羅 芬, 黃偉卿,2, 阮少江, 李進(jìn)壽, 陳小小, 阮俊峰, 周逢芳

( 1.寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352100 )

溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響

羅 芬1, 黃偉卿1,2, 阮少江1, 李進(jìn)壽1, 陳小小1, 阮俊峰1, 周逢芳1

( 1.寧德師范學(xué)院 生物系，福建 寧德 352100；2.寧德市鼎誠水產(chǎn)有限公司，福建 寧德 352100 )

給7尾體質(zhì)量325～520 g的成熟海捕野生大黃魚人工催產(chǎn)后采精液，在20 ℃(室溫)和4 ℃(冰箱)下保存0、1、3、6、12、24、36 h，以砂濾海水為激活劑，觀察大黃魚精子活力，以精子的激烈運(yùn)動、搖尾運(yùn)動、緩慢運(yùn)動和壽命作為評價指標(biāo)。試驗結(jié)果表明，4 ℃和20 ℃下隨保存時間的延長，精子活力逐漸減弱；4 ℃下保存24 h、20 ℃下保存12 h，精子仍具有激烈運(yùn)動的能力；4 ℃下保存的3個運(yùn)動階段和壽命較20 ℃下均有所延長，4 ℃保存大黃魚精子更佳。

野生；大黃魚；精子活力；溫度

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)為我國特有的中下層暖溫性近海集群洄游魚類，主要分布于南海、東海和黃海南部，曾是傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”(大黃魚、小黃魚、帶魚、烏賊)之一[1-2]。大黃魚自人工繁育技術(shù)突破今，經(jīng)過30多年養(yǎng)殖發(fā)展，2015年全國產(chǎn)量達(dá)1.48×105t ,產(chǎn)值逾120億元，已成為我國最大規(guī)模的海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖魚類和八大優(yōu)勢出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品之一[3]。隨著大黃魚養(yǎng)殖的快速發(fā)展，也出現(xiàn)了累代近親繁殖導(dǎo)致的生長性能和抗逆性降低等問題[4-6]。而海捕野生大黃魚群體的遺傳特性、營養(yǎng)結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征、抗逆性能等均優(yōu)于養(yǎng)殖大黃魚群體，對大黃魚群體的遺傳性狀改良和良種選育具有現(xiàn)實(shí)意義[7-10]。但海捕野生大黃魚成活率低，直接或培育至親本用于種質(zhì)改良難度大，如能及時有效保存海捕野生大黃魚的精液，保存精子活力，對改良大黃魚種質(zhì)資源具有重要意義。

溫度主要通過控制三磷酸腺苷來影響精子的活動強(qiáng)度及壽命[11]。羅芬[12]研究表明，4 ℃下保存的長鰭吻(Rhinogobioventralis)精子3個運(yùn)動階段和壽命均較20 ℃下長；李加兒等[13]報道，將平鯛(Rhabdosargussarba)精子保藏在3～5 ℃的冰箱中,壽命較室溫條件下延長；韓英等[14]發(fā)現(xiàn)，黑龍江茴魚(Thymallusarcticusgrubei)的精液隨保存時間的延長，精子的激活率、快速運(yùn)動時間和壽命均顯著下降。朱東發(fā)[15]報道了環(huán)境因子對養(yǎng)殖大黃魚精子激活率和活動時間的影響，而關(guān)于保存溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響尚未見報道。本試驗研究了溫度對海捕野生大黃魚精子活力的影響，旨在補(bǔ)充大黃魚精子的生理特性資料，探尋適宜的保存溫度，以延長大黃魚精子的保存時間，提高精子的授精能力。

1 材料與方法

1.1 精液的采集與保存

給體長26.5～35.4 cm、體質(zhì)量325～520 g的體質(zhì)健壯、外表無損傷及病害的7尾成熟海捕野生大黃魚雄魚注射促黃體素釋放激素類似物(LRH-A)，劑量為5 μg/kg，暫養(yǎng)24 h后用干毛巾擦干生殖孔周圍及體表的水分，用手輕壓魚腹部兩側(cè)，使精液流出，用干凈的膠頭滴管從生殖孔吸取沒有受到污染的精液，盛放于小培養(yǎng)皿中并加蓋，快速放進(jìn)4 ℃低溫中保存，定期取出少許精液待檢，待檢精液無水、無尿、無血，遇水迅速散開。經(jīng)顯微鏡檢查，精子活力在90%以上者用于試驗。

