耿中雷，楊亞云，蔡春爾,2，何培民,2

( 1.上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306； 2.江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005 )

4種海藻多糖對(duì)鯽魚生長免疫影響的探究

耿中雷1，楊亞云1，蔡春爾1,2，何培民1,2

( 1.上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，上海 201306； 2.江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005 )

為研究4種海藻多糖對(duì)鯽魚生長和免疫的影響，將鯽魚[(50±5) g]暫養(yǎng)2 d，隨機(jī)分為普通飼料組、滸苔組、條斑紫菜組、銅藻組、壇紫菜組5組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)平行10尾，準(zhǔn)確記錄體質(zhì)量。養(yǎng)殖60 d后，注射菌體密度為107cfu/mL嗜水氣單胞菌，24 h后稱取魚的體質(zhì)量，解剖脾臟稱量質(zhì)量，并取魚血測(cè)定堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、球蛋白活性。試驗(yàn)結(jié)果顯示，滸苔組、條斑紫菜組、銅藻組魚的質(zhì)量增加率相比普通飼料組有所提高，其中滸苔組效果最好，質(zhì)量增加率為47.50%。滸苔組、條斑紫菜組、銅藻組、壇紫菜組鯽魚的脾體比均有所增加，且滸苔組和條斑紫菜組較好，脾體比增加量分別為23.76%和27.73%，4組培養(yǎng)基中菌落數(shù)較普通飼料組有所減少。血液生化檢測(cè)結(jié)果，滸苔組的總蛋白和球蛋白含量均高于普通飼料組。由結(jié)果數(shù)據(jù)分析可以看出，4種海藻多糖在一定程度上可促進(jìn)鯽魚生長并能提高其抗病能力。

海藻多糖；鯽魚；體質(zhì)量；免疫力

海洋蘊(yùn)涵著豐富的海藻資源，海藻中多糖的含量達(dá)到干質(zhì)量的50%以上[1]。各種多糖在對(duì)動(dòng)物體的免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)中顯示高活性和低毒性[2-3]。褐藻糖膠、海帶(Saccharinajaponica)多糖、海藻酸和滸苔(Enteromorpha)多糖都具有抗氧化性質(zhì)[5-6]。此外，灌胃試驗(yàn)證明，褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血作用[7]。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)為淡水生革蘭氏陰性菌，在一定條件下對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物、畜禽和人類均有致病性[8-10]?？梢痿~體出血性敗血癥，導(dǎo)致魚鰭和魚尾腐爛，在人體的腸道和傷口也可引起感染[10-14]?，F(xiàn)已知嗜水氣單胞菌可產(chǎn)生外毒素、胞外蛋白酶、S蛋白、菌毛、外膜蛋白、脂多糖等多種毒力因子，部分胞外蛋白酶也具有直接致病性[15]。

傳統(tǒng)的廣譜抗生素不僅增加抗藥性，還會(huì)殺死體內(nèi)有益微生物[16]。免疫多糖既能提高動(dòng)物體自身免疫力，在避免這些問題的同時(shí)，還能抑制部分疾病的發(fā)生。本試驗(yàn)探究4種海藻多糖對(duì)鯽魚(Carassiusauratus)生長和免疫的影響，為飼料中添加多糖對(duì)鯽魚生長和免疫功效影響提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料與動(dòng)物

試驗(yàn)鯽魚由上海海洋大學(xué)青浦魚類育種試驗(yàn)站提供，規(guī)格為(50±5) g/尾。

嗜水氣單胞菌ATCC7966由上海海洋大學(xué)國家水生生物病原庫贈(zèng)送。

堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、球蛋白試劑盒，購買于邁瑞醫(yī)療國際有限公司

滸苔(E.prolifera)采自江蘇大豐海區(qū)，條斑紫菜(Porphyrayezoensis)采自江蘇如東海區(qū)，銅藻(Sargassumhorneri)采自浙江枸杞島，壇紫菜(P.haitannesis)采自福建福鼎海區(qū)。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BS-200全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞醫(yī)療國際有限公司)；低溫恒溫培養(yǎng)箱(三洋設(shè)備特約維修中心)；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.3 多糖制備

多糖的提取參考文獻(xiàn)[17]，洗凈烘干后的藻體用乙醇浸泡后，用篩絹過濾，所得藻體自然晾干，加蒸餾水至物料比為1∶40 (g/mL)浸泡，搗碎后，95 ℃恒溫，冷卻后用篩絹過濾和離心后，將清液添加乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為80%，靜置過夜，離心取沉淀，凍干得粗多糖。

1.4 飼料制備

試驗(yàn)使用的鯽魚普通飼料組即對(duì)照組配方見表1。粗蛋白含量31.01%，粗脂肪含量6.04%，試驗(yàn)組各組合添加物含量4%。各種成分充分混合，再加適量的水，采用冷擠壓技術(shù)，切成顆粒，空氣干燥，常溫保存。

