閆春梅, 杜曉燕, 鄭 偉，劉慧吉，肖志國，張家松，楊曉波

( 1.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林 長春 130033；2.和龍市青龍漁業(yè)有限公司，吉林 延吉 133000 )

中國東北部山區(qū)細(xì)鱗魚4個(gè)群體遺傳多樣性分析

閆春梅1, 杜曉燕1, 鄭 偉1，劉慧吉1，肖志國1，張家松1，楊曉波2

( 1.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林 長春 130033；
2.和龍市青龍漁業(yè)有限公司，吉林 延吉 133000 )

采用微衛(wèi)星法，利用11對微衛(wèi)星引物對黑龍江省松花江流域、吉林省圖們江支流紅旗河流域、吉林省白山市鴨綠江流域及吉林省圖們江支流密江流域隨機(jī)采集的94尾細(xì)鱗魚樣本進(jìn)行遺傳多樣性分析，探討4個(gè)不同流域細(xì)鱗魚群體的遺傳多樣性差異及其親緣關(guān)系。結(jié)果顯示，4個(gè)群體共檢測到等位基因147個(gè)，各群體有效等位基因數(shù)為1.6541～2.4143，平均觀測雜合度為0.3849～0.5186，平均期望雜合度為0.3488～0.5003，4個(gè)群體平均多態(tài)信息含量為0.3320～0.4704。親緣關(guān)系分析顯示，紅旗河流域群體與密江流域群體遺傳距離最小(0.0954)，親緣關(guān)系最近。松花江流域群體與其他3個(gè)群體的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。群體間相似指數(shù)在0.7112以上，相似性較高。

細(xì)鱗魚；遺傳多樣性；微衛(wèi)星

細(xì)鱗魚(Brachymystaxlenok)，屬鮭形目、鮭科、細(xì)鱗魚屬，屬名貴冷水性經(jīng)濟(jì)魚類，營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均較高，在我國主要分布于黑龍江、圖們江、鴨綠江、松花江、遼河支流太子河、河北省小灤河上游、秦嶺及額爾齊斯河等，目前僅在中國東北部有較集中分布。由于生態(tài)環(huán)境破壞和人為因素的雙重影響，細(xì)鱗魚自然繁殖受到影響，生殖親體出現(xiàn)退化趨勢，種群數(shù)量逐年減少，分布范圍日趨縮小，野生資源量急劇衰退，已列入中國瀕危動(dòng)物紅皮書(魚類)，屬國家二級保護(hù)水生野生動(dòng)物，瀕危種。近年來，對細(xì)鱗魚物種的保護(hù)逐漸受到重視，先后有水產(chǎn)行業(yè)專家學(xué)者對細(xì)鱗魚生存環(huán)境[1]及其生物學(xué)特性[2]、人工繁育[3]、遺傳多樣性[4-8]等方面展開研究。本研究在諸多研究基礎(chǔ)上，應(yīng)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法，對分布于黑龍江省松花江流域、吉林省圖們江支流紅旗河流域、吉林省白山市鴨綠江流域及吉林省圖們江支流密江流域的細(xì)鱗魚群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析及其親緣關(guān)系比較研究，旨在進(jìn)一步為細(xì)鱗魚種質(zhì)資源保護(hù)及遺傳改良和合理有效地開發(fā)利用提供分子生物學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用細(xì)鱗魚組織樣品來源于中國東北部山區(qū)4個(gè)不同地域，分別為黑龍江省松花江流域，隨機(jī)采集11尾，命名為松花江群體；吉林省圖們江支流紅旗河流域，隨機(jī)采集30尾，命名為紅旗河群體；吉林省白山市鴨綠江流域，隨機(jī)采集23尾，命名為鴨綠江群體；吉林省圖們江支流密江流域，隨機(jī)采集30尾，命名為密江群體。所有鰭條組織樣品均保存于95%乙醇中。

