侯鵬飛，李 楠，劉展會，程文佳△

1.西安市第九醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710054)，2.西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710043)

·基礎研究·

微小RNA干擾抑制Aurora A表達對膠質(zhì)瘤細胞化療敏感性的影響*

侯鵬飛1，李 楠2，劉展會1，程文佳1△

1.西安市第九醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710054)，2.西安市兒童醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710043)

目的：探討微小RNA干擾抑制Aurora A表達對膠質(zhì)瘤細胞化療敏感性的影響。方法：采用Aurora A特異性siRNA對人腦膠質(zhì)瘤細胞進行轉(zhuǎn)染，使用Western blot和RT-PCR對Aurora A mRNA及蛋白表達情況進行檢測，同時使用化療藥物尼莫司汀(ACNU)對轉(zhuǎn)染后人腦膠質(zhì)瘤細胞進行處理，觀察并分析處理前后膠質(zhì)瘤細胞的增殖和凋亡情況。結果：40 mg/L ACNU處理后各組U251細胞吸光度較0 mg/L ACNU處理后各組細胞器吸光度值明顯下降(P<0.05)，其中以siRNA干擾組細胞吸光度值最低(0.20±0.05)，細胞增殖抑制率為75.1%，遠高于陰性對照組和正常對照組(P<0.05)；轉(zhuǎn)染Aurora A siRNA的U251細胞在經(jīng)40 mg/LACNU處理72h后，其細胞凋亡率明顯高于0 mg/L處理組(P<0.05)，且siRNA干擾組的U251細胞在培養(yǎng)72 h后其凋亡率均明顯高于正常對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論：采用特異性微小RNA對Aurora A基因的表達進行干擾抑制，可有效阻礙膠質(zhì)瘤細胞的增殖過程，且可有效提高膠質(zhì)瘤細胞對于化療藥物的敏感性，有利于增強惡性膠質(zhì)瘤術后化療效果，對于改善患者生存質(zhì)量，延長其生存時間具有十分積極的意義。

術后化療在人腦膠質(zhì)瘤治療中發(fā)揮著十分關鍵的作用，對于降低腫瘤復發(fā)率具有十分重要的意義。尼莫司汀(Nimustine，ACNU)作為一種常用化療藥，由于具有較高的血腦屏障穿透性，目前被臨床廣泛采用為膠質(zhì)瘤的主要化療藥物[1]。但調(diào)查指出，盡管ACNU可有效抑制殘余膠質(zhì)瘤組織的生長，但仍有部分患者的生存情況無法達到理想效果[2]。因此，探討如何提高膠質(zhì)瘤細胞的化療敏感性對于提高此類患者生存質(zhì)量具有十分重要的意義。Aurora A是一種新近發(fā)現(xiàn)的癌基因，在細胞有絲分裂過程中發(fā)揮著重要作用，同細胞異常擴增密切相關[3]。有報道指出，Aurora A的表達情況同腫瘤生物學行為之間存在密切相關性[4]。本研究以人腦膠質(zhì)瘤細胞作為研究樣本，采用微小RNA干擾技術對樣本進行處理，以抑制Aurora A的表達，旨在探討此種技術對膠質(zhì)瘤細胞化療敏感性的影響，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

1 材 料 人腦膠質(zhì)瘤U251細胞株由中國科學院上海細胞生物學研究細胞庫提供，胰蛋白酶、新生牛血清、PRMI-1640培養(yǎng)基由Gibco公司生產(chǎn)；Opti-MEM培養(yǎng)基、Lipofectamine-2000、TRIzol試劑由Incitrogen公司生產(chǎn)；RT-PCR試劑盒由大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)；PI凋亡檢測試劑盒、FITC-Annexin V試劑盒由Sigma公司生產(chǎn)；Aurora A鼠抗人單克隆抗體、Wetern blot試劑盒由Santa Cruz公司生產(chǎn)；ACNU由日本三共株式會社生產(chǎn)。

2 研究方法

2.1 siRNA制備：設計并合成Aurora A特異性Oligo siRNA，并設置陰性對照組，所有樣本均由上海康成生物公司提供。其中siRNA序列中以5’-GCCGGUUCAGAAUCAGAAGTT-3’作為正義鏈，以5’-CUUCUGAUUCUGAACCGGCTT-3’。陰性對照siRNA序列中以5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’作為正義鏈，以5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。RT-PCR引物設計方案如下：以5’-AATCTGGAGGCAAGGTTCGACTG-3’作為上游序列，以5’-TGGGAGATAAGTGGTTAAGGAGG-3’作為下游片段，以β-actin作為內(nèi)參照，擴增片段設定為308bp。

2.2 膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)方法：取U251膠質(zhì)瘤細胞，在10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，恒溫培養(yǎng)箱參數(shù)設定為：飽和濕度、5%CO2、37 ℃。待細胞接近生長成致密單層過80%長滿后，進行傳代，并將對數(shù)生長期細胞作為實驗樣本。

