張植元，魏 東，喬秀亭，白東清，范 澤，李靜輝，安貿(mào)麟

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，天津 300384 )

飼料浮萍水平對大正三色錦鯉TYR及MC1R基因表達(dá)的影響

張植元，魏 東，喬秀亭，白東清，范 澤，李靜輝，安貿(mào)麟

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，天津 300384 )

為探究飼料中不同浮萍添加水平對大正三色錦鯉酪氨酸酶TYR以及黑素皮質(zhì)素受體MC1R基因表達(dá)的影響，配制浮萍添加水平分別為0%、3%、6%、9%、13%、14% 6種等蛋白(38.6%)飼料飼養(yǎng)大正三色錦鯉(42.19±1.32) g 8周，分別記為Diet 1(0/13)、Diet 2(3/10)、Diet 3(6/7)、Diet 4(9/4)、Diet 5(13/1)、Diet 6(14/0)。每種飼料設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)飼喂10尾魚。試驗結(jié)果表明：(1)TYR基因在大正三色錦鯉的心臟、肝臟、眼睛、黑色皮膚、腦中均有表達(dá)，并且在腦、皮膚、眼睛中表達(dá)量相對較高；(2)各組織中TYR mRNA表達(dá)量隨浮萍添加水平的升高均有一定波動，在皮膚與眼睛中，以Diet 6(14/0)組顯著高于其他各組(P<0.05)，在腦中，以Diet 3(6/7)組顯著高于除Diet 6的其他各組(P<0.05)；(3)皮膚與眼睛中MC1R mRNA表達(dá)量以Diet 6(14/0)組顯著高于其他各組(P<0.05)，而在腦中各組差異均不顯著(P>0.05)。綜上所述，在本試驗條件下，飼料不同浮萍添加水平促進(jìn)大正三色錦鯉TYR以及MC1R基因表達(dá)，有利于魚體黑色素沉積，因此選擇Diet 6(14/0)組飼料投喂大正三色錦鯉最適。

浮萍；大正三色錦鯉；TYR基因；MC1R基因；黑色素

錦鯉(Cyprinuscarpio)屬鯉形目、鯉亞目、鯉科、鯉屬。體形健壯，體長、體高、體厚三者適中[1]。現(xiàn)如今人工選育的品種已達(dá)到100多種，其經(jīng)濟(jì)價值相當(dāng)可觀[2-3]。白底三色是錦鯉的代表品種之一，體色為紅、白、黑三色，體色是在紅白標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，有少量黑斑，胸鰭有放射條狀黑紋，與紅白、黑底三色合稱“日本御三家”[4-5]。

在錦鯉中，除黑色素之外，其他體表色素都是靠體外攝入進(jìn)行合成的，而黑色素是一種廣泛存在于脊椎動物皮膚、眼睛、毛發(fā)中的生物多聚體，由細(xì)胞器黑色素小體合成[6]，其合成過程與酪氨酸酶(TYR)密切相關(guān)。酪氨酸酶是一種含銅的氧化還原酶，是大正三色錦鯉體表黑色素生成的關(guān)鍵酶與限速酶。而黑素皮質(zhì)素受體(MC1R)又是控制魚體黑色素的重要基因，與其他兩個配體α-促黑素細(xì)胞激素和促腎上腺皮質(zhì)激素共同經(jīng)過一系列反應(yīng)最終轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)腺苷酸，進(jìn)而激活酪氨酸酶合成黑色素[7-8]。因此，黑色素合成的速度與產(chǎn)量由酪氨酸酶在體內(nèi)的表達(dá)量及活性決定[9]。由此推斷，錦鯉日糧中酪氨酸水平可能會對體表黑色素合成有重要影響。

浮萍是一種分布廣泛的水生植物，具有生長速度快、營養(yǎng)成分好和蛋白含量高等優(yōu)點(diǎn)，且葉黃素和酪氨酸含量豐富，是極具潛力的新型飼料原料。浮萍的粗纖維和蛋白質(zhì)分別占其干質(zhì)量的5%～15%和35%～45%[10-12]。因此，本試驗在常用錦鯉飼料原料基礎(chǔ)上，設(shè)計不同浮萍水平替代菜粕，采用半定量PCR的方法，通過對TYR及MC1R mRNA表達(dá)量的影響，來評估飼料中不同浮萍水平對大正三色錦鯉體表黑色素的表達(dá)，從而得到最適的浮萍飼料配方。

