傅麗容，張瑞紅，龔聲輝，張海會，史海濤

( 海南師范大學 生命科學學院，海南 海口 571158 )

不育劑膦氧氮丙啶對雄性紅耳龜生殖功能的影響

傅麗容，張瑞紅，龔聲輝，張海會，史海濤

( 海南師范大學 生命科學學院，海南 ?？?571158 )

給160只健康成年雄性紅耳龜分別腹腔注射0.1、3 g/L和10 g/L的膦氧氮丙啶染毒15 d，每隔2 d注射1次，每次注射2 mL，對照組注射等劑量0.65% 生理鹽水，于第16 d和第30 d取樣檢測血清、睪丸中性激素及相關蛋白含量，恢復期(第30 d和137 d)顯微觀察了睪丸的組織結構。試驗結果表明，高質量濃度膦氧氮丙啶組紅耳龜死亡；低、中質量濃度組血清及睪丸性激素含量與對照組無顯著差異(P>0.05)，表明膦氧氮丙啶對丘腦—垂體—性腺軸沒有干擾作用。在試驗第30 d，中質量濃度組睪丸及血清抑制素B含量顯著低于對照組，支持細胞受損；恢復期，處理組睪丸有不同程度損傷，低質量濃度組紅耳龜睪丸微中毒，生精細胞間隙增大，中質量濃度組生精細胞破壞、溶解，沒有再生現(xiàn)象，表現(xiàn)不可逆?zhèn)?。膦氧氮丙啶主要通過損傷紅耳龜睪丸各級生精細胞和支持細胞，破壞睪丸生精環(huán)境，導致雄性不育。

膦氧氮丙啶；雄性紅耳龜；性激素；組織結構

紅耳龜 (Trachemysscriptaelegans)(又稱巴西龜)產自于美國中部，已成功入侵包括美國原產地以外的美洲、歐洲、亞洲、非洲、大洋洲等世界各地[1]，被列為世界最危險的100個入侵物種之一[2]。紅耳龜性成熟早、繁殖力強、生長速度快和食性雜，廣受養(yǎng)殖戶青睞。據(jù)調查，我國紅耳龜?shù)哪戤a量已超過5000萬只[3]。因養(yǎng)殖逃逸、宗教放生、寵物丟棄等行為，已在我國22個省市的104個地點發(fā)現(xiàn)有野外分布，覆蓋面積約達3000 hm2[4-5]。紅耳龜與我國14種龜?shù)纳姝h(huán)境相同[5]，已在我國野外成功繁殖[6-7]，嚴重影響我國自然生態(tài)系統(tǒng)。因此，有效遏制紅耳龜在我國野外環(huán)境的蔓延，顯得尤為重要。

目前國內外非常重視紅耳龜?shù)姆乐喂ぷ?，但行之有效的方法尚未見報道[8]。

不育防治技術在鼠害和蟲害等取得較大成效，本試驗試將不育防治技術應用于外來種紅耳龜。

不育控制是指通過某種手段或方法使雄性或雌性個體絕育，甚至阻斷幼體的發(fā)育，降低種群出生率，控制種群的數(shù)量和密度[9-10]，其本質是控制生育率。不育防治的優(yōu)點在于不育個體除了不能繼續(xù)生殖外，還會繼續(xù)獲取食物、消耗資源、占領巢穴、占有配偶，保持了緊張的社群壓力，限制種群的恢復和發(fā)展。不育個體通常會保持正常的性活動和性行為，能對正常個體造成一定的競爭性繁殖。

目前不育劑種類較多，尤其以雄性不育劑種類居多且效果明顯。研究表明，有機磷的氮丙啶化合物的不育效果最突出[11]。劉巍[12]發(fā)現(xiàn)，膦氧氮丙啶直接作用于小鼠的睪丸生殖細胞，引起生精功能障礙，產生不可逆的不育。龔聲輝等[13]將膦氧氮丙啶用于雄性紅耳龜，可產生生殖毒性，使睪丸萎縮，生精細胞退化，精子產生受阻，產生明顯的不育效應。在此基礎上，本試驗研究了不同時期紅耳龜?shù)纳扯拘?，闡明膦氧氮丙啶對雄性紅耳龜?shù)牟挥饔脵C制及有效性，為遏制紅耳龜在野外環(huán)境的蔓延提供新的線索和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用160只體質量(738.9±101.2) g的健康成體雄性紅耳龜，購自?？谑续櫷a養(yǎng)殖有限公司。

膦氧氮丙啶(MAPO)購自廣州市齊云生物技術有限公司(生產批號SY 201309)。

投喂的飼料為文昌瓊文歌頌飼料廠生產的浮性甲魚配合飼料，含白魚粉60%、膨化大豆3%、α-淀粉24%、啤酒酵母2%、無機鹽1%等基本營養(yǎng)成分，不含不育劑成分和其他相似藥物；0.9%氯化鈉注射液(250 mL加無菌雙蒸水配制為0.65%龜類生理鹽水)。