2.3 轉(zhuǎn)染及分組：按照陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，采用Lipofectamine-2000試劑進行相關操作，對Oligo siRNA進行熒光標記，對U251細胞進行轉(zhuǎn)染，4 h后對轉(zhuǎn)染效果進行觀察，取20 nmol/L最佳轉(zhuǎn)染濃度細胞進行實驗，在CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，72 h后進行細胞收集。分別以Aurora A siRNA+脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液作為siRNA干擾組，將陰性siRNA+脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液作為陰性對照組，將脂質(zhì)體+轉(zhuǎn)染液作為正常對照組。取40 mg/L ACNU分別加入三組。

2.4 流式細胞術(FCM)檢測：轉(zhuǎn)染前24 h于6孔板中接種細胞，濃度為(1～2)×105個/孔，進行轉(zhuǎn)染并取40 mg/L、0 mg/L ACNU進行培養(yǎng)，加液量控制為1.5 ml，72 h后進行細胞收集，常規(guī)離心、漂洗后取4倍稀釋結合緩沖液100 μl使細胞懸浮，同時加入PI 100 μl和Annexin V FITC 5 μl，混合均勻后在避光室進行15～30 min孵育，再將其轉(zhuǎn)移至5 ml流式反應管中，取PBS 400 μl加入后上機檢測。

2.5 MMT檢測：在100 μl無抗培養(yǎng)基中于轉(zhuǎn)染前24 h在96孔板中進行接種，接種濃度設定為(0～1)×104個/孔，同時分別取0 mg/L、40 mg/L ACNU進行共同培養(yǎng)，培養(yǎng)72 h后將培養(yǎng)液吸出，取MMT液20 μl加入，于恒溫培養(yǎng)箱中進行4 h孵育。之后將MTT液吸出，取DMSO 150 μl加入孔中，搖動混合10 min使結晶溶解。在560 nm處使用酶標儀對各孔吸光度值(A)進行讀取，其中細胞生長抑制率(IR)定義如下：IR=(A對照組-A實驗組)/A對照組×100%。

3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS18.0統(tǒng)計學軟件，計量資料以平均值±標準差表示，進行t檢驗，P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 吸光度值 在采用Aurora A siRNA對U251細胞進行轉(zhuǎn)染72 h后，40 mg/L ACNU處理后各組U251細胞吸光度較0 mg/L ACNU處理后各組細胞器吸光度值明顯下降(P<0.05)，其中以siRNA干擾組細胞吸光度值最低，僅為0.20±0.05，細胞增殖抑制率為75.1%，遠高于陰性對照組和正常對照組(P<0.05)。其中陰性對照組和正常對照組的細胞增殖抑制率并無明顯統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 ACNU處理后各組細胞吸光度值

注：與siRNA干擾組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，△P>0.05

2 細胞凋亡 轉(zhuǎn)染Aurora A siRNA的U251細胞在經(jīng)40 mg/LACNU處理72 h后，其細胞凋亡率明顯高于0 mg/L處理組，高達(21.29±1.81)%；且siRNA干擾組的U251細胞在培養(yǎng)72 h后其凋亡率均明顯高于正常對照組和陰性對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正常對照組和陰性對照組的細胞凋亡率比較意義無統(tǒng)計學(P>0.05)。其中，siRNA干擾組細胞未經(jīng)ACNU處理凋亡率同樣明顯高于陰性對照組和正常對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 Aurora A siRNA轉(zhuǎn)染后經(jīng)ACNU處理后U251細胞凋亡情況(%)

注：與siRNA干擾組相比，*P<0.05；與陰性對照組相比，△P> 0.05

討 論

化療是一種常用的惡性腫瘤治療手段，主要通過對腫瘤細胞增殖進行抑制，并誘導其凋亡從而阻止惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。對于腦膠質(zhì)瘤患者而言，術后化療可有效改善其臨床癥狀，延長其生存時間。但既往研究證實，膠質(zhì)瘤患者盡管接受術后化療，但仍存在較高的復發(fā)率和死亡率。有研究認為，腫瘤細胞的耐藥性和對化療藥物敏感性降低是造成膠質(zhì)瘤患者術后復發(fā)率居高不下的主要原因[6]。因此，探討如何提高膠質(zhì)瘤細胞的化療敏感性對于提高此類患者的生存質(zhì)量具有十分重要的臨床意義。