1 材料與方法

1.1 試驗魚與飼養(yǎng)管理

大正三色錦鯉魚種購自天津市藍(lán)科水產(chǎn)有限公司，飼養(yǎng)試驗在天津市天津農(nóng)學(xué)院水族實驗室18個50 cm×45 cm×45 cm的觀賞魚魚缸中進(jìn)行。試驗魚馴化適應(yīng)環(huán)境7 d以后，選取體質(zhì)健壯、規(guī)格一致、無傷無病，初始體質(zhì)量為(42.19±1.32) g，隨機(jī)分為6組，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)10尾。養(yǎng)殖水源為曝氣后的自來水，水溫(29±1.1) ℃，pH為7.8±0.2，日投喂率為體質(zhì)量的3%，日投喂2次(9:00，15:30)，養(yǎng)殖試驗持續(xù)8周。

1.2 試驗飼料

首先室外采集鮮浮萍，清理曬干后進(jìn)入粉碎機(jī)粉碎，以魚粉、全蝦粉、豆粕和棉粕作為蛋白源，配制浮萍(干品)替代菜粕水平分別為0%、3%、6%、9%、13%、14% 6種等蛋白(38.6%)飼料，分別記為Diet 1(0/13)、Diet 2(3/10)、Diet 3(6/7)、Diet 4(9/4)、Diet 5(13/1)、Diet 6(14/0)，其組成與營養(yǎng)水平見表1。各飼料原料均通過粉碎機(jī)粉碎過60目網(wǎng)篩，混合均勻后，使用專業(yè)飼料制作機(jī)器制成直徑為1.00 mm的沉性顆粒飼料。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平 %

1.3 樣本采集

飼養(yǎng)結(jié)束后，禁食48 h，取每個重復(fù)中的3尾魚的肝胰臟、心臟、眼睛、黑色皮膚、腦在液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)入低溫冰箱中-80 ℃保存，待測TYR以及MC1R基因表達(dá)。

1.4 組織中TYR及MC1R mRNA 測定

1.4.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中現(xiàn)有的錦鯉及其相關(guān)魚類的TYR和MC1R基因保守序列設(shè)計引物，根據(jù)魚類β-actin保守序列，設(shè)計錦鯉 β-actin引物[13-14](表 2)。所有引物均由金唯智公司合成。

表2 試驗所用引物

1.4.2 總RNA的提取和cDNA的第一鏈合成

總RNA提取采用RNAiso Plus試劑，根據(jù)說明書進(jìn)行RNA抽提。使用微分光光度計檢測總RNA純度和定量OD260/280值。使用PrimeScriptTM1stStand cDNA Synthesis Kit(大連寶生物工程有限公司)將提取的組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以O(shè)ligo(dT)為引物，反應(yīng)條件為：50 ℃，45 min，70 ℃，15 min，合成的cDNA第一鏈保存于-20 ℃冰箱中。

1.4.3 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)每一樣品擴(kuò)增體系為25 μL，其中10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.5 μL，TaKaRa TaqE 0.5 μL，引物F 0.5 μL，引物R 0.5 μL，雙蒸水18.5 μL，cDNA模板1 μL。

TYR cDNA片段擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，36個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。MC1R cDNA片段擴(kuò)增反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。β-actinc DNA片段擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性45 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

1.5 組織中mRNA相對表達(dá)量的數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Gel-Pro analyzer軟件分析電泳圖像中各條帶的信號強(qiáng)度，用TYR及MC1R信號強(qiáng)度分別與相對應(yīng)β-actin信號強(qiáng)度的比值表示TYR mRNA及MC1R mRNA的相對表達(dá)量，并根據(jù)TYR/β-actin及MC1R/β-actin比值，對TYR mRNA及MC1R mRNA的相對表達(dá)量采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。試驗結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著時進(jìn)行鄧肯多重比較，顯著性標(biāo)準(zhǔn)P<0.05。數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 大正三色錦鯉各組織TYR基因差異表達(dá)

2.1.1 大正三色錦鯉總RNA的提取及檢測結(jié)果

本試驗提取的RNA經(jīng)過微分光光度計檢測總RNA純度，其定量OD260/280值為1.8～2.0。再將提取的總RNA樣品，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示RNA無明顯的降解，條帶較完整，即作為反轉(zhuǎn)錄的模板，進(jìn)行cDNA的第一鏈合成。心臟、肝臟、皮膚、眼睛、腦中的RNA樣本電泳結(jié)果見圖1。

圖1 大正三色錦鯉總RNA的瓊脂糖凝膠電泳由左至右依次為：心臟、肝臟、皮膚、眼睛、腦.

