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(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林吉林 132013)

響應(yīng)面法優(yōu)化酶法提取蜜環(huán)菌多肽及其抗疲勞活性

于歡,李露,王思爽,馬麗穎,劉秋爽,鐘炳昌,張慧鋒*

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林吉林 132013)

以蜜環(huán)菌子實(shí)體為原料,采用酶解法制備蜜環(huán)菌多肽。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,以水解度為響應(yīng)值,研究底物濃度、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)響應(yīng)值的影響。通過(guò)游泳實(shí)驗(yàn)建立小鼠疲勞模型,考察蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠游泳時(shí)間、肝糖原、肌糖原、尿素氮(BUN)、乳酸(LA)、乳酸脫氫酶(LDH)等指標(biāo)的影響。結(jié)果表明:酶解法提取蜜環(huán)菌多肽的最佳工藝為:底物濃度7.4%,加酶量2%,酶解溫度51 ℃,酶解時(shí)間4.6 h,水解度為35.61%,與理論值接近。以中劑量組為例,相對(duì)于空白組,蜜環(huán)菌多肽可以使小鼠肝糖原和肌糖原的含量分別提高109.01%和58.33%,顯著降低代謝產(chǎn)物尿素氮水平36.99%、乳酸水平30.33%,乳酸脫氫酶的活性提高9%,以上數(shù)值p<0.05。綜上蜜環(huán)菌多肽具有提高抗疲勞能力的作用。

蜜環(huán)菌,響應(yīng)面,抗疲勞,多肽

蜜環(huán)菌[Armillariamellea(Vahl ex Fr)]屬于擔(dān)子菌亞門(mén)傘菌目白蘑料蜜環(huán)菌屬,又名蜜環(huán)蕈榛蘑,是人們常食食用菌之一[1]。蜜環(huán)菌與中藥天麻共生,是一種食藥兼用真菌,其子實(shí)體味道鮮美,含有多種營(yíng)養(yǎng)成分,并具有高蛋白低脂肪維生素含量豐富等特點(diǎn)。民間常用于預(yù)防視力失常、皮膚干燥、治療癲癇、抵抗某些呼吸道和消化道疾病?，F(xiàn)代研究表明,蜜環(huán)菌及其發(fā)酵產(chǎn)物有較多的藥理作用,包括催眠鎮(zhèn)靜、調(diào)節(jié)血液循環(huán)、增強(qiáng)免疫能力、清除自由基、延緩衰老,抑制腫瘤等作用[2]。蜜環(huán)菌蛋白含量極高,對(duì)其蛋白降解產(chǎn)物的生理活性已經(jīng)有了許多相關(guān)研究,但是對(duì)其可能的抗疲勞作用仍無(wú)相關(guān)研究,由此我們采用生物酶降解的手段制備蜜環(huán)菌多肽,并對(duì)其抗疲勞作用進(jìn)行初步研究。酶解法制備活性肽具有反應(yīng)條件溫和,提取效率高的特點(diǎn),而且這也是當(dāng)前活性肽研究的熱點(diǎn)。然而蛋白酶種類(lèi)很多,水解能力各不相同[3-4],不同來(lái)源的蛋白酶酶解蛋白得到的肽的氨基酸殘基組成也有不同,蛋白酶水解產(chǎn)物活性也不同。同時(shí)酶解效果受到多方面因素影響,因此制備高活性肽的關(guān)鍵是篩選出合適的蛋白酶以及酶解條件[5]。本實(shí)驗(yàn)以蜜環(huán)菌子實(shí)體為底物,以響應(yīng)面法得到優(yōu)化的酶解工藝,用耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)檢測(cè)[6]評(píng)價(jià)了蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠 體重20～22 g,許可證號(hào) SCXK(吉)2016-0001,購(gòu)于吉林大學(xué)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心);蜜環(huán)菌子實(shí)體 由人工馴化的黃綠蜜環(huán)菌菌種 Armillaria luteo-rivens AM-H自行發(fā)酵得到;木瓜蛋白酶(800000 U/g)、菠蘿蛋白酶(200000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(200000 U/g)、堿性蛋白酶(200000 U/g)、中性蛋白酶(60000 U/g) Sigma公司;乳酸測(cè)試盒、糖原測(cè)試盒、尿素氮測(cè)試盒、乳酸脫氫酶試劑盒、總蛋白測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所;福林酚試劑、鄰苯三酚、硫酸銨、硼酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、鹽酸 均為分析純。