ACNU是一種細胞周期非特異性抗腫瘤藥物，主要通過對腫瘤細胞有絲分裂進行抑制從而發(fā)揮抗腫瘤效果[7]。藥理實驗證實，ACNU具有較高的血腦屏障穿透性，在給藥30 min后，腦脊液中血藥濃度即可達到高峰[8]。盡管當前臨床普遍在腦膠質(zhì)瘤治療中應用ACNU進行化療，但大量報道據(jù)指出，在采用ACNU進行惡性膠質(zhì)瘤化療時，患者6個月無進展生存率僅為20%。Aurora A是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞有絲分裂過程中具有十分關鍵的作用。Jeng等研究指出，Aurora A同惡性腫瘤之間存在一定相關性，特別是在膀胱癌、食管癌等惡性腫瘤中，Aurora A表達水平同患者的腫瘤生物學行為之間存在顯著聯(lián)系。Klein 等研究指出，腦膠質(zhì)瘤中存在一定程度的Aurora A表達，認為其同膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。微小RNA干擾是近年來臨床新興的一種抗腫瘤技術，可對惡性腫瘤基因進行高效特異性抑制[9]。在本次研究中，首先合成Aurora A基因針對特異性Oligo SiRNA，病對膠質(zhì)瘤U251細胞株進行轉(zhuǎn)染，檢測結果顯示，轉(zhuǎn)染后U251細胞中Aurora A基因表達顯著降低，提示Aurora A基因的表達被Aurora A siRNA成功抑制。之后培養(yǎng)細胞樣本，并采用ACNU對Aurora A siRNA轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤U251細胞進行處理，MTT檢測顯示，經(jīng)Aurora A siRNA轉(zhuǎn)染處理后，膠質(zhì)瘤U251細胞在經(jīng)ACNU處理后其細胞增值率較未經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞明顯升高，其中采用40 mg/L ACNU對轉(zhuǎn)染Aurora A siRNA轉(zhuǎn)染后U251膠質(zhì)瘤細胞進行處理，其增值抑制率可達75.1%，顯著高于陰性對照組、正常對照組。流式細胞術檢測結果則顯示，轉(zhuǎn)染Aurora A siRNA的膠質(zhì)瘤U251細胞在經(jīng)過ACNU處理后，其細胞凋亡率明顯上升(21.29%±1.81%)，同陰性對照組、正常對照組相比明顯升高。其中經(jīng)Aurora A siRNA轉(zhuǎn)染后且未經(jīng)ACNU處理的膠質(zhì)瘤U251細胞器凋亡率同樣明顯高于正常對照組、陰性對照組，表明采用特異性微小RNA對Aurora A基因表達進行抑制，可有效對膠質(zhì)瘤細胞增殖進行抑制，且有助于提高膠質(zhì)瘤細胞的的化療藥物敏感性。

綜上所述，采用特異性微小RNA對Aurora A基因的表達進行干擾抑制，可有效阻礙膠質(zhì)瘤細胞的增殖過程，且可有效提高膠質(zhì)瘤細胞對于化療藥物的敏感性，有利于增強惡性膠質(zhì)瘤術后化療效果，對于改善患者生存質(zhì)量，延長其生存時間具有十分積極的意義。

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EffectofmicroRNAinterferenceonthesensitivityofAuroraAexpressiontochemosensitivityofgliomacells

Hou Pengfei, Li Nan, Liu Zhanhui, et al.

Department of Neurosurgery, Xi'an Ninth Hospital(Xi'an 710054)

Objective: To investigate the effect of microRNA interference on the sensitivity of Aurora A to glioma cell chemosensitivity. Methods: Aurora A-specific siRNA was used to transfect human glioma cells. Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of Aurora A mRNA and protein. At the same time, the chemotherapy drug Nimustine (ACNU) .The glioma cells were treated and the proliferation and apoptosis of glioma cells were observed before and after treatment. Results: The absorbance of U251 cells in each group treated with 40mg / L ACNU was significantly lower than that of 0mg / L ACNU (P<0.05). The cell absorbance was the lowest (0.20 ± 0.05) (P<0.05). The apoptosis rate of U251 cells transfected with Aurora A siRNA was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the apoptosis rate of U251 cells treated with 40mg / LACNU was significantly higher than that of the control group (P<0.05), and the apoptotic rate of U251 cells in siRNA-treated group was significantly higher than that in normal control group and negative control group (P<0.05). Conclusion: The specific microRNA can inhibit the expression of Aurora A gene and can effectively inhibit the proliferation of glioma cells, and can effectively improve the sensitivity of glioma cells to chemotherapeutic drugs, which is helpful to enhance the expression of malignant gliomas Postoperative chemotherapy effect, for improving the quality of life of patients, to extend their survival time has a very positive significance.

Glioma/Immunology RNA interference @Chemosensitivity Oncogenes/Immunology Cell proliferation Apoptosis Nimustine

*陜西省衛(wèi)生和計劃生育委員會科研項目(2013JM40172)

△通訊作者

神經(jīng)膠質(zhì)瘤/免疫學 RNA干擾 @化療敏感性 癌基因/免疫學 細胞增殖 細胞凋亡 尼莫司汀

R739.4

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.001

(收稿：2017-03-21)