崔惠敬，孟玉霞，馮文倩，趙前程，馬永生

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023 )

養(yǎng)殖大菱鲆腸道中大菱鲆弧菌的分離鑒定及藥敏試驗

崔惠敬，孟玉霞，馮文倩，趙前程，馬永生

( 大連海洋大學 食品科學與工程學院，遼寧 大連 116023 )

2014年11月，大連地區(qū)某大菱鲆養(yǎng)殖場發(fā)生病害并伴有死亡，主要癥狀為吻部下頜明顯出血，腹腔積水，肝臟充血，腸道出血有白便。從患病大菱鲆腸道中分離出1株可在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的菌株HZ-C1，人工回接感染試驗證明其對健康大菱鲆具有較強致病性。通過形態(tài)學觀察、16S rDNA序列同源性分析及生理生化試驗確定菌株HZ-C1為大菱鲆弧菌。藥敏檢測結果顯示，大菱鲆弧菌HZ-C1對氯霉素、丁胺卡那及頭孢曲松等11種抗生素敏感，但對青霉素、四環(huán)素及諾氟沙星等15種抗生素耐藥。本研究為大連地區(qū)養(yǎng)殖大菱鲆細菌性病害防治提供了一定病原學依據(jù)。

大菱鲆；大菱鲆弧菌；分離鑒定；藥敏試驗

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)俗稱“多寶魚”，自1992年由英國引入后，大菱鲆的養(yǎng)殖規(guī)模和產量逐年擴大，目前已成為我國海水養(yǎng)殖魚類產量最大的品種。2010年我國大菱鲆養(yǎng)殖產量達到6.0×104t，占世界養(yǎng)殖總量的87.1%，已成為世界大菱鲆養(yǎng)殖第一大國[1]。但隨著高密度工廠化養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，病害問題日趨嚴重，嚴重制約了大菱鲆養(yǎng)殖產業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。細菌性疾病是大菱鲆養(yǎng)殖中危害最為嚴重的一種疾病，目前我國養(yǎng)殖大菱鲆已報道的致病菌有遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[2]，魚腸道弧菌(Vibrioichthyoenteri)[3]、鰻弧菌(V.anguillarum)[4]、溶藻弧菌(V.alginolyticus)[5]等。

2014年11月，大連地區(qū)某大菱鲆養(yǎng)殖場發(fā)生病害并有大量死亡，主要癥狀表現(xiàn)為吻部下頜明顯出血，魚體解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔積水，肝臟充血發(fā)紅，腸道出血有白便。筆者從患病大菱鲆腸道中分離出1株優(yōu)勢細菌，經人工回接感染試驗證明其對大菱鲆存在較強致病性，并通過形態(tài)學觀察、生理生化試驗、16S rDNA序列分析進行鑒定，同時對此菌進行藥敏檢測。本研究旨在為養(yǎng)殖大菱鲆細菌性疾病防治提供病原學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大菱鲆病魚樣本2014年11月取自遼寧省大連市某養(yǎng)殖場，體質量600～800 g。細菌基因組提取、擴增儀均購自大連寶生物工程有限公司；PCR試劑購自上海生工生物工程股份有限公司；細菌微量生化鑒定管、藥敏紙片等均購自杭州微生物試劑有限公司；透射電鏡JEM-1200EX為日本電子株式會社生產；Leica DMI3000B倒置熒光顯微鏡為Leica微系統(tǒng)股份有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 病魚解剖與致病菌分離

將患病大菱鲆體表用無菌水沖洗3遍后，置超凈臺已用乙醇消毒的托盤中，無菌條件下解剖魚體，分離病變腸道、肝臟及腹水。取適量樣本，分別置于1.5 mL離心管中，加入滅菌生理鹽水均質后，用滅菌棉簽沾取均勻涂布在2216E固體培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，挑取典型單菌落，重懸于200 μL滅菌生理鹽水，接種純化3次。

1.2.2 患病大菱鲆腸道組織切片觀察

取患病大菱鲆腸道和肝臟組織，用10%福爾馬林溶液進行固定，再經過乙醇脫水、石蠟包埋、切片、烘干、蘇木精—伊紅染色及封片，然后在光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 細菌鑒定

形態(tài)學觀察：將純化后的細菌用銅網撈取后晾干，再用2.5%(m/V)磷鎢酸負染約3 min，通風櫥中晾干后，置于透射電鏡下觀察菌體形態(tài)。另將細菌進行革蘭氏染色后，置光學顯微鏡下觀察。

生理生化試驗：無菌操作挑取適量菌加入生理鹽水中，再加入微量發(fā)酵管中，于25 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，觀察生理生化反應。