數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司;pHS-3C數(shù)字酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠;ML203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MS300磁力攪拌器 上海般特儀器有限公司;MiniSpin plus離心機(jī) Eppendorf 中國(guó);mini1240分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蜜環(huán)菌多肽提取液的制備 將干燥蜜環(huán)菌子實(shí)體粉碎后過(guò)40目篩,稱(chēng)取粉末5 g加入錐形瓶中,按照料液比1∶10的比例加入蒸餾水,0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)pH至酶解條件,加酶量800 U/g,恒溫水浴酶解一定時(shí)間,100 ℃加熱滅活10 min,5000 r/min離心分離上清,上清液0.1 mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)整pH至中性,既得蜜環(huán)菌多肽提取液。

1.2.2 水解度的測(cè)定 蜜環(huán)菌水解度(DH)是水解過(guò)程中所斷裂的肽鍵數(shù)占總肽鍵數(shù)的比例,通常表示為百分?jǐn)?shù)的形式。按下式進(jìn)行計(jì)算:

DH(%)=(水解后生成的α-氨基氮的量/樣品總含氮量)×100

式(1)

甲醛滴定法[7]測(cè)得水解后生成的a-氨基氮的量,凱氏定氮法測(cè)得樣品總含氮量,按照式(1)計(jì)算水解度。

1.2.3 蛋白酶的選擇 將蜜環(huán)菌子實(shí)體分別用堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行7 h酶解,按照文獻(xiàn)記載條件[8]以1.2.1項(xiàng)下方法操作,以子實(shí)體水解度(DH)為考察指標(biāo),篩選出具有最優(yōu)水解效果的一種酶。

1.2.4 酶解單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以水解度為考察指標(biāo)[9],中性條件(pH6.8～7.8)下選擇蜜環(huán)菌子實(shí)體濃度(2%、5%、8%、11%、14%,質(zhì)量分?jǐn)?shù))、加酶量(600,1200,1800,2400,3000,3600 U/g)、水解時(shí)間(3、5、7、9、11 h)、酶解溫度(35、45、55、65、75 ℃)4因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。酶解初始條件蜜環(huán)菌子實(shí)體濃度5%,加酶量 1200 U/g,水解時(shí)間5 h,酶解溫度45 ℃,控制變量法進(jìn)行單因素條件篩選。

1.2.5 酶解條件響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以蜜環(huán)菌子實(shí)體水解度為響應(yīng)值,結(jié)合Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,選擇底物濃度、加酶量、酶解溫度和酶解時(shí)間,設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),共有27個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn),實(shí)驗(yàn)因素及水平編碼見(jiàn)表1。

表1 中心組合實(shí)驗(yàn)因素水平編碼表Tabel 1 Factors and levels in the central composite design

1.2.6 多肽抗疲勞能力研究

1.2.6.1 動(dòng)物分組 適應(yīng)喂養(yǎng)7 d后,120只小鼠隨機(jī)分為4組,每組30只,分別進(jìn)行臟器系數(shù)和負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn),糖原含量測(cè)定,血清尿素氮測(cè)定,乳酸含量和乳酸脫氫酶活力測(cè)定,其中每個(gè)實(shí)驗(yàn)組又分別為空白組(生理鹽水)、低、中、高劑量組(灌胃給10、20、40 mg/kg/d蜜環(huán)菌多肽),陽(yáng)性對(duì)照組(灌胃給予50 mg/kg/d?；撬?,連續(xù)灌胃給藥30 d,期間自由飲水和攝食。

1.2.6.2 小鼠體質(zhì)量檢測(cè) 小鼠適應(yīng)性培養(yǎng)7 d后,按照動(dòng)物分組,分別于灌胃前,灌胃15 d,灌胃30 d稱(chēng)量體重并記錄[10]。

1.2.6.3 臟器系數(shù) 末次灌胃給藥30 min后,強(qiáng)制小鼠連續(xù)游泳90 min,處死并分離脾臟、胸腺、肝、腎,生理鹽水清洗濾紙吸干,分別稱(chēng)重,按照式(2)計(jì)算臟器系數(shù)[11]。