2.1.2 大正三色錦鯉TYR和β-actin在不同組織中的表達(dá)

半定量RT-PCR結(jié)果顯示，TYR基因在大正三色錦鯉的心臟、肝臟、眼睛、黑色皮膚、腦中均有表達(dá)(圖2)并且在眼睛、皮膚、腦中表達(dá)量最高，因此選擇這3個組織為代表做后續(xù)試驗。

圖2 TYR及β-actin基因在大正三色錦鯉各組織中的表達(dá)電泳h：心臟、l：肝臟、s：皮膚、e：眼睛、b：腦.

2.2 飼料浮萍添加水平對大正三色錦鯉TYR及MC1R mRNA基因表達(dá)的影響

2.2.1 飼料不同浮萍添加水平對大正三色錦鯉TYR mRNA表達(dá)的影響

投喂6種不同浮萍添加水平飼料后，各組織中TYR mRNA表達(dá)豐度的平均值有一定的波動。在皮膚中Diet 5(13/1)組與Diet 6(14/0)組差異不顯著(P>0.05)，但均顯著大于其他各組(P<0.05)；

在眼睛中，Diet 6(14/0)組表達(dá)豐度顯著高于其他各組(P<0.05)，而Diet 5(13/1)組與Diet 2(3/10)組差異不顯著(P>0.05)，并且顯著最低(P<0.05)；而在腦組織中，從Diet 1(0/13)到Diet 6(14/0)組表達(dá)豐度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，Diet 4(9/4)與Diet 5(13/1)、Diet 6(14/0)組差異不顯著(P>0.05)，Diet 3(6/7)組表達(dá)豐度顯著最高(P<0.05)(圖3、圖4、表3)。

圖3 TYR基因在大正三色錦鯉各組織中的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

飼料號(浮萍/菜粕)皮膚眼睛腦Diet1(0/13)0．29±0．11b0．24±0．16ab0．16±0．06bDiet2(3/10)0．31±0．14b0．13±0．02b0．15±0．03bDiet3(6/7)0．50±0．20ab0．36±0．16ab0．43±0．22aDiet4(9/4)0．24±0．17b0．27±0．19ab0．28±0．12abDiet5(13/1)0．60±0．20a0．16±0．06b0．25±0．16abDiet6(14/0)0．72±0．22a0．43±0．28a0．27±0．16ab

注：表中同一列數(shù)據(jù)右上角標(biāo)有相同字母的表示差異不顯著(P>0.05)；標(biāo)有不同字母表示差異顯著(P<0. 05)，下表同.

2.2.2 飼料不同浮萍添加水平對大正三色錦鯉MC1R mRNA表達(dá)的影響

投喂6種不同浮萍添加水平飼料后，各組織中MC1R mRNA表達(dá)豐度的平均值有一定的波動。在皮膚中表達(dá)豐度呈先降后升的趨勢，且Diet 5(13/1)與Diet 6(14/0)組均顯著高于其他各組(P<0.05)，其他各組差異不顯著(P>0.05)；在眼睛中，Diet 1(0/13)組表達(dá)豐度顯著最低(P<0.05)，而Diet 6(14/0)組顯著高于其他各組(P<0.05)，Diet 2(3/10)與Diet 3(6/7)、Diet 4(9/4)組差異不顯著(P>0.05)；在腦中表達(dá)豐度呈緩慢上升趨勢，但各組表達(dá)豐度均不顯著(P>0.05)(圖5、圖6、表4)。