睪酮(T)ELISA試劑盒、雌激素(E)ELISA試劑盒、雄激素結合蛋白(ABP)ELISA試劑盒、卵泡刺激素(FSH)ELISA試劑盒、黃體生成素(LH)ELISA試劑盒、催乳素(PRL)ELISA試劑盒和抑制素B(Inh B)均購自北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司。

1.2 方法

試驗龜先混養(yǎng)于160 cm×105 cm×65 cm的白色塑料水缸內，隨機分為4組，每組40只，檢驗各組間個體體質量均一且方差齊性。根據(jù)生殖毒理學劑量設置原則，依次設置膦氧氮丙啶溶液質量濃度為0 g/L(對照組)、0.1 g/L、3 g/L、10 g/L，采用腹腔注射，1次/2 d，每次注射2 mL，對照組則注射等劑量0.65%生理鹽水，處理15 d，試驗周期137 d，第1～15 d為染毒期，第30～137 d為恢復檢測期。

1.3 檢測指標和方法

1.3.1 血清性激素檢測

膦氧氮丙啶染毒處理15 d結束，于第16 d和第30 d每組隨機取6只，置于-20 ℃條件下冷凍麻痹60～80 min，心臟取血10 mL，在4 ℃ 3500 r/min下離心10 min后，取上層血清，分裝至2 mL離心管，置于-80 ℃環(huán)境下保存，待用相應ELISA試劑盒檢測血清性激素及相關蛋白含量。

1.3.2 睪丸勻漿液制備及性激素檢測

采血完畢，解剖龜體摘除左側睪丸，剔除脂肪，用4 ℃預冷0.65%生理鹽水沖洗睪丸表面，吸附表面水分，于-20 ℃下保存。按照磷酸緩沖鹽溶液∶組織=9∶1的比例研磨睪丸組織，勻漿液在4 ℃、3500 r/min條件離心10 min，將上清液進行分裝，置于-80 ℃環(huán)境下保存，待用相應ELISA試劑盒檢測睪酮及相關激素含量。

1.3.3 睪丸臟器系數(shù)及體積

于第30 d和137 d取樣6只，稱量質量，-20 ℃冷凍麻痹60～80 min后，解剖摘取兩側睪丸，剔除附著的結締組織，用4 ℃預冷生理鹽水沖洗后，用濾紙吸干睪丸表面水分，稱量質量，測量睪丸的前后寬、左右寬及厚度，計算睪丸臟器系數(shù)及體積。

臟器系數(shù)/%=m1/m×100%

式中，m1為臟器質量，m為體質量，a為睪丸前后寬，b為睪丸左右寬，c為睪丸厚度。

1.3.4 恢復期睪丸組織病理學觀察

于第30 d和第137 d摘取紅耳龜右側睪丸，置波恩氏液固定24 h，然后換成75%的乙醇溶液固定，采用蘇木精—伊紅染色，制作睪丸石蠟組織切片，鏡檢(MOTIC BA310-T)，顯微攝像。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結果以平均值±標準差表示，經SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析。采用方差分析和多重比較檢驗不同數(shù)據(jù)間的差異顯著性，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 膦氧氮丙啶對雄紅耳龜存活率的影響

不同質量濃度膦氧氮丙啶對雄紅耳龜?shù)拇婊盥视绊戄^大，10 g/L組個體除在第16 d取樣的6只外，在15 d的染毒期內死亡1只，停止注射后15 d內(即第16～30 d)死亡31只，隨后全部死亡；整個試驗期間0.1、3 g/L組，無死亡現(xiàn)象，存活率為100%，紅耳龜?shù)耐庥^及行動能力，與對照組基本類似，個體健康活潑、反應迅速、行動敏捷。表明10 g/L的膦氧氮丙啶對紅耳龜有傷害，膦氧氮丙啶的安全質量濃度低于3 g/L。

2.2 膦氧氮丙啶染毒期紅耳龜性激素水平及相關蛋白含量

試驗第16 d，雄性紅耳龜血清和睪丸性激素水平及相關蛋白含量見表1。處理組睪丸睪酮、雄激素結合蛋白含量略高于對照組，睪丸抑制素B、卵泡刺激素含量略低于對照組，其變化與膦氧氮丙啶質量濃度未呈現(xiàn)明顯的相關性。3個試驗組各項指標與對照組無差異顯著性(P>0.05)，說明膦氧氮丙啶對紅耳龜下丘腦—垂體—性腺作用軸沒有明顯傷害。