臟器系數(shù)=臟器絕對(duì)重量(mg)/體質(zhì)量(g)

式(2)

1.2.6.4 小鼠負(fù)重游泳時(shí)間測(cè)定 末次灌胃給藥30 min后,在小鼠尾部負(fù)體質(zhì)量5%的鉛絲,置25 ℃的水深30 cm水箱中進(jìn)行游泳,記錄小鼠從進(jìn)入水中至游泳力竭頭部完全沒(méi)入水中不能上浮的時(shí)間。

1.2.6.5 肝糖原和肌糖原含量的測(cè)定 采用硫酸蒽酮法測(cè)定糖原,末次灌胃給藥30 min后,小鼠不負(fù)重游泳90 min,解剖分離肝臟、肌肉,生理鹽水洗去血液,濾紙吸干水分,稱(chēng)質(zhì)量<100 mg樣品。每百毫克樣品加入100 μL堿液,沸水浴中水解20 min,流水立即冷卻。水解液加蒸餾水制成1%肝糖原檢測(cè)液和5%肌糖原檢測(cè)液,按糖原測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定OD值,空白管調(diào)零,糖原含量按照式(3)計(jì)算。

糖原含量(mg/g)=測(cè)定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×0.01 mg×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)×10/1.11

式(3)

1.2.6.6 尿素氮含量的測(cè)定 末次灌胃給藥30 min后,小鼠不負(fù)重游泳90 min,靜息60 min后摘除眼球取血,血樣靜置1 h,3000 r/min離心15 min取上清,分別測(cè)定游泳后和游泳前血清尿素氮含量。按尿素氮測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定尿素氮含量,按式(4)計(jì)算。

尿素氮含量(mmol/L)=(測(cè)定OD值-空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 mmol/L)×樣品稀釋倍數(shù)

式(4)

1.2.6.7 乳酸含量測(cè)定 末次灌胃給藥30 min后,各組分別在安靜時(shí)及負(fù)重體重5%游泳30 min后的0,20 min摘除眼球取血,制備血清,按乳酸測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)操作測(cè)定各管OD值,乳酸含量按式(5)計(jì)算。

乳酸含量(mmol/L)=(樣品管OD值-空白管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(3 mmol/L)×測(cè)定樣本稀釋倍數(shù)

式(5)

1.2.6.8 乳酸脫氫酶活性測(cè)定 末次灌胃給藥30 min后,各組分別在小鼠安靜時(shí)及負(fù)重體重5%游泳20 min后立即摘除眼球取血,制備血清。按乳酸脫氫酶試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,混勻,室溫放置5 min,于酶標(biāo)儀上450 nm處測(cè)定各管吸光度,按式(6)計(jì)算LDH活力。

計(jì)算公式:血清中LDH活力(U/L)=(測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.2μmol/mL)×1000

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

酶解工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行二次回歸分析及方差分析,抗疲勞活性采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

從圖1中可以看出在各自適宜條件下中性蛋白酶對(duì)蜜環(huán)菌子實(shí)體的水解程度最高,這可能是由于蛋白酶對(duì)底物水解的選擇性所導(dǎo)致[8],故選擇中性蛋白酶作為酶解蛋白,在下面的實(shí)驗(yàn)中以水解度為響應(yīng)值優(yōu)化酶解條件。

圖1 不同蛋白酶的水解效果Fig.1 Effect of different protease on hydrolysis

2.2 酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 底物濃度對(duì)水解度的影響 由圖2可知,水解度隨底物濃度的升高呈現(xiàn)先升高隨后趨于平緩略有下降的過(guò)程,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?%時(shí)水解效果較好。這可能是由于在一個(gè)酶催化反應(yīng)中,當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),蜜環(huán)菌子實(shí)體與蛋白酶的接觸不充分,隨著底物濃度的增加,可以與蛋白酶接觸的底物量也隨之增大,水解反應(yīng)也更充分。當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高時(shí),蛋白酶被飽和,同時(shí)導(dǎo)致蛋白酶的濃度相對(duì)下降減少了底物與蛋白酶的接觸,使水解度表現(xiàn)為略有降低[12]。

圖2 底物濃度對(duì)水解度的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on hydrolysis

