表達較常氧組上調(diào) 104%（p＜0.05）；Hypoxia+apelin組小鼠肺組織中PPARγ蛋白表達較低氧組上調(diào)47%（p＜0.05，圖 1）。

3 討論

Fig.1 Western blot of PPARγand GADPH in lung tissue of mice PPARγ：Peroxisome proliferators-activated receptor gamma*p＜0.05 vs normoxia；＃p＜0.05 vs hypoxia

Apelin是一種小分子活性多肽，是孤兒G蛋白偶聯(lián)受體-血管緊張素受體AT-1相關的受體蛋白（APJ受體）的天然配體，具有循環(huán)激素、旁／自分泌等功能。Apelin-APJ系統(tǒng)廣泛存在于哺乳動物與人的多種組織中，尤在肺組織的聯(lián)合表達最高。研究表明，apelin-APJ系統(tǒng)在低氧性肺動脈高壓中發(fā)揮著重要作用，低氧可誘導apelin基因敲除小鼠產(chǎn)生更為嚴重的肺動脈高壓［5］，外源性apelin有顯著降低低氧誘導的肺動脈高壓和右心肥大指數(shù)的作用［2］，但具體機制仍未完全明了。新近研究表明，脂質(zhì)代謝異常參與小鼠低氧性肺動脈高壓的形成［3］，而作為一類脂肪因子——apelin具有抑制脂肪形成、促進脂肪分解［4］等作用，尚不清楚apelin改善低氧性肺動脈高壓的作用是否與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關。apoE是LDL受體的配體，參與脂蛋白的轉(zhuǎn)化與代謝過程，在脂質(zhì)代謝過程中發(fā)揮著極其重要的作用，apoE-KO小鼠表現(xiàn)出脂質(zhì)代謝紊亂的表型，常作為脂質(zhì)代謝相關研究（如動脈粥樣硬化等）的實驗動物。Lawrie等［6］報道用高膽固醇膳食喂養(yǎng)apoE-KO小鼠復制出肺動脈高壓的動物模型。已知高膽固醇膳食是強烈的動脈粥樣硬化誘導劑，高膽固醇膳食喂養(yǎng)的apoE-KO小鼠常用于制備動脈粥樣硬化模型，Lawrie等的肺動脈高壓模型并不能完全揭示脂質(zhì)代謝異常在低氧性肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的作用。為進一步闡明脂質(zhì)代謝異常對低氧性肺動脈高壓發(fā)生發(fā)展的影響，以及apelin防治低氧性肺動脈高壓與脂質(zhì)代謝的關系，本實驗在普通飼料喂養(yǎng)的條件下，選用apoE-KO小鼠復制低氧性肺動脈高壓模型，在前期的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)apoE-KO小鼠血漿TC、LDL含量較野生型小鼠顯著升高而HDL含量、HDL／LDL比值顯著降低（數(shù)據(jù)未顯示）。實驗結果顯示：低氧組小鼠右心室收縮壓、右心室肥大指數(shù)較常氧組顯著升高，提示apoE-KO小鼠低氧性肺動脈高壓模型復制成功。令人感興趣的是：apelin組小鼠RVSP、RV／（LV+S）較低氧組顯著降低，提示在脂質(zhì)代謝紊亂的情況下，apelin對低氧誘導的肺動脈高壓仍具有改善作用。

LDL和HDL是血漿中主要的膽固醇，肝臟是LDL和HDL代謝的重要場所，且能分泌多種與脂質(zhì)代謝相關酶類物質(zhì)。LDLR是LDL受體，是攝取和清除血漿LDL的主要受體，LDLR基因表達上調(diào)，提示LDLR胞吞作用增強、細胞外膽固醇含量減少；ABCA1和SR-B1是HDL受體，參與HDL介導的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運過程，SR-B1還參與ox-LDL的清除，ABCA1和SR-B1基因表達上調(diào)，提示膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運增多、血漿中膽固醇含量降低；HMGCR是內(nèi)源性膽固醇合成的關鍵酶。實驗結果顯示：低氧組小鼠肝組織中HMGCR、LDLR、ABCA1基因表達水平較常氧組顯著上調(diào)，提示低氧引起小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝異常，低氧即可通過誘導內(nèi)源性膽固醇合成的作用升高血膽固醇，又可通過促進LDL的清除和HDL逆向轉(zhuǎn)運膽固醇的作用降低血膽固醇，實驗中亦發(fā)現(xiàn)低氧組小鼠與常氧組比較血漿中TC、LDL-C含量無顯著差異，這或許還與低氧妨礙LDL的形成，或低氧誘導LDL氧化修飾為ox-LDL而LDL本身含量無明顯變化［7］等因素有關。有關低氧對機體內(nèi) LDL的形成、LDLR介導的膽固醇攝取與清除的影響及意義有待深入研究。值得注意的是，本實驗結果還顯示：apelin組小鼠肝組織中 LDLR、SR-B1、ABCA1基因表達較低氧組顯著上調(diào)，而HMGCR基因表達顯著下調(diào)，同時血漿中HDL-C的含量和HDL／LDL比值顯著升高，已知HDL是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，具有逆轉(zhuǎn)運膽固醇、抗氧化、減少血小板聚集、擴血管、抗血栓、抑制 LDL氧化等多種作用［8］，提示apelin改善低氧性肺動脈高壓的作用主要與抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，促進LDL的清除和HDL逆向轉(zhuǎn)運膽固醇，上調(diào)HDL的含量和HDL／LDL比值有關。