表1 飼料配方 g/kg

1.5 飼養(yǎng)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

養(yǎng)殖設(shè)備為80 L的循環(huán)水養(yǎng)殖玻璃魚缸，隨機(jī)選取鯽魚220尾，暫養(yǎng)7 d后置于干凈的養(yǎng)殖水體中空腹2 d，使之充分排便和適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境，暫養(yǎng)期間每日喂食對(duì)照組飼料兩次(09:00和18:00)，總投喂量為體質(zhì)量的10%。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選健康鯽魚，分5個(gè)組養(yǎng)殖，每組4個(gè)平行，每個(gè)平行10尾。禁食1 d后，其中4個(gè)試驗(yàn)組分別喂食含滸苔多糖、條斑紫菜多糖、壇紫菜多糖和銅藻多糖的飼料，陰性對(duì)照組喂食對(duì)照組飼料。養(yǎng)殖周期為60 d[18]。養(yǎng)殖期間采用24 h連續(xù)充氣，自然周期采光。

1.6 免疫力檢測(cè)

測(cè)量試驗(yàn)前后鯽魚體質(zhì)量變化，時(shí)間點(diǎn)為鯽魚暫養(yǎng)兩天后剛分組時(shí)，及喂養(yǎng)60 d后，計(jì)算平均值。鯽魚喂養(yǎng)60 d后，每缸隨機(jī)選取3尾，解剖，完全剝離獲取脾臟，用吸水紙吸凈表面水分后，準(zhǔn)確稱量質(zhì)量，分別記錄對(duì)照組的脾臟平均質(zhì)量和試驗(yàn)組脾臟平均質(zhì)量，從而計(jì)算鯽魚的脾體比。

1.7 抗菌試驗(yàn)

鯽魚喂養(yǎng)60 d后，每缸隨機(jī)選取6尾，腹腔注射嗜水氣單胞菌(菌體密度約為106～107cfu/mL)0.15 mL。養(yǎng)殖24 h后每缸隨機(jī)選取3尾，尾鰭抽血，涂含細(xì)菌培養(yǎng)基的平皿，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察并記錄菌落數(shù)。剩余鯽魚養(yǎng)殖1周后尾鰭抽血，靜止過夜，取上清液，購試劑盒，采用BS-200全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞醫(yī)療國際有限公司)，測(cè)定堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白和球蛋白含量。

1.8 數(shù)據(jù)處理

質(zhì)量增加率/%=(m2-m1)/m2×100%

脾體比/%=m3/m×100%

式中，m1為鯽魚初始體質(zhì)量，m2為鯽魚終末體質(zhì)量，m3為鯽魚的脾臟質(zhì)量，m為鯽魚體質(zhì)量。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 不同試驗(yàn)組鯽魚生長

養(yǎng)殖60 d后，各組鯽魚體質(zhì)量均有所增加，壇紫菜組的終體質(zhì)量與其他組相比差異顯著(P<0.05)(表2)。與對(duì)照組相比，滸苔多糖、條斑紫菜多糖和銅藻多糖組對(duì)鯽魚的生長均有一定的促進(jìn)作用(P>0.05)，其中滸苔多糖對(duì)鯽魚的生長促進(jìn)作用最佳，質(zhì)量增加率比普通飼料組提高了47.50%(P<0.05)(圖1)。

表2 鯽魚體質(zhì)量變化 g

注：A: 對(duì)照組；B: 滸苔組；C: 條斑紫菜組；D: 銅藻組；E: 壇紫菜組. 同行數(shù)據(jù)上標(biāo)不同字母表示平均值間差異顯著(P<0.05).

圖1 不同組鯽魚質(zhì)量增加率A:對(duì)照組；B: 滸苔組；C: 條斑紫菜組；D: 銅藻組；E: 壇紫菜組. 圖中不同字母表示平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

2.2 脾臟指數(shù)變化

與對(duì)照組相比，4個(gè)試驗(yàn)組脾臟質(zhì)量指數(shù)均有增加，但差異不顯著(P>0.05)。

圖2 脾臟所占體質(zhì)量比例

2.3 免疫指標(biāo)變化

滸苔多糖組堿性磷酸酶、總蛋白、球蛋白含量較對(duì)照組升高(P<0.05)，其余組明顯下降(P<0.05)，4個(gè)試驗(yàn)組中的谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶含量低于陰性對(duì)照組(P<0.05)(圖3)。

圖3 堿性磷酸酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白、球蛋白含量

2.4 滸苔及4種試驗(yàn)藻體多糖對(duì)機(jī)體噬菌作用的抑促效果

鯽魚血涂板培養(yǎng)24 h后，滸苔組、銅藻組及壇紫菜組較對(duì)照組培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)明顯減少，且以滸苔多糖和銅藻多糖組最為顯著(P<0.05)(圖4)。

圖4 5組培養(yǎng)基上的菌落數(shù)

3 討 論

3.1 海藻多糖對(duì)鯽魚體質(zhì)量的影響

張銀花等[19]在鯽魚的飼料中添加0.15%黃芪多糖能夠促進(jìn)鯽魚體質(zhì)量增長。本研究滸苔組、條斑紫菜組、銅藻組對(duì)鯽魚體質(zhì)量的增加有著明顯的促進(jìn)作用，其中滸苔組的效果最為顯著，比普通飼料組提高了47.50%。