2.2.2 加酶量對(duì)水解度的影響 由圖3可知水解度隨加酶量加大而增大,達(dá)到1200 U/g以上時(shí),變化平緩。這是由于在底物的量是有限的情況下,適量的增加酶量能夠促進(jìn)酶解反應(yīng)的進(jìn)行,但當(dāng)酶量達(dá)到飽和時(shí),多余的酶不參加催化反應(yīng),所以水解度不再上升[13]。

圖3 加酶量對(duì)水解度影響Fig.3 Effect of enzyme dosage on hydrolysis

2.2.3 水解時(shí)間對(duì)水解度的影響 由圖4可知水解度隨水解時(shí)間延長(zhǎng)而增大,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)水解度增大的趨勢(shì)隨之減緩直至基本不再升高,這是由于隨反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng),體系中反應(yīng)產(chǎn)物逐漸累積直至抑制反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行。

圖4 水解時(shí)間對(duì)水解度影響Fig.4 Effect of different time on hydrolysis

2.2.4 水解溫度對(duì)水解度的影響 如圖5所示,在適當(dāng)溫度范圍內(nèi),升溫可以促進(jìn)反應(yīng)體系中分子的運(yùn)動(dòng)增加分子間碰撞的機(jī)率,表現(xiàn)為酶促反應(yīng)水平的升高,但是蛋白酶本質(zhì)上是一種蛋白質(zhì),溫度過(guò)高會(huì)破壞蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而失活,表現(xiàn)為水解度的下降[14]。

圖5 水解溫度對(duì)水解度影響Fig.5 Effect of different temperature on hydrolysis

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2,采用Design Expert 8.05b對(duì)結(jié)果進(jìn)行二次回歸多項(xiàng)擬合。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and test results

4因素對(duì)蜜環(huán)菌子實(shí)體水解度回歸方程為:

Y=+35.04-1.91×A+1.79×B+4.32×C-1.28×D+1.19×A×B+1.57×A×C+2.26×A×D-2.59×B×C-1.93×B×D-1.52×C×D-4.96×A2-4.67×B2-13.78×C2-5.98×D2(R2=0.9619)

回歸模型顯著度高(p<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(p>0.05),相關(guān)系數(shù)R=0.9619,說(shuō)明回歸方程擬合度和可信度適當(dāng)[15]。由表3的模型分析可知,酶解溫度對(duì)水解度的影響最為顯著,其次是底物濃度,加酶量,酶解時(shí)間對(duì)于水解度影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Results of variance analysis of regression model

2.4 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

響應(yīng)面是響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖,各個(gè)參數(shù)之間的相互作用可以從響應(yīng)面上得到直觀地體現(xiàn)。由圖6可知,實(shí)驗(yàn)得到的響應(yīng)面為一開(kāi)口向下的曲面,響應(yīng)值所因素水平的升高而升高,當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到最高點(diǎn)后,響應(yīng)值隨因素水平的升高而下降。

圖6 四因素對(duì)水解度的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of four factors on hydrolysis

2.5 回歸模型驗(yàn)證

模型預(yù)測(cè)底物濃度7.42%,加酶量1300.08 U/g,酶解溫度51.40 ℃,酶解時(shí)間4.62 h,水解度達(dá)到最高為35.79%。實(shí)際操作中選擇底物濃度7.4%,加酶量1300 U/g,酶解溫度51 ℃,酶解時(shí)間4.6 h;經(jīng)模型預(yù)測(cè)水解度為35.8%,平行進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),水解度平均值為35.61%,與預(yù)測(cè)值吻合。

2.6 多肽抗疲勞能力研究結(jié)果

2.6.1 對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響 由表4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn),隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),各種小鼠的體重均呈現(xiàn)上升趨勢(shì),然而各組之間差異不顯著(p>0.05),表明給予蜜環(huán)菌多肽對(duì)于小鼠的體重沒(méi)有顯著性影響。

表4 蜜環(huán)菌多肽肽對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響Table 4 Effects of ALP on weight of mice

2.6.2 對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 由表5可知,蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠脾臟和胸腺指數(shù)有一定影響,低、中、高劑量組間差異不顯著(p>0.05),胸腺指數(shù)中、高劑量組與空白組差異顯著(p<0.05)。對(duì)于肝臟和腎臟指數(shù)無(wú)顯著影響(p>0.05),胸腺和脾臟作為免疫器官,蜜環(huán)菌多肽對(duì)兩者系數(shù)的提高,表明其有增強(qiáng)非特異性免疫功能的作用[16]。