過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR）屬類固醇激素／甲狀腺素／維甲酸2型核激素受體超家族，是一類配體活化的核轉(zhuǎn)錄因子，有PPARα、β／δ和γ等3種亞型。其中PPARγ作用廣泛，主要參與調(diào)節(jié)糖脂質(zhì)代謝，在脂肪細胞分化、胰島素抵抗、動脈粥樣硬化、炎癥和腫瘤等中發(fā)揮重要作用［9］，且PPARγ受體在肺組織中廣泛表達。已知 apelin編碼基因 APLN是PPARγ的靶基因之一，PPARγ輔激活因子1α可促進人和小鼠脂肪細胞分泌 apelin［10］。本實驗結果顯示：apelin組小鼠肺組織中PPARγ蛋白表達較低氧組顯著上調(diào)，以往研究發(fā)現(xiàn)，激活PPARγ可降低小鼠低氧性肺動脈高壓和改善肺血管重塑作用［11］，提示apelin改善低氧性肺動脈高壓可能是通過上調(diào)PPARγ蛋白表達來實現(xiàn)。但是，apelin改善低氧性肺動脈高壓的具體機制有待進一步的研究。

綜上所述，apelin可降低小鼠低氧性肺動脈高壓，其機制與apelin調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝有關。

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Apelin attenuates hypoxia induced pulmonary hypertension of mice through regulation of lipid metabolism

CHEN Ran，JIANGPu，LIU Ling-yan，GAO Yuan，YANG Xin-xin，CAI Zhuo-chang，F(xiàn)AN Xiao-fang，GONG Yong-sheng，MAO Sun-zhong△
（Institute of Hypoxia Medicine，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China）

Objective：To observe the role of apelin in the prevention of pulmonary hypertension induced by hypoxia in mice.Methods：Adult male apoE gene knockout（apoE-KO）mice were exposed to isobaric hypoxic chamber（9%～11%O2，regular chow feed，23 h／d）for 3 weeks to establish hypoxia-induced pulmonary hypertension.Thirty apoE-KOmice were randomly divided into normoxia group，hypoxia group and hypoxic with apelin（10 nmol／（kg·d），ip）group.The concentrations of high density lipoprotein（HDL），low density lipoprotein（LDL）and total cholesterol in plasma were detected by Elisa method.The mRNA levels of ATP-binding cassette transporter A1（ABCA1），low density lipoprotein receptor（LDLR），scavenger receptor class B1（SR-B1），and HMG-CoA reductase（HMGCR）in liver were measured by real-time PCR.The protein level of peroxisome proliferators-activated receptor gamma（PPARγ）in lung was measured by Western blot.Results：①The right ventricular systolic pressure（RVSP）and the weight ratio of right ventricle（RV）to left ventricle plus septum（LV+S）of hypoxia group were significantly higher than those of normoxia group by 87%and 85% （p＜0.05），respectively.RVSPand RV／（LV+S）of apelin group were significantly lower than those of hypoxia group by 39%and 33%（p＜0.05），respectively.②The plasma concentration of HDL and HDL／LDL of apelin group were significantly higher than those of hypoxia group by 21%and 20%（p＜0.05），respectively.③The mRNA levels of LDLR，SR-B1 and ABCA1 in liver of apelin group were significantly up-regulated than those of hypoxia group by 241%，112%and 69% （p＜0.05），respectively，while the mRNA level of HMGCR was down-regulated by 45% （p＜0.05）.④The protein level of PPARγ in lung of apelin group was significantly up-regulated than that of hypoxia group by 47%（p＜0.05）.Conclusion：Apelin attenuates hypoxiainduced pulmonary hypertension of mice through regulation of lipid metabolism.

apelin； lipid metabolism； pulmonary hypertension； hypoxia； mice

R363.2

A

1000-6834（2017）06-493-05

10.12047／j.cjap.5562.2017.117

浙江省自然科學基金項目（LY14H010005），浙江省教育廳科研項目（Y201326833），浙江省高等學校訪問學者專業(yè)發(fā)展項目（FX2013084）

2017-02-04

2017-10-19

△【通訊作者】Tel：0577-86699521；E-mail：wzlmao＠126.com