圖4 TYR及β-actin基因在大正三色錦鯉皮膚、眼睛、腦中的表達(dá)電泳

飼料號(浮萍/菜粕)皮膚眼睛腦Diet1(0/13)0．11±0．03bc0．08±0．01c0．12±0．04aDiet2(3/10)0．12±0．02bc0．13±0．08abc0．12±0．07aDiet3(6/7)0．11±0．00bc0．16±0．04ab0．12±0．06aDiet4(9/4)0．06±0．01c0．15±0．02ab0．15±0．07aDiet5(13/1)0．16±0．02ab0．12±0．01bc0．16±0．02aDiet6(14/0)0．20±0．07a0．18±0．04a0．16±0．02a

圖6 MC1R及β-actin基因在大正三色錦鯉皮膚、眼睛、腦中的表達(dá)電泳

3 討 論

3.1 大正三色錦鯉各組織TYR基因差異表達(dá)

脊椎動物的色素細(xì)胞主要起源于兩種：一是神經(jīng)外胚層，例如視網(wǎng)膜外層的色素上皮層，布滿許多黑色素細(xì)胞[15]；二是神經(jīng)脊，比如動物真皮層中的各組色素細(xì)胞[6]。本試驗與王巍等[13]得出結(jié)果一樣，TYR基因均在眼睛、皮膚、腦中表達(dá)量高。由于視網(wǎng)膜上皮層中有很多視覺功能所必需的黑色素細(xì)胞[16]，因此TYR基因在眼睛中的表達(dá)量很高，這一結(jié)果與甌江彩鯉[17]、斑馬魚[18](Daniorerio)一致。大正三色錦鯉的黑色皮膚主要由黑色素的數(shù)量、種類和分布決定[19]，而魚類表皮黑色素的沉淀是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程，涉及到一系列的遺傳變異、細(xì)胞合成以及生理因素[20]。魚類皮膚中黑色素細(xì)胞普遍是存在于真皮層的皮下層中，但也有研究發(fā)現(xiàn)，表皮中黑色素小體通過聚散與胞質(zhì)擴(kuò)散到表皮中[21]。因此，本試驗中大正三色錦鯉的皮膚TYR mRNA表達(dá)量很高，與王巍等研究結(jié)果一致[13,18]。黑色素是由神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育產(chǎn)生的物質(zhì)，而腦部是神經(jīng)中樞，因此TYR mRNA在腦中的表達(dá)量也較高，而且據(jù)有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在腦組織深處有黑色素存在[22]。在心臟與肝臟中TYR mRNA也有少量表達(dá)，但不顯著。在金魚、甌江彩鯉的心臟中均發(fā)現(xiàn)了TYR基因的表達(dá)，而在斑馬魚與甌江彩鯉的肝臟中沒有發(fā)現(xiàn)表達(dá)[17-18]，這有可能與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和黑色素巨噬細(xì)胞的吞噬能力有關(guān)[23]。

3.2 飼料不同浮萍添加水平對大正三色錦鯉TYR mRNA表達(dá)的影響

酪氨酸是一種芳香族氨基酸，也是20種用來合成蛋白質(zhì)的蛋白氨基酸之一，屬于非必需氨基酸。酪氨酸也是酪氨酸酶單酚酶功能的催化產(chǎn)物，是最終合成黑色素的主要必需物。由于浮萍中酪氨酸含量豐富，本試驗以飼料蛋白為基準(zhǔn)，用浮萍替代菜粕，從而使飼料中酪氨酸含量呈線性增長。最終TYR mRNA表達(dá)結(jié)果顯示，隨著浮萍替代量的增加，大正三色錦鯉眼睛、皮膚、腦中的TYR基因表達(dá)量均在上升。根據(jù)相關(guān)研究報道，日糧氨基酸水平對絲毛烏骨雞黑色素相關(guān)基因表達(dá)顯示，隨著氨基酸添加量的提高，皮膚的TYR基因表達(dá)量先升高后降低[24]，與本試驗結(jié)果不太一致，可能是由于試驗對象不同所造成的差異，但是都起到了升高的作用。馬蘭春等[25]提出，酪醇是紅景天甙糖基化反應(yīng)的甙元底物分子，是酪氨酸經(jīng)過高溫或者腐敗后形成酪醇，是一種生物堿代謝途徑。而張迪敏等[26]通過研究女貞子單體酪醇對培養(yǎng)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響表明，酪醇雖然不刺激黑素細(xì)胞增殖，但能提高酪氨酸酶活性、加速黑素合成，并能上調(diào)黑素細(xì)胞酪氨酸酶和TYRP1 mRNA表達(dá)，從而使黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性增強(qiáng)，黑素合成增加。