2.6.3 對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間的影響 空白組、陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間分別為85±3.51,117±4.29,102±3.46,129±5.16,146±4.72 min,蜜環(huán)菌多肽組小鼠負(fù)重游泳時(shí)間顯著延長(zhǎng),與空白組相對(duì)比差異顯著(p<0.05)。游泳實(shí)驗(yàn)是觀察動(dòng)物抗疲勞能力的重要指標(biāo),機(jī)體的運(yùn)動(dòng)耐力可以被負(fù)重游泳時(shí)間直接反映,蜜環(huán)菌多肽組可以顯著延長(zhǎng)負(fù)重游泳時(shí)間,延長(zhǎng)比率與劑量呈正相關(guān),所以蜜環(huán)菌多肽提高了小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力。

表5 蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響Table 5 Effects of ALP on viscera indices of mice

注:*表示與空白組差異顯著(p<0.05),**表示與空白組差異極顯著(p<0.01)；表6～表9同。

2.6.4 對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原含量的影響 由表6可知,蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原都有顯著升高的效果,中、高劑量組相對(duì)于空白組含量升高顯著(p<0.05),低劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(p>0.05),對(duì)糖原的升高效果呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。糖以肝糖原和肌糖原兩種形式在機(jī)體內(nèi)貯存,是糖代謝過(guò)程中重要能源物質(zhì)形式。貯存的肝糖原和肌糖原提供運(yùn)動(dòng)所需能量,維持運(yùn)動(dòng)時(shí)的血糖水平,延緩疲勞,糖原可以作為評(píng)價(jià)疲勞的指標(biāo)[17]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在連續(xù)灌胃給予蜜環(huán)菌多肽后,機(jī)體對(duì)糖原貯備能力提高,同時(shí)在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中對(duì)糖原的消耗也有所下降,從而提高糖原的利用效率,延緩疲勞的產(chǎn)生。

表6 蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠肝糖原和肌糖原的影響(mg/g)Table 6 Effects of ALP on liver glycogen and muscle glycogen of mice(mg/g)

2.6.5 對(duì)小鼠尿素氮含量的影響 由表7可知,小鼠強(qiáng)制游泳后血清尿素氮的含量明顯上升,陽(yáng)性對(duì)照組和蜜環(huán)菌多肽組尿素氮含量均低于空白組,低、中、高劑量組與空白組差異顯著(p<0.05),蜜環(huán)菌多肽對(duì)于降低小鼠血清尿素氮含量的作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。小鼠長(zhǎng)時(shí)間游泳后,糖代謝和脂肪分解代謝將不能提供足夠的能量維持運(yùn)動(dòng)所需,此時(shí)蛋白質(zhì)和氨基酸會(huì)參與分解代謝提供能量,此外,核苷酸代謝隨之加強(qiáng),這些代謝途徑都會(huì)產(chǎn)生氨通過(guò)尿素循環(huán)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蛩?因此血清中尿素氮的含量會(huì)隨之上升。故而尿素氮反映整體蛋白質(zhì)的代謝情況,蜜環(huán)菌多肽可能通過(guò)降低運(yùn)動(dòng)后血清尿素氮的生成,延緩疲勞的產(chǎn)生[18]。

表7 蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠尿素氮含量的影響(mmol/L)Table 7 Effects of ALP on BUN of mice(mmol/L)

2.6.6 對(duì)小鼠乳酸含量的影響 由表8可知,在游泳之后小鼠血清中乳酸含量都有所升高,陽(yáng)性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的血清乳酸含量均低于空白組,乳酸增加水平空白對(duì)照組>陽(yáng)性對(duì)照組>低劑量組>中劑量組>高劑量組;在休息20 min后,各組的血清乳酸含量據(jù)有所下降,與空白組相比,陽(yáng)性對(duì)照組和低劑量組差異顯著(p<0.05),中、高劑量組差異極顯著(p<0.01)。乳酸在機(jī)體內(nèi)的含量與疲勞程度呈正相關(guān),其濃度水平既是引發(fā)疲勞的一個(gè)重要因素,也是評(píng)價(jià)機(jī)體有氧代謝能力和疲勞程度的敏感指標(biāo)[19-21]。蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)后血清中乳酸含量表現(xiàn)出一定的抑制作用,從而能夠提高其抗疲勞能力。