1.2 精液在20 ℃和4 ℃下保存與激活

將所取精液分成兩等份，置于20 ℃(室溫)和4 ℃(冰箱)下保存，0、1、3、6、12、24、36 h定時取樣觀察，以砂濾海水為激活劑。

1.3 精子活力的觀察

采用平板載玻片法觀察精子活力。滴一滴試驗液于干燥潔凈的載玻片上，用消毒的解剖針蘸取少許精液，使其均勻分散，在10×40倍的顯微鏡下觀察，精液與試驗液接觸的瞬間立即啟動秒表計時，記錄精子活動情況[16]。觀察以1個視野為準(zhǔn)，每個樣品重復(fù)3～5次。

根據(jù)精子在水中的運(yùn)動狀態(tài)分為激烈運(yùn)動、緩慢運(yùn)動和搖尾運(yùn)動3個連續(xù)階段。這3個階段時間的總和為總運(yùn)動時間，即精子的壽命。各階段的具體劃分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異采用SPSS 17.0軟件的單因素方差分析法處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

4 ℃下保存36 h，精子失去了激烈運(yùn)動能力，僅緩慢運(yùn)動和搖尾運(yùn)動，緩慢運(yùn)動、搖尾運(yùn)動和壽命均顯著減少(P<0.05)；保存1 h與0 h相比精子活力差異不顯著(P>0.05)；保存3、6、12、24 h與0 h相比，精子運(yùn)動時間和壽命均存在顯著差異(P<0.05)(表1)。

20 ℃下保存24 h，精子就已喪失激烈運(yùn)動的能力，緩慢運(yùn)動和搖尾運(yùn)動也顯著減少(P<0.05)；保存1 h精子活力顯著低于0 h(P<0.05)；保存3、6、12 h精子運(yùn)動時間和壽命顯著縮短(P<0.05)；36 h后精子僅有搖尾運(yùn)動，且搖尾運(yùn)動和壽命顯著減少(P< 0.05)(表2)。

表1 4 ℃下保存不同時間時海捕野生大黃魚精子的活力 s

注：同列中上標(biāo)不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

表2 20 ℃下保存不同時間時海捕野生大黃魚精子的活力 s

*表示相關(guān)顯著(P<0.05)，**表示相關(guān)極顯著(P<0.01)，下同.

圖2 4 ℃和20 ℃下保存不同時間時黃魚精子的壽命

4 ℃下3 h和6 h時精子激烈運(yùn)動時間顯著長于20 ℃(P<0.05)；4 ℃下24 h時，精子激烈運(yùn)動時間極顯著長于20 ℃(P<0.01)(圖1)。4 ℃下3 h和24 h時，精子壽命顯著高于20 ℃(P<0.05)；12 h時，4 ℃下精子壽命極顯著高于20 ℃(P<0.01)(圖2)。

海捕野生大黃魚精子的運(yùn)動時間和壽命隨保存時間的延長而下降。4 ℃下保存的3個運(yùn)動階段和壽命較20 ℃下有所延長；4 ℃下保存24 h、20 ℃下保存12 h精子仍具有激烈運(yùn)動能力，4 ℃下保存精子活力明顯提高。