2.3 恢復期紅耳龜性激素水平及相關蛋白含量的變化

試驗第30 d雄紅耳龜血清及睪丸性激素水平見表2。處理組血清性激素與對照組相比未見顯著差異，睪丸性激素含量略高于對照組，其中卵泡刺激素升高26.42%，無統(tǒng)計學意義(P>0.05)?；謴推谛奂t耳龜?shù)男约に厮皆俅握f明，膦氧氮丙啶對睪丸損傷作用的靶細胞不是間質細胞，對紅耳龜下丘腦—垂體—性腺軸無明顯作用。3 g/L組的血清和睪丸抑制素B含量均顯著低于對照組(P<0.05)，約下降40%，說明試驗后期膦氧氮丙啶對睪丸曲細精管支持細胞具有損傷作用。

表1 膦氧氮丙啶對紅耳龜性激素水平及相關蛋白含量的影響(n=6)

表2 恢復期紅耳龜血清激素及蛋白含量的變化(n=6)

注：*表示同行指標差異顯著, ** 表示同行指標差異極顯著，下同.

2.4 恢復期紅耳龜睪丸組織病理學觀察

第30 d和第137 d時，0.1 g/L組與對照組紅耳龜?shù)牟G丸系數(shù)、附睪系數(shù)和睪丸體積均無顯著差異(P>0.05)(表3)，3 g/L組睪丸系數(shù)和體積明顯小于對照組(P<0.05)；第137 d 3 g/L組睪丸體積減小愈加明顯，約為對照組的1/4(P<0.05)。解剖觀察發(fā)現(xiàn)，對照組和0.1 g/L組紅耳龜?shù)牟G丸大而圓潤，富有彈性，附睪體積較大且有乳白色精液，附睪管粗而發(fā)白，說明這段時間是雄紅耳龜大量產精的季節(jié)。3 g/L組紅耳龜?shù)牟G丸小而質硬，無彈性，附睪小而萎縮，未見精液，說明恢復期膦氧氮丙啶對睪丸損傷作用未恢復。

表3 恢復期紅耳龜睪丸形態(tài)指標統(tǒng)計(n=6)

組織病理觀察發(fā)現(xiàn)，第30 d對照組紅耳龜?shù)牟G丸曲細精管各級生精細胞發(fā)育正常，排列緊密，管腔內偶見精子(圖1a)，0.1 g/L組各級生精細胞正常，細胞之間的間隙增大，管腔中央未見精子(圖1b)，3 g/L組生精細胞被破壞、溶解，數(shù)量明顯減少，無精子，可見外層支持細胞(圖1c)；第137 d對照組曲細精管生精細胞發(fā)育正常，管腔可見大量精子，0.1 g/L組生精細胞數(shù)量減少，管腔可見發(fā)育精子，3 g/L組支持細胞多見胞質有明顯空泡，數(shù)量減少?；謴推诘?0 d和第137 d，膦氧氮丙啶質量濃度為3 g/L時，致雄性個體睪丸生精細胞發(fā)生病理性改變，與染毒期睪丸發(fā)生的組織病理類似，屬不可逆損傷。

圖1 恢復期紅耳龜睪丸組織結構第30 d睪丸組織結構：a. 對照組(示各級生精細胞和精子)，b. 0.1 g/L組曲細精管生精細胞間隙增大，c. 3 g/L組(箭頭示曲細精管生精上皮細胞減少)；第137 d睪丸組織結構：d. 對照組(示各級生精細胞和精子)，e. 0.1 g/L組(示生精細胞和部分精子)，f. 3 g/L組(箭頭示外層支持細胞空泡)；皆為400×.

3 討 論

3.1 膦氧氮丙啶對紅耳龜?shù)牟挥?/h3>

不育劑防治有害生物較為經濟、安全、作用周期長，受到國內外有關專家的大力推薦[14]。理想不育劑的特點之一是低劑量且一次使用即可終身絕育[15]。本試驗中，采用合理的劑量和適當?shù)慕o藥方法可在不影響紅耳龜生長發(fā)育的基礎上，達到不育的效應。質量濃度3 g/L可作為膦氧氮丙啶不育防制外來物種紅耳龜?shù)耐扑]劑量。

3.2 膦氧氮丙啶影響紅耳龜生殖功能的機制

動物臟器的質量及形態(tài)是衡量動物健康與否的重要指標之一[16]，其臟器系數(shù)可近似反映該臟器的功能狀態(tài)和病變情況[17]。龔聲輝等[13]檢測發(fā)現(xiàn)，膦氧氮丙啶處理第16 d時，紅耳龜睪丸體積及臟器系數(shù)隨著處理質量濃度增加呈明顯下降趨勢。本試驗中，第30 d和第137 d的檢測結果與此一致，結合睪丸組織病理學觀察，表明膦氧氮丙啶對紅耳龜睪丸曲細精管生精細胞具有毒性作用。