表8 蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠乳酸含量的影響(mmol/L)Table 8 Effects of ALP on lactic acid content of mice(mmol/L)

2.6.7 對(duì)小鼠乳酸脫氫酶活力的影響 由表9可知,各實(shí)驗(yàn)組小鼠在游泳前LDH活性無(wú)明顯差異,在游泳20 min后,陽(yáng)性對(duì)照組、低劑量組與空白組相比LDH活性差異顯著(p<0.05);中、高劑量組與空白組相比差異顯著(p<0.01)。運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的乳酸可以被乳酸脫氫酶所清除,乳酸脫氫酶活性的增強(qiáng)可以加快乳酸的清除,減少乳酸的累積,提高機(jī)體抗疲勞能力[22]。蜜環(huán)菌多肽可以顯著提高LDH活性,從而加快清除無(wú)氧糖酵解生成的乳酸,減少乳酸在體內(nèi)的累積,延緩疲勞的產(chǎn)生或加速疲勞的消除。

表9 蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠乳酸脫氫酶活性的影響(U/L)Table 9 Effects of ALP on LDH of mice(U/L)

3 結(jié)論

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化,最優(yōu)水解條件為底物濃度7.4%,加酶量1300 U/g,酶解溫度51 ℃,酶解時(shí)間4.6 h,水解度為35.61%。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)蜜環(huán)菌多肽的抗疲勞活性進(jìn)行了考察,結(jié)果表明蜜環(huán)菌多肽對(duì)小鼠的自然生長(zhǎng)情況無(wú)影響,蜜環(huán)菌多肽能夠顯著延長(zhǎng)小鼠力竭游泳時(shí)間、降低游泳后血乳酸和血清尿素氮含量、增強(qiáng)乳酸脫氫酶活力、提高肝糖原和肌糖原含量。蜜環(huán)菌多肽能快速清除疲勞所產(chǎn)生的血乳酸和血清尿素氮,加速疲勞的消除,并且該作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。

[1]邵力平,沈瑞祥,張素軒. 真菌分類(lèi)學(xué)[M]. 北京:中國(guó)林業(yè)出版社,1984:4,370.

[2]袁媛,劉景圣,蔡丹. 蜜環(huán)菌化學(xué)成分與藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊),2008(5):46-49.

[3]Tomita M,Bellamy W,Takase M,et al. Potent antibacterial peptides generated by pepsin digestion of bovine lactoferrin[J]. J Dairy Sci,1991，74(12):4137-42.

[4]李建杰,榮瑞芬. 堿性蛋白酶對(duì)核桃蛋白水解條件的優(yōu)化研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011(2):129-135.

[5]Deng L,Wang Z,Yang S,et al. Improvement of Functional Properties of Wheat Gluten Using Acid Protease from Aspergillus usamii[J]. PLoS One,2016 11(7):e0160101.

[6]Song J,Wang Y,Teng M,et al. Studies on the Antifatigue Activities of Cordyceps militaris Fruit Body Extract in Mouse Model[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2015,2015:174616.

[7]白騰輝,潘潤(rùn)淑,馬亞萍,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化酪蛋白酶法水解條件[J]. 食品工業(yè)科技,2014(23):203-206，216.

[8]焦迎春,楊春江,周勁松,等. 響應(yīng)面法優(yōu)化黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體蛋白酶解條件[J]. 生物學(xué)雜志,2009(1):41-44.

[9]Naqash S Y,Nazeer R A. Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for the production of antioxidant peptides from muscles of Nemipterus japonicus and Exocoetus volitans using response surface methodology[J]. Amino Acids,2012，43(1):337-45.

[10]周慶峰,姜書(shū)納,馬亢,等. 鐵棍山藥多糖抗疲勞及耐缺氧作用研究[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2014(2):284-285.

[11]潘建科,謝輝,劉軍,等. 龍鱉膠囊對(duì)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠體質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響[J]. 中華中醫(yī)藥雜志,2016(8):3234-3237.

[12]范三紅,杜靜婷,王相帥. 響應(yīng)面法優(yōu)化油松花粉蛋白酶解工藝[J]. 食品工業(yè)科技,2016(4):236-241.