16S rDNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建：用滅菌牙簽挑1個單菌落置入100 μL滅菌超純水中，輕微振蕩，100 ℃水浴鍋中水浴10 min，7200 r/min離心3 min，取上清液作為DNA模板；PCR擴增采用16S rDNA通用引物，正向引物27 F：5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物1492 R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，預期擴增片段大小約1450 bp。

PCR反應體系50 μL：DNA模板2 μL，正向、反向引物各1 μL，EX Taq DNA聚合酶 25 μL，無菌超純水21 μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；降溫至4 ℃。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果，并將PCR產物送上海生工生物工程股份有限公司測序。將測得的16S rDNA序列通過Blast檢索和ClustalX 1.8軟件進行序列比對分析，根據(jù)鄰位相連法利用Mega 6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，自舉分析檢測置信度，自舉數(shù)集為1000次。

1.2.4 大菱鲆回接感染試驗

將分離得到的菌株HZ-C1接種于2216E液體培養(yǎng)基中，于25 ℃，180 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將菌液于4 ℃，7200 r/min離心10 min，棄上清液，加入同體積無菌生理鹽水洗滌兩遍，再用無菌生理鹽水重懸，并將菌液稀釋至設定密度備用。平均體質量約50 g/尾的健康大菱鲆購自大連天正實業(yè)有限公司，暫養(yǎng)7 d后進行試驗；養(yǎng)殖過程中水溫控制在(18±2) ℃，投喂2次/d，換水1次/d。試驗時將大菱鲆隨機分為3組，每組10尾；試驗組大菱鲆每尾分別腹腔注射100 μL密度為5×107、2×108cfu/mL的菌液，對照組每尾注射100 μL無菌生理鹽水。連續(xù)20 d記錄發(fā)病及死亡情況，并對發(fā)病死亡的大菱鲆進行細菌再分離鑒定。

1.2.5 藥敏試驗

采用常規(guī)Kriby-Bauer紙片擴散法進行藥敏試驗，選用30種抗生素對分離菌株進行藥敏試驗，將HZ-C1菌懸液涂布于2216E平板上，用鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，測量各種藥物的抑菌圈直徑，試驗重復3次，計算平均值，以判定菌株對抗生素的敏感性。

2 結果與分析

2.1 患病大菱鲆癥狀及組織病理切片觀察

患病大菱鲆主要臨床癥狀表現(xiàn)為吻部下頜明顯出血，腹腔積水，肝臟充血發(fā)紅，腸內無食物，腸壁有血絲，直腸段有白便(圖1)。

自然發(fā)病大菱鲆組織病理切片見圖2。由圖2可見，病魚肝細胞胞質中充盈脂滴，空泡變性，胞間界限模糊，排列雜亂，且有出血。腸道組織病理切片結果顯示大菱鲆腸壁細胞壞死，細胞間質崩解，腸黏膜嚴重潰爛，腸絨毛脫落。

2.2 病原菌的分離鑒定

2.2.1 形態(tài)學觀察

自患病大菱鲆腸道中分離獲得1株優(yōu)勢菌株HZ-C1，將該菌涂于2216E固體培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形、透明、光滑濕潤、突起而且邊緣整齊；透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該菌呈短桿狀，細胞大小約為0.5 μm×1.1 μm，具單極生鞭毛(圖3)，符合弧菌的典型特征。

圖1 患病大菱鲆的臨床癥狀箭頭顯示吻部下頜明顯充血

圖2 患病及健康大菱鲆肝臟(a，b)及腸道(c，d)組織切片a、c為患病大菱鲆組織，b、d為健康大菱鲆組織.

圖3 分離菌株HZ-C1的透射電鏡照片

2.2.2 生理生化特征檢測結果

對所得菌株進行生理生化檢測(表1)，結果顯示菌株HZ-C1能在硫代硫酸鹽—檸檬酸鹽—膽鹽—蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上形成淺黃色菌落，革蘭氏陰性，可運動，能在含1%～3%NaCl蛋白胨水中生長，氧化酶、葡萄糖、甲基紅試驗、精氨酸雙水解酶等呈陽性，枸櫞酸鹽、尿素酶、產H2S、乙酰甲基甲醇試驗等為陰性，鑒定結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[6]中大菱鲆弧菌(V.scophthalmi)的生化特征一致。

表1 菌株HZ-C1的生理生化試驗結果

注：“+”表示陽性，“-”表示陰性，“+g-”表示產酸不產氣，“S”表示敏感性.