基因組DNA試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。引物合成委托上海生物工程有限公司完成。

1.2 基因組DNA提取

保存于95%乙醇中的組織樣品經(jīng)超純水清洗后晾干，應(yīng)用基因組DNA提取試劑盒提取所有組織樣品基因組DNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用紫外分光光度計(jì)法測定其含量和純度，采用滅菌超純水稀釋至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物合成及PCR擴(kuò)增

NCBI查找相關(guān)細(xì)鱗魚微衛(wèi)星引物序列27對，合成普通引物。對普通引物進(jìn)行可用性篩選，摸索引物條件和體系。進(jìn)行PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物上2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，確認(rèn)符合目的長度的引物11對，引物序列見表1。

對上一步得到有條帶的引物進(jìn)行熒光引物合成，在其中1條引物的5′端加FAM/HEX/Tamra標(biāo)記。對所有DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，PCR反應(yīng)體系為10 μL[Primers (10 mmol/L)0.4 μL，10×PCR Buffer 1 μL，dNTP 0.2 μL，50 nmol/L MgCl20.4 μL，Taq 酶 0.04 μL，DNA模板 1 μL，ddH2O 6.96 μL]。94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s,退火30 s，72 ℃延伸30 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物上3730 xl基因分析儀檢測。

表1 用于微衛(wèi)星分析引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

應(yīng)用Popgen 32軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，分別完成等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、群體間遺傳距離和相似指數(shù)、聚類分析、哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)(P值)以及平均多態(tài)信息含量計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體遺傳多樣性分析

篩選出的11個(gè)位點(diǎn)在4個(gè)群體中的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、平均多肽信息含量和哈迪溫伯格平衡數(shù)據(jù)見表2。由表2可見，4個(gè)群體94個(gè)樣品，應(yīng)用11對微衛(wèi)星引物進(jìn)行DNA檢測，共檢測到等位基因147個(gè)，其中松花江群體24個(gè)、紅旗河群體50個(gè)、鴨綠江群體43個(gè)、密江群體30個(gè)。由于不同群體檢測的等位基因不一致，共獲得51個(gè)不同等位基因。其中每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)2～7個(gè)。OMM1008和OMM1077各檢測到7個(gè)等位基因，OMM1044和OMM1105在松花江群體和密江群體兩個(gè)群體分別只有1個(gè)等位基因，在其他兩個(gè)群體中為2～5個(gè)等位基因。

各群體有效等位基因數(shù)為1.6541～2.4143，平均觀測雜合度為0.3849～0.5186，平均期望雜合度為0.3488～0.5003。其中紅旗河群體的上述指標(biāo)數(shù)值均為最高。

利用平均多態(tài)信息含量計(jì)算軟件計(jì)算4個(gè)群體平均多態(tài)信息含量為0.3320～0.4704，紅旗河群體的多肽信息含量為最高(0.4704)。除OMM1044和OMM1105為低多態(tài)性位點(diǎn)(平均多肽信息含量<0.25)，OMM1077和TL35為高度多態(tài)(平均多肽信息含量>0.5)，其他7個(gè)位點(diǎn)均為中度多態(tài)(0.25<平均多肽信息含量<0.5)。

11對微衛(wèi)星引物在4個(gè)群體中檢測的44個(gè)位點(diǎn)中，OMM1044和OMM1105在松花江群體和密江群體兩個(gè)群體中為單態(tài)，對其他40個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分析，29個(gè)位點(diǎn)符合哈迪溫伯格平衡(P>0.05)，其他11個(gè)位點(diǎn)均有偏離哈迪溫伯格平衡(P<0.05)的群體，偏離哈迪溫伯格平衡的現(xiàn)象在4個(gè)群體均存在。本試驗(yàn)11對引物中有4對引物(OMM1007、OMM1008、OMM1039、OMM1077)在4個(gè)群體中均符合平衡。

2.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

11對引物對4個(gè)群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物條帶經(jīng)聚類分析顯示，紅旗河群體與密江群體遺傳距離最小(0.0954)，親緣關(guān)系最近。松花江群體與其他3個(gè)群體的遺傳距離較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(表3，圖1)。