[13]何曉梅,張穎,許星云,等. 低檔綠茶多糖的酶法輔助提取及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2015(10):153-157,162.

[14]Huang Y,Ruan G,Qin Z,et al. Antioxidant activity measurement and potential antioxidant peptides exploration from hydrolysates of novel continuous microwave-assisted enzymolysis of the Scomberomorus niphonius protein[J]. Food Chem,2017 223:89-95.

[15]Quiros A,Hernandez-Ledesma B,Ramos M,et al. Short communication:Production of antihypertensive peptide HLPLP by enzymatic hydrolysis:optimization by response surface methodology[J]. J Dairy Sci,2012，95(8):4280-5.

[16]鄧子煜,高建. 參苓白術(shù)丸抗疲勞作用實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2009(3):69-70.

[17]金鐵,楊詠潔,李鉉軍,等. 高山紅景天對(duì)小鼠抗疲勞及抗氧化作用的研究[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā),2013(19):24-26,121.

[18]Chi A,Li H,Kang C,et al. Anti-fatigue activity of a novel polysaccharide conjugates from Ziyang green tea[J]. Int J Biol Macromol,2015，80:566-72.

[19]Li Y X,Yang Z H,Lin Y,et al. Antifatigue Effects of Ethanol Extracts and Polysaccharides Isolated from Abelmoschus esculentus[J]. Pharmacogn Mag,2016,12(47):219-24.

[20]Wang C Y,Pan J H,Li H.Effect of epigallocatechin gallate against exercise-induced fatigue in mice[J]. Zhongguo Ying Yong Sheng Li Xue Za Zhi,2015,31(1):85-8.

[21]Zhao X N,Liang J L,Chen H B,et al. Anti-Fatigue and Antioxidant Activity of the Polysaccharides Isolated fromMillettiaespeciosaeChamp. Leguminosae[J]. Nutrients,2015,7(10):8657-8669.

[22]Jin S Y,Li R S,Shen B D,et al. Lignans-rich extract from Herpetospermum caudigerum alleviate physical fatigue in mice[J].Chin J Integr Med,2016,22(11):840-845.

OptimizationofenzymatichydrolysisofArmillariamelleaVahlexFrpeptidesbyresponsesurfacemethodologyanditsanti-fatigueability

YUHuan,LILu,WANGSi-shuang,MALi-ying,LIUQiu-shuang,ZHONGBing-chang,ZHANGHui-feng*

(College of Pharmacy,Jilin Medical College,Jilin 132013,China)

ArmillariamelleaVahl exFr was obtained by enzymatic hydrolysis withArmillariamelleaVahl exFr powder as raw material. The preparation process of walnut peptide was optimized on foundation of single factor experiment,according to Box-behnken central composition design principle,the method of response surface analysis was adopted with the degree of hydrolysis as the response value. The effect of concentration of substrate,enzyme dosage,time and temperature on the degree of hydrolysis were studied in this paper. Fatigue model was established by swimming test. Effects ofArmillariamelleaVahl exFr Peptides on swimming time,liver glycogen,muscle glycogen,serum urea nitrogen,lactic acid,LDH were determined. The rusults showed that the optimum preparation conditions were obtained as follows:concentration of substrate 7.4%,enzyme dosage 2%,time 4.6 h and temperature 51 ℃,the degree of hydrolysis was 35.61%,which was close to the theoretical value. Take the middle dose group as an example,compared to the blank group,theArmillariamelleaVahl exFr Peptides increased content of liver glycogen and muscel glycogen 109.01% and 58.33%,reduced metabolic product of LA and BUN levels 36.99% and 30.33%,increased LDH activities 9%,their differences were significant(p<0.05). TheArmillariamelleaVahl exFr Peptides has the function of anti-fatigue obviously.

ArmillariamelleaVahl exFr;response surface methodology;anti-fatigue;peptide

2017-05-22

于歡(1984-),男,博士研究生,研究方向:生物活性物質(zhì),E-mail:yuhuanjlu@163.com。

*通訊作者:張慧鋒(1980-),女,博士,副教授,研究方向:生物活性物質(zhì),E-mail:76777303@qq.com。

吉林省教育廳“十三五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字[2015]第379號(hào));吉林醫(yī)藥學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(2016049)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0085-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.018