2.2.3 菌株16S rDNA基因擴增、測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以細菌基因組DNA為模板，PCR擴增菌株HZ-C1的16S rDNA序列，電泳檢測結果顯示在約1500 bp處有明顯目的條帶(圖4)；測序結果表明，目的片段大小為1450 bp。將16S rDNA序列通過BLAST檢索系統(tǒng)進行序列比對分析，結果表明，HZ-C1與大菱鲆弧菌 AFWE01000105.1序列同源性為99%；并選擇10個弧菌模式菌株16S rDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HZ-C1與大菱鲆弧菌AFWE01000105.1聚為一個分支(圖5)，結合菌株HZ-C1的生理生化特征，鑒定菌株HZ-C1為大菱鲆弧菌。

圖4 菌株HZ-C1的16S rDNA的PCR擴增結果

2.3 大菱鲆回接感染試驗結果

健康大菱鲆經腹腔注射大菱鲆弧菌HZ-C1菌液后，均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，攻毒感染1 d后大菱鲆攝食明顯減少；感染5 d后，部分魚停止攝食，反應遲緩，游動無力；感染后第7 d，較高密度攻毒組(2×108cfu/mL)的部分大菱鲆出現(xiàn)游動失衡，魚體翻轉，腹部朝上，并開始死亡，試驗周期內死亡率達40%(表2)。感染死亡的大菱鲆吻部及魚鰭有出血癥狀，剖檢后發(fā)現(xiàn)腹部積水，肝臟充血，腸內無食物，有充血癥狀。從攻毒感染的病魚腹腔及腸道中再次分離得到純培養(yǎng)物，并通過16S rDNA序列分析鑒定為大菱鲆弧菌，與回感菌株一致。對照組大菱鲆在試驗周期內正常攝食生長，無發(fā)病癥狀。

2.4 藥敏試驗結果

選用30種抗生素對大菱鲆弧菌HZ-C1菌株進行藥敏試驗，結果顯示大菱鲆弧菌HZ-C1對氯霉素、丁胺卡那、頭孢曲松等11種抗生素敏感；對頭孢氨芐、卡那霉素、新霉素等4種抗生素中度敏感(表3)；但對青霉素、四環(huán)素、諾氟沙星等15種抗生素耐藥，可見該菌對抗生素耐藥情況已比較嚴重。

圖5 基于分離菌株HZ-C1的16S rDNA序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

分組菌液密度cfu/mL感染后死亡數(shù)量1d5d7d10d11d12d14d16d18d20d死亡率%感染組5×1070000010000102×108001110000140對照組生理鹽水00000000000

表3 大菱鲆弧菌HZ-C1菌株的藥敏試驗結果

注：S高度敏感，I中度敏感，R耐藥.

3 討 論

大菱鲆為我國北方沿海海水養(yǎng)殖魚類產量最大的品種，但高密度工廠化養(yǎng)殖導致大菱鲆細菌性病害日益頻發(fā)，其中弧菌病是危害最嚴重的病害之一，已報道的致病性弧菌包括副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)[7]、鰻弧菌[4,8]、溶藻弧菌[5]和哈維弧菌(V.harveyi)[9-10]等。大菱鲆弧菌最早由西班牙學者自養(yǎng)殖大菱鲆仔魚腸道中分離并鑒定為弧菌屬細菌的一個新種[11]，該菌表型與魚腸道弧菌很相近，后者是導致褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)稚魚腸道壞死的主要病原[12]。基因水平上，大菱鲆弧菌與魚腸道弧菌16S rDNA序列相似度達99%[13]。理化指標上二者也很接近，僅有3項指標上存在差異[14]，大菱鲆弧菌的精氨酸雙水解酶呈陽性，能在35 ℃條件下生長，但不能在6% NaCl高鹽蛋白胨水中生長[11]，而魚腸道弧菌在這3項理化指標上正好與之相反[15]，本研究分離得到的菌株理化指標與大菱鲆弧菌相符，結合16S rDNA序列分析結果，可以確定該菌為大菱鲆弧菌。

早期研究認為大菱鲆弧菌是定殖在健康大菱鲆腸道中的優(yōu)勢菌群[16]，且對大菱鲆具有宿主特異性。不過后續(xù)也有自患病褐牙鲆[17]、大西洋牙鲆(P.dentatus)[18]、細點牙鯛(Dentexdentex)[19]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[20]和死亡的藍鰭金槍魚(Thunnusmaccoyii)腎臟中[21]分離出該菌，特別是在患病褐牙鲆體內具有較高分離率。Kang[22]研究了韓國濟州地區(qū)患病褐牙鲆細菌性病原的多樣性，結果顯示大菱鲆弧菌占26%，僅次于哈維弧菌(32%)。Jo等[23]自患弧菌病的褐牙鲆中分離出大菱鲆弧菌、哈維弧菌、鰻弧菌、溶藻弧菌等，其中大菱鲆弧菌占所分離菌株的60.1%。國內有學者也曾從山東半島養(yǎng)殖場患腹水和白便癥狀的大菱鲆體內分離出溶藻弧菌、鯊魚弧菌(V.carchariae)和大菱鲆弧菌，但未對大菱鲆弧菌的致病性進行深入研究[24]。