通過基因流和群體間遺傳分化系數(shù)可見(表3)，4個(gè)群體間的遺傳分化系數(shù)值為0.0580～0.1751，其中松花江群體—鴨綠江群體間的遺傳分化系數(shù)值最高(0.1751)。松花江群體—密江群體和松花江群體—紅旗河群體的群體間遺傳分化系數(shù)值僅次于松花江群體—鴨綠江群體。紅旗河群體—鴨綠江群體和紅旗河群體—密江群體的群體間遺傳分化系數(shù)值最低。4個(gè)群體間的基因流值為1.1930～4.0581。其中紅旗河群體與鴨綠江群體和密江群體兩群體間的基因流值較高，分別為4.0581和3.6423。

表2 4個(gè)細(xì)鱗魚群體的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性分析

(續(xù)表2)

位點(diǎn)群體等位基因數(shù)有效等位基因數(shù)觀測雜合度期望雜合度多態(tài)信息含量哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)OMM1044松花江群體11.00000.00000.00000.00000.000000**紅旗河群體41.31960.06670.24630.23210.000536**鴨綠江群體42.55560.34780.62220.54930.047738*密江群體11.00000.00000.00000.00000.000000**OMM1077松花江群體32.14160.81820.55840.43160.073314紅旗河群體64.11900.66670.77010.71680.080230鴨綠江群體75.53140.77270.83830.79530.225080密江群體42.15050.70000.54410.45840.508318OMM1105松花江群體11.00000.00000.00000.00000.000000**紅旗河群體51.32060.26670.24690.23350.999754鴨綠江群體21.18880.17390.16230.14620.592661密江群體11.00000.00000.00000.00000.000000**TL24松花江群體21.11720.11110.11110.09951.000000紅旗河群體41.93940.54170.49470.40210.932953鴨綠江群體53.56230.47830.73530.67510.045465*密江群體21.18030.16670.15540.14160.546181TL35松花江群體32.39600.45450.61040.50750.467053紅旗河群體52.82570.53330.65710.60430.359580鴨綠江群體42.76960.60870.65310.56800.043662*密江群體21.99120.60000.50620.37390.299619平均值松花江群體2.18181.66740.38490.34920.3320紅旗河群體4.54552.41430.51860.50030.4704鴨綠江群體3.90912.37820.42600.49420.4378密江群體2.72731.65410.42100.34880.3500

注:*:P<0.05; **:P<0.01.

表3 4個(gè)群體的遺傳分化系數(shù)及基因流

注：對角線以下為群體間遺傳分化系數(shù)，對角線以上為基因流.

表4 4個(gè)群體的遺傳距離和相似性指數(shù)

注：對角線以下為遺傳距離，對角線以上為遺傳相似指數(shù).

圖1 4個(gè)群體的UPGMA聚類圖

3 討 論

微衛(wèi)星法是檢測共顯性遺傳特征的分辨率很高的較新遺傳學(xué)研究方法，目前已成為種群遺傳結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析的有效分子標(biāo)記。本試驗(yàn)利用微衛(wèi)星法分析了4個(gè)不同流域細(xì)鱗魚群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性是衡量一個(gè)種群種質(zhì)資源質(zhì)量的重要指標(biāo)。遺傳多樣性越高，進(jìn)化潛力越大[9]。本研究主要從等位基因數(shù)、雜合度、多態(tài)信息含量、哈迪溫伯格平衡等幾個(gè)方面對4個(gè)不同流域細(xì)鱗魚群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析。平均雜合度是被檢測位點(diǎn)上群體的雜合子頻率，用于檢測群體內(nèi)遺傳變異，是群體雜合程度的度量單位。雜合度高低與遺傳多樣性豐度和群體對環(huán)境的適應(yīng)能力成正相關(guān)[10]。本試驗(yàn)中，4個(gè)群體平均有效等位基因數(shù)為1.6541～2.4143，平均觀測雜合度0.3849～0.5186，平均期望雜合度0.3488～0.5003。表明4個(gè)群體遺傳多樣性均較豐富，尤其是紅旗河群體，群體平均觀測雜合度0.5186，平均期望雜合度0.5003，遺傳多樣性高于其他3個(gè)群體，對環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)，具有較豐富的育種和遺傳改良潛力，應(yīng)采取相應(yīng)措施予以保護(hù)。