3.3 飼料不同浮萍添加水平對大正三色錦鯉MC1R mRNA表達(dá)的影響

MC1R基因?qū)野彼崦傅鞍字蠺YR、TYRP1、TYRP2的3個酶活性的表達(dá)水平均有影響，是一個調(diào)控黑色素合成的重要基因[27]。本試驗結(jié)果表明，在大正三色錦鯉的皮膚與眼睛中，MC1R mRNA的表達(dá)量隨著飼料浮萍水平提高在增加，并且Diet 6(14/0)顯著最高(P<0.05)，而在腦中，MC1R mRNA的表達(dá)差異均不顯著(P>0.05)。大正三色錦鯉眼睛與皮膚中MC1R mRNA的表達(dá)結(jié)果與TYR mRNA的表達(dá)結(jié)果相對一致，說明飼料中浮萍添加量的提高可能會促進(jìn)體酪氨酸酶活性，最終提高皮膚與眼睛中的黑色素表達(dá)。而腦中MC1R mRNA的表達(dá)均沒有差異，與腦中TYR mRNA的表達(dá)結(jié)果不一致，可能是當(dāng)α-促黑素細(xì)胞激素和促腎上腺皮質(zhì)激素與黑色素細(xì)胞膜上的黑素皮質(zhì)素受體結(jié)合后，激活酪氨酸激酶大量產(chǎn)生，導(dǎo)致色素細(xì)胞產(chǎn)生的是真黑色素[28]，而腦中幾乎沒有色素細(xì)胞或者黑色素存在，因此在腦中MC1R沒有顯著變化。

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EffectsofDietaryDuckweedLevelsonExpressionofTyrosinaseGeneandMelaninCortisolReceptorsGeneinKoiTajsho-sanke

ZHANG Zhiyuan, WEI Dong, QIAO Xiuting, BAI Dongqing, FAN Ze, LI Jinghui, AN Maolin

( Department of Fishery Science, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China )

The present study was conducted to investigate the effect of dietary duckweed levels on the expression of tyrosinase (TYR) gene and melanin cortisol receptors gene (MC1R) in koi Tajsho-sanke (Cyprinuscarpio). Six isonitrogenous diets (38.6%) formulated ocontained 0%,3%,6%,9%,13%,and 14% duckweed replacing rapeseed meal[referred to as Diet 1(0/13), Diet 2(3/10), Diet 3(6/7), Diet 4(9/4), Diet 5(13/1)and Diet 6(14/0)]. A total of 180 fish with body weight of (42.19±1.32) g were randomly divided into five groups with three replicates and fed twice a day (09:00 and 15:30) for 8 weeks. The results showed that TYR mRNA was detected in heart, hepatopancreas, eye, black skin and brain tissue of Tajsho-sanke, with higher TYR expression in the brain, black skin and eye. With the increase in duckweed level, the expression quantity of tyrgene showed some fluctuation. There were significantly higher expression of tyrgene in eye and black skin in Diet 6(14/0) than in the other groups (P<0.05), while the expression quantities were significantly higher in brain in Diet 3(6/7)compared with other groups (P<0.05). The expression quantities of MC1R in eye and black skin of the fish in Diet 6(14/0) were significantly higher than those in other goups (P<0.05). There was no significant difference in MC1R expression in brain among all groups (P>0.05). The findings indicate that 14% duckweed level can promote TYR and MC1R expression and improve melanin deposition.

duckweed; koi Tajsho-sanke; TYR gene; MC1R gene; melanin pigment

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.009

2016-04-28；

2016-06-29.

天津市科技重大專項與工程計劃項目(15ZXBFNC00340).

張植元(1992-)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料.E-mail:382402187@qq.com.通訊作者： 魏東(1970-)，男，副教授，碩士生導(dǎo)師；研究方向：觀賞魚養(yǎng)殖.E-mail：wd0528@126.com.

S965.116

A

1003-1111(2017)02-0172-06