3.2 海藻多糖對(duì)鯽魚脾體比的影響

機(jī)體免疫能力的加強(qiáng)可提高機(jī)體對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)能力和對(duì)細(xì)菌病毒的抵抗能力。脾臟作為機(jī)體的主要免疫器官之一，脾體比增加，在一定程度上說明機(jī)體的免疫能力有所增強(qiáng)，在喂養(yǎng)異育銀鯽的飼料中添加一定量的黃芪多糖，能夠提高試驗(yàn)魚脾臟指數(shù)[20]。本試驗(yàn)在飼料中添加4種海藻多糖，發(fā)現(xiàn)4個(gè)試驗(yàn)組的脾臟所占比相對(duì)普通飼料組均有所增加，其中滸苔組和條斑紫菜組效果最為顯著，增加率分別能夠達(dá)到23.76%和27.73%，這一試驗(yàn)結(jié)果也與Wei等[21-22]的研究結(jié)果相一致，表明這4種海藻多糖均能夠刺激機(jī)體免疫器官的發(fā)育，從而達(dá)到加強(qiáng)機(jī)體免疫力的效果。

3.3 海藻多糖對(duì)鯽魚免疫指標(biāo)的影響

海藻多糖具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。堿性磷酸酶是高等動(dòng)物體內(nèi)巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝，加速物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)移，溶酶體的水解作用是機(jī)體攻擊異物的主要機(jī)制之一[23]。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶是肝臟受損的靈敏指標(biāo)[24]，二者活性的降低說明4組飼料中的添加的多糖均對(duì)肝臟起到了保護(hù)作用。總蛋白的升高，主要成分是球蛋白的升高，體內(nèi)有細(xì)菌或病毒存在，這些病原體產(chǎn)生的抗原，都可以刺激淋巴細(xì)胞產(chǎn)生一些球蛋白抗體。徐賢柱等[25]采用杜仲葉多糖對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)多糖可以顯著提高小鼠血清中免疫球蛋白G和免疫球蛋白M的含量。Matsumoto等[26]從銀柴胡根中提取出1種果膠多糖并研究了其可以促進(jìn)B淋巴細(xì)胞周期蛋白表達(dá)。因此球蛋白的含量直接影響著機(jī)體對(duì)細(xì)菌或病毒的清除能力。本試驗(yàn)表明，滸苔組可以提高堿性磷酸酶和血清中球蛋白總含量，從而達(dá)到提高鯽魚抵抗病毒的能力。血清中細(xì)菌數(shù)量的減少說明機(jī)體的抗病毒能力得到提高。血清中細(xì)菌的數(shù)量也反映出機(jī)體對(duì)病毒的清除能力，也是自身抗病毒能力的直接體現(xiàn)，滸苔組和銅藻組有效地抑制病毒在體內(nèi)生長，提高了機(jī)體的抗病毒能力。

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EffectsofDietarySupplementationofFourAlgaPolysaccharidesonGrowthandDiseaseResistanceinCrucianCarpCarassiusauratus

GENG Zhonglei1, YANG Yayun1, CAI Chuner1,2, HE Peimin1,2

( 1. College of Marine Ecology and Environment, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China； 2. Collaborative Innovation Centre of Colleges in Jiangsu Province, Lianyungang 222005, China )

Crucian carpCarassiusauratuswere randomly divided into four groups and fed diet containing polysaccharides from algaeEnteromorphaprolifera,Porphyrayezoensis,SargassumhorneriandP.haitanensisto research effects of four alga polysaccharides on growth and immunity of the fish. After 60 day culture, the body weight was recorded again, and the speen in some samples was also weighted after dissection. The rest fish were injected withAeromonashydrophilaat 107cfu/mL and reared for another one day. The bacterial number and activities of alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, and alanine aminotransferase, and total protein and globulin levels were analyzed in blood. The results showed that there were higher weight gain rates in the fish fed the diets containingE.prolifera,P.yezoensisandS.hornerithan that in control group, with the maximum of 47.5% inE.proliferagroup. The spleen—somatic index in all groups were elevated, especially in theE.prolifera(23.8%) andP.yezoensis(27.7%) groups. On the contrary, the number ofA.hydrophilain blood was lower in all groups than that in control group. The biochemical test indicated that the content of total protein and globulin in blood of the fish inE.proliferagroup were to some extent higher than that in other groups.It is concluded that all the four kinds of seaweed polysaccharides have potential to promote the growth and immunity of crucian carp.

alga polysaccharide;Carassiusauratus; weight gain rate; spleen somatic index

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.010

S965.117

A

1003-1111(2017)06-0753-05

2016-09-13；

2017-03-13.

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAC07B03)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFC1402105)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41576163)；上海海洋大學(xué)博士啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(A2-0203-00-100322).

耿中雷(1990—)，男，碩士研究生；研究方向：海洋生物活性物質(zhì)制備與應(yīng)用.E-mail:654384357@qq.com. 通訊作者：何培民(1959—)，男，教授；研究方向：海藻資源化利用、藻類分子技術(shù). E-mail:pmhe@shou.edu.cn.