除雜合度以外，還可以通過平均多肽信息含量來檢測多態(tài)性，從而來度量遺傳多樣性和基因豐富程度。Botstein等[11]認(rèn)為，當(dāng)平均多肽信息含量<0.25時(shí)為低度多態(tài)位點(diǎn)，0.25<平均多肽信息含量<0.5時(shí)為中度多態(tài)位點(diǎn)，平均多肽信息含量>0.5時(shí)為高度多態(tài)位點(diǎn)。本研究中11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中包括2個(gè)低度多態(tài)性位點(diǎn)、7個(gè)中度多態(tài)性位點(diǎn)和2個(gè)高度多態(tài)性位點(diǎn)，位點(diǎn)多態(tài)性較豐富。對4個(gè)群體分析結(jié)果表明，4個(gè)群體的平均多態(tài)信息含量為0.3192～0.4704，介于0.25～0.5之間，證明群體間遺傳多樣性中等，4個(gè)群體均屬于中度多態(tài)性。

哈迪溫伯格平衡是指在一個(gè)群體無限大，且又具備隨機(jī)交配、沒有突變、沒有選擇、沒有遺傳漂變的情況下，群體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率將保持世代不變，處于遺傳平衡狀態(tài)[12]。本研究中11個(gè)微衛(wèi)星引物在4個(gè)群體中均觀測到顯著偏離平衡情況，40個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中11個(gè)位點(diǎn)偏離平衡(P<0.05)。這種現(xiàn)象可能與樣本量及無效等位基因的存在有關(guān)[13]。

3.2 群體間遺傳結(jié)構(gòu)

本研究的目的是檢驗(yàn)4個(gè)細(xì)鱗魚群體的遺傳關(guān)系，因此，遺傳距離和遺傳相似度是重要的衡量指標(biāo)。在群體的進(jìn)化研究中，可通過計(jì)算遺傳距離來鑒定種間遺傳結(jié)構(gòu)及分化關(guān)系。微衛(wèi)星研究方法認(rèn)為遺傳距離越遠(yuǎn)，分化時(shí)間越長，雜種優(yōu)勢越大，即遺傳距離與分化關(guān)系呈正相關(guān)。1982年Thorp綜合一系列研究認(rèn)為，遺傳距離大于0.05同時(shí)小于0.3為同種不同群體；遺傳距離大于0.3同時(shí)小于0.9為同屬不同種；遺傳距離大于0.9為不同屬[14]。本試驗(yàn)4個(gè)群體間遺傳距離均大于0.0954，認(rèn)為4個(gè)群體間發(fā)生了遺傳分化。其中松花江群體與鴨綠江群體遺傳距離為0.3408，稍高于0.3，認(rèn)為種群間開始發(fā)生種的分化，其他3個(gè)群體遺傳距離均小于0.3，認(rèn)為種群間已發(fā)生群體分化，為同種不同群體。綜合來看，4個(gè)群體間雖有分化，但分化程度不高。聚類分析結(jié)果也證實(shí)紅旗河群體與密江群體首先聚為一支，松花江群體單獨(dú)分為一支。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能是紅旗河群體與密江群體均屬吉林省圖們江支流，地理位置相對較近，因此聚為一支；而鴨綠江群體屬吉林省鴨綠江流域，與紅旗河群體與密江群體同屬吉林省但流域不同，因此遺傳距離稍遠(yuǎn)；松花江群體則屬于黑龍江省松花江流域，地理位置最遠(yuǎn)，所以單獨(dú)分為一支。