睪丸的主要生理功能是曲細精管生精和間質細胞產生睪酮。不同試驗階段的睪丸組織病理學觀察顯示，膦氧氮丙啶的作用靶細胞是曲細精管內的各級生精細胞，對間質細胞作用不敏感。第16 d和第30 d兩次血清和睪丸性激素水平的檢測表明，下丘腦—垂體—性腺軸沒有受到干擾，睪酮水平沒有顯著性變化，也驗證了這一結果。劉巍等[12,18]研究了膦氧氮丙啶對雄小鼠生殖功能的影響，認為生殖細胞對膦氧氮丙啶毒性作用比較敏感，膦氧氮丙啶能穿過血—睪屏障，對其生殖細胞具有誘變性，其誘變作用可以直接造成各級生精細胞數(shù)量減少，甚至退化，導致不育。推測膦氧氮丙啶對雄性紅耳龜也具有類似的生殖毒性。

血清抑制素B水平可直接反映睪丸功能和生精上皮狀態(tài)，是評價精子發(fā)生狀態(tài)的血清學標志物[19]。染毒期(第16 d)各處理組雄激素結合蛋白和抑制素B含量沒有明顯變化，第30 d時抑制素B含量降低約40%，與該時期支持細胞數(shù)量減少、空泡化嚴重密切相關。支持細胞為睪丸營養(yǎng)細胞，使精子發(fā)生，促進精子成熟[20]，支持細胞數(shù)目降低勢必影響精子的產量[21]。膦氧氮丙啶破壞支持細胞，加劇了紅耳龜生精功能的障礙。

綜上所述，膦氧氮丙啶可使雄紅耳龜生殖能力下降，甚至不育，能保持正常發(fā)情及性活動。養(yǎng)殖場的紅耳龜售前進行不育處理，將有效阻止逃逸、放生個體參與與野外種群的繁殖，干預野外可育個體的繁殖，有效控制該物種在野外迅速蔓延的態(tài)勢，降低紅耳龜對入侵地生態(tài)環(huán)境的危害。

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EffectofSterilantPhosphineOxideAziridine(MAPO)onReproductiveFunctioninMaleAmericanRed-earedTerrapinTrachemysscriptaelegans

FU Lirong, ZHANG Ruihong, GONG Shenghui, ZHANG Haihui, SHI Haitao

( College of Life Science, Hainan Normal University, Haikou 571158, China )

A total of 160 individuals of healthy adult male American red-eared terrapinTrachemysscriptaeleganswith body weight of (738.9±101.2) g was randomly divided into control group in which the terrapin was injected with 0.65% physiological saline solution (n=40), and three treated groups (n=40,for each group) in which the terrapin was injected intraperitoneally with 2 mL of phosphine oxide aziridine (MAPO) solution at a concentration of 0.1 g/L, 3 g/L and 10 g/L once in 2 day interval for 15 d to study the effect of MAPO on reproductive function in male terrapins and to explore an effective approach to prevent American red-eared terrapin from prevailing. The levels of hormones and relative proteins in serum and testis were measured in 16 d and 30 d, and testicular tissue structures were histologically observed by a microscope during recovery periods (30 d and 137 d). The results showed that high dose of MAPO led to death of the terrapin, and the level of sex hormone in serum and testis was not differed (P>0.05) in both low dose group and middle dose group compared with the control group in 16 d and 30 d, indicating that MAPO has no interference effect on hypothalamic-pituitary-gonadal axis. However, there was significantly lower serum inhibin B in middle dose group than that in the control group in 30 d, suggesting that sertoli cells were damaged. Moreover, the various pathological damages were observed in the testis in treatment groups during recovery periods, with increase in the spermatogenic cell gaps, and slightly toxic in low dose group. The spermatogenic cells were destructive, and dissolution in middle dose group, implying an irreversible damage. In conclusion, MAPO leads to infertility of male American red-eared terrapin by damaging testicular spermatogenic cells, sertoli cells, and the spermatogenic environment, so that MAPO can be used as a potential infertility drug to prevent the species from prevailing.

phosphine oxide aziridine;Trachemysscriptaelegans; sex hormone; tissue structure

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.018

S966.5

A

1003-1111(2017)06-0794-05

2016-09-13；

2016-12-11.

國家自然科學基金資助項目(31772486)；海南省自然科學基金資助項目(314078).

傅麗容(1964-), 女, 教授; 研究方向：龜鱉動物生理學. E-mail: flr@hainnu.edu.cn. 通訊作者：史海濤(1963-)，男，教授；研究方向：兩棲爬行動物生態(tài)學與保護生物學.E-mail: haitao-shi@263.net