3 討 論

精子靠尾部鞭毛的擺動來運(yùn)動。外界因子通過干預(yù)cAMP-ATP-Mg2+系統(tǒng)來影響鞭毛的活動而制約魚類精子的活力[17]。本試驗表明，保存溫度和時間影響海捕野生大黃魚精子的活力。4 ℃低溫保存的海捕野生大黃魚精子活力激烈運(yùn)動時間、壽命及保存時間均比20 ℃時更長，這與長鰭吻、黑龍江茴魚、鞍帶石斑魚(Epinepheluslanceolatus)、石鰈(Kareiusbicoloratus)和褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)的研究結(jié)果相似[12-14,18-19]。不同保存溫度對精子活力的影響不同。溫度在魚類精子激活生理中的作用可能主要是參與代謝酶活性的調(diào)節(jié)[14]，低溫減少了精子對三磷酸腺苷的消耗，延長了精子的運(yùn)動時間[20]。魚類精子的原生質(zhì)含量極少，蘊(yùn)藏的能量十分有限，低溫抑制了精子新陳代謝的速度，能量消耗減緩，精子壽命延長；低溫條件下精子運(yùn)動頻率明顯降低，激烈運(yùn)動時間及壽命延長；低溫還抑制了細(xì)菌的滋生，這也是精子在低溫下延長運(yùn)動時間和壽命的重要原因。瓣結(jié)魚[Tor(Folifer)brevifilis]精子在4 ℃下保存24 h仍活力正常[21]；鞍帶石斑魚精液在0～4 ℃冰箱中保存6 h活力未顯著降低[18]；褐牙鲆精子在4 ℃下保存24 h、石鰈精子在4 ℃下保存6 h仍具較強(qiáng)活力[19]。長鰭吻精子在4 ℃下保存36 h仍具激烈運(yùn)動能力，但在20 ℃下僅能保存12 h；4 ℃下保存不同時間3個運(yùn)動階段和壽命均較20 ℃下延長[12]。海捕野生大黃魚精子活力較強(qiáng)，在4 ℃下保存24 h可以維持激烈運(yùn)動時間(31.20±6.39) s、壽命長達(dá)(164.00±23.14) s；而20 ℃下保存24 h已喪失激烈運(yùn)動能力，壽命縮短，僅(69.46±3.31) s。林丹軍等[22]將養(yǎng)殖大黃魚精液置于4 ℃冰箱中24 h后用海水激活，精子活力仍可達(dá)到60%以上。在人工繁殖中，低溫保存對精子激活及提高受精率具有重要應(yīng)用意義。不過低溫條件下只是抑制了精子的新陳代謝，耗能仍在繼續(xù)，精子活力隨時間延長而下降，精液保存的時間有限。因此，在人工授精過程中應(yīng)縮短海捕野生大黃魚精液保存時間，取得精液后保存于低溫(4 ℃)并盡早使用，可以有效延長精子活動時間，尤其是延長激烈運(yùn)動的時間，增加了精卵接觸機(jī)會，能夠提高受精率，確保人工授精成功。

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EffectsofTemperatureonSpermMotilityofWildLargeYellowCroakerPseudosciaenacrocea

LUO Fen1，HUANG Weiqing1,2，RUAN Shaojiang1，LI Jinshou1，CHEN Xiaoxiao1，RUAN Junfeng1， ZHOU Fengfang1

( 1.Department of Bioengineering,Ningde Normal University, Ningde 352100, China; 2.Ningde Dingcheng Fishery Company Limited, Ningde 352100, China )

The activation and motility of spermatozoa collected from captured wild male large yellow croaker (Pseudosciaenacrocea) with body weight of 325-520 g were investigated under the different preservation time (0, 1, 3, 6, 12, 24 h and 36 h) at the temperature of 4 ℃ and 20 ℃. The strenuous movement, wagging movement, slow movement and life time of sperm were taken as an index to evaluate sperm activity. The results showed that the sperm had gradually weak motility over time at the temperature of 4 ℃ and 20 ℃, being still strenuous movement when the sperm was preserved at 4 ℃ for 24 h or 20 ℃ for 12 h. However, there were longer movement in the three stages of life at 4 ℃ than at 20 ℃, with stronger motility at 4 ℃ than at 20 ℃.

wild;Pseudosciaenacrocea; sperm motility; temperature

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.022

S965.322

A

1003-1111(2017)06-0814-04

2016-09-01；

2016-12-12.

福建省科技計劃項目(2017N0027)；寧德師范學(xué)院創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目(2015T10).

羅芬(1963-)，女，教授；研究方向：魚類生理學(xué)及水產(chǎn)保護(hù)學(xué).E-mail:luofen1999@163.com.