此外，基因流和群體間遺傳分化系數(shù)也可用來分析群體間遺傳分化程度。基因流<1說明群體分化程度較大，1<基因流<4則是分化程度一般，基因流>4說明群體間該位點(diǎn)的遺傳分化程度較小[15]。本研究中4個(gè)群體之間的基因流值均大于1.1930，表明群體間發(fā)生了一般程度的基因交流，而紅旗河群體與鴨綠江群體和密江群體兩群體間的遺傳分化程度更小，基因流值分別為4.0581和3.6423。遺傳分化系數(shù)是反映種群間的遺傳分化程度的重要指標(biāo)。當(dāng) 0<遺傳分化系數(shù)≤0.05時(shí), 表明群體遺傳分化較弱;0.05<遺傳分化系數(shù)≤0.15時(shí), 表明群體遺傳分化中等; 0.15<遺傳分化系數(shù)≤0.25時(shí),表明群體遺傳分化較大; 遺傳分化系數(shù)>0.25時(shí),表明群體遺傳分化很大[16]。本研究中松花江群體與另外3個(gè)群體種群間的遺傳分化系數(shù)分別為0.1402、0.1751、0.1733，遺傳分化程度較大，紅旗河群體與鴨綠江群體和密江群體兩群體間的種群間遺傳分化系數(shù)分別為0.0580、0.0642，鴨綠江群體和密江群體的種群間遺傳分化系數(shù)為0.1391。證明其遺傳分化程度中等。此結(jié)論與群體間聚類分析結(jié)果基本一致。本研究分析的4個(gè)中國東北部山區(qū)細(xì)鱗魚群體遺傳多樣性可見，4個(gè)群體遺傳多樣性均較高，特別是紅旗河群體，具有一定的遺傳潛力，可作為選育群體。建議人工繁殖時(shí)選取遺傳距離較遠(yuǎn)的個(gè)體作為親本，同時(shí)對同一繁殖群體可進(jìn)行不同地理區(qū)域放流，以增加群體遺傳多樣性，保證種質(zhì)資源永續(xù)利用。

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GeneticDiversityofFourPopuationsofLenokBrachymystaxlenokinMountainAreaofNortheastChina

YAN Chunmei1, DU Xiaoyan1, ZHENG Wei1, LIU Huiji1, XIAO Zhiguo1, ZHANG Jiasong1, YANG Xiaobo2

( 1.Jilin Fisheries Research Institute, Changchun 130033，China; 2.Helong Qinglong Fisheries Limited Company, Yanji 133000，China )

The genetic diversities and relationship were investigated in ninety-four individuals of lenok(Brachymystoxlenok) collected from Songhua river basin in heilongjiang province, Jilin Tumen river tributary of Red Flag river basin, Jilin Baishan Yalu river basin and Jilin Tumen river tributary of Mijiang river basin by 11 pairs of microsate llite primers and by SSR. The results showed that 147 alleles were detected in the four populations, with effective allele number (Ne) of 1.6541-2.4143, average observed heterozygosity of 0.3849-0.5186, and the average expected heterozygosity of 0.3488-0.5003. Four populations of lenok had the average polymorphism information content (PIC) of 0.3320-0.4704. The phylogenetic relationship analysis indicated that the Red Flag river group and the Mijiang river group had the minimal genetic distance(0.0954), with the close tgenetic relationship. The Songhuajiang group showed larger genetic distance than the other 3 groups did, with similarity index of over 0.7112 between groups.

Brachymystaxlenok; genetic diversity; microsatellite

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.015

S917

A

1003-1111(2017)06-0778-06

2016-10-24；

2016-12-29.

吉林省省級公益性科研院所行業(yè)科研項(xiàng)目；吉林省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項(xiàng)目(2015-2016).

閆春梅(1981-)，女，工程師，碩士；研究方向：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)、水產(chǎn)養(yǎng)殖. E-mail：yanchunmei199950@126.com.通訊作者：杜曉燕(1961-)，女，研究員；研究方向：水產(chǎn)生物. E-mail: dxypa@tom.com.