目前研究表明，大菱鲆弧菌是一種條件致病菌[17]，養(yǎng)殖魚類在受到環(huán)境脅迫時，易被感染并引發(fā)疾病或死亡，這里的脅迫因子包括水溫、其他致病菌入侵等。如鰻鱺(Anguillajaponica)在養(yǎng)殖水溫升至20 ℃時易被大菱鲆弧菌感染，并出現(xiàn)嚴重腸炎及腹水癥狀，死亡率很高[25]。Qiao等[17]研究顯示，褐牙鲆在受到副乳房鏈球菌(Streptococcusparauberis)入侵后，易被大菱鲆弧菌二次感染，累積死亡率由25%升至85%。

一般致病性弧菌的胞外產物是其關鍵毒力因子之一[26]，主要包括蛋白酶類和外毒素。大菱鲆弧菌胞外產物顯示出多種蛋白酶活性，如堿性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和N-乙酰-β-葡萄糖苷酶[27]，但無溶血活性和細胞毒性作用。這些胞外產物與黏附因子、脂多糖以及某些外膜蛋白等共同構成了大菱鲆弧菌的致病力。根據(jù)毒力大小，大菱鲆弧菌臨床分離株可分為高毒株和低毒株，將該菌對褐牙鲆進行腹腔注射，高毒株半致死劑量約為4.8×106cfu/g，低毒株半致死劑量約為9.7×108cfu/g，可見菌株之間毒性存在較大差異[27]。褐牙鲆腹腔注射攻毒后臨床癥狀表現(xiàn)為皮膚變黑，腹部積水，腸、肝臟、肌肉出血，脾腎腫大等[17]，這與本研究中大菱鲆攻毒后的癥狀相似。

藥敏試驗顯示，本研究分離出大菱鲆弧菌對11種抗生素敏感性較高，其中包括氯霉素、丁胺卡那、頭孢曲松等，但對青霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、氧氟沙星等存在耐藥性。目前我國水產用獸藥中抗生素類藥物有22種，結合藥敏結果可知，可考慮使用氟苯尼考防治大菱鲆弧菌感染。此外，研究發(fā)現(xiàn)大菱鲆弧菌臨床分離株均能產生生物被膜[26]，這可能也與其耐藥性有關。值得注意的是本研究分離的菌株對受試的喹諾酮類抗生素均存在耐藥情況，這可能與這類抗生素在水產養(yǎng)殖中大量使用相關。2015年農業(yè)部2292號公告決定停止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星和諾氟沙星4種喹諾酮類抗生素[28]，這也給水產動物病害防控帶來挑戰(zhàn)，目前迫切需要研發(fā)新型抗生素替代品來防治水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病。

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IdentificationandAntimicrobialSusceptibilityTestofVibrioscophthalmiIsolatedfromtheIntestineofCulturedTurbotScophthalmusmaximus

CUI Huijing, MENG Yuxia, FENG Wenqian, ZHAO Qiancheng, MA Yongsheng

( College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China )

In November 2014, a disease occurred among cultured turbotScophthalmusmaximus, and resulted in mass mortality in a turbot farm in Dalian, China. The suffered fish showed syndrome such as hemorrhage of the lower jaw,hydrobdomen,liver congestion and intestinal hemorrhage with white feces. One strain of bacteria was isolated from intestine of the diseased turbot.The bacterium grew on TCBS agar and named as HZ-C1 strain. It was verified that HZ-C1 had a strong pathogenicity to healthy turbot through an artificial infection test. It was identified asVibrioscophthalmiby morphological characteristics, physiological and biochemical test, and the sequence similarity analysis of the 16S rDNA gene. Antimicrobial susceptibility test revealed that HZ-C1 was sensitive to 11 antibiotics including chloramphenicol,amikacin, and ceftriaxone, but resistant to thepenicillin, tetracycline, norfloxacin and other 15 kinds of antibiotics.The findings will provide an etiological evidence for control of bacterial disease in cultured turbotin in Dalian.

Scophthalmusmaximus;Vibrioscophthalmi; isolation and identification; antimicrobial susceptibility test

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.001

2016-03-24；

2016-06-07.

遼寧省博士啟動基金資助項目(20131010).

崔惠敬(1991-)，女，碩士研究生；研究方向：海水動物養(yǎng)殖及病害防治. E-mail：tsuihj@163.com. 通訊作者： 馬永生(1982-)，男，副教授，博士；研究方向：海水健康養(yǎng)殖與海產品質量安全與控制. E-mail：mayo@dlou.edu.cn.

S917.1

A

1003-1111(2017)02-0125-07