馬 濤，羅國芝,2,3，譚洪新,2,3 ，陳 偉

( 1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái) 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物育種中心，上海 201306 )

堿度對水產(chǎn)養(yǎng)殖絮體生物學(xué)特性及氨氮轉(zhuǎn)化的影響

馬 濤1，羅國芝1,2,3，譚洪新1,2,3，陳 偉1

( 1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306； 2.上海水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái) 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物育種中心，上海 201306 )

在異位式生物絮凝反應(yīng)器中，添加鰻鱺循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中收集的殘餌糞便進(jìn)行生物絮體培養(yǎng)，用碳酸氫鈉和1 mol/L HCl控制反應(yīng)器中的堿度水平(以CaCO3計(jì))為：a組≥250 mg/L、b組150～200 mg/L、c組75～100 mg/L，研究堿度對絮體形成過程中3種形態(tài)氮含量、絮體的氮素轉(zhuǎn)化及粗蛋白、粗脂肪和胞外聚合物含量的影響，用IlluminaMiseq測序技術(shù)檢測了絮體微生物群落的多樣性。試驗(yàn)結(jié)果表明，堿度150～200 mg/L試驗(yàn)組絮體氮素轉(zhuǎn)化率[(70.84±7.67)%]、粗蛋白含量[(36.74±0.59)%]、疏松結(jié)合胞外聚合物和緊密結(jié)合胞外聚合物中蛋白質(zhì)與多糖比和絮體原核、真核微生物群落 Shannon多樣性指數(shù)均優(yōu)于其他試驗(yàn)組。將堿度提高至逾150 mg/L，可促使反應(yīng)器中的硝化作用。3組絮體中具有顯著性差異的原核微生物優(yōu)勢菌群為變形菌門和Saccharibacteria門，3個(gè)試驗(yàn)組中變形菌門的比例分別為45.96%、27.81%、80.07%；絮體真核微生物具有顯著性差異的優(yōu)勢菌群為子囊菌門和纖毛蟲門，3個(gè)試驗(yàn)組中纖毛蟲門的比例分別為7.24%、0.43%、14.85%。異位式生物絮體培養(yǎng)過程中堿度應(yīng)控制在150 mg/L以上時(shí)，絮體微生物多樣性增加，氮素轉(zhuǎn)化效率增高。

堿度；殘餌糞便；生物絮體；IlluminaMiseq測序；微生物群落

近年來，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，高密度集約化養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，養(yǎng)殖廢水及水產(chǎn)動(dòng)物排泄物肆意排放等問題嚴(yán)重制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康穩(wěn)定發(fā)展，也污染了生態(tài)環(huán)境。研究證明，生物絮凝技術(shù)可調(diào)控水體營養(yǎng)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)異養(yǎng)細(xì)菌的繁殖，利用微生物同化無機(jī)氮轉(zhuǎn)化為細(xì)菌蛋白，凈化水質(zhì)、減少換水量；通過細(xì)菌絮凝成顆粒，成為部分濾食性養(yǎng)殖對象的食物，降低飼料系數(shù)；提高動(dòng)物免疫和生態(tài)防病，是解決水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的環(huán)境制約和飼料成本的有效技術(shù)。

在水產(chǎn)生物的絮體形成中，異養(yǎng)細(xì)菌和硝化細(xì)菌消耗無機(jī)碳源，使堿度(以CaCO3計(jì))、pH降低[1-2]。從絮體形成的理論方程式：NH4++1.18C6H12O6+HCO3-+2.06O2→C5H7O2N+6.06H2O+3.07CO2，可知異養(yǎng)微生物轉(zhuǎn)化1 g氨氮需消耗3.57 g堿度(0.86 g無機(jī)碳)[3]。自養(yǎng)細(xì)菌的硝化作用在生物絮凝系統(tǒng)中很常見[4-5]。理論上完全硝化1 g氨氮需要消耗7.07 g堿度(1.69 g無機(jī)碳)[6]，主要消耗在氨氮氧化為亞硝態(tài)氮過程，因此補(bǔ)充足夠的堿度是保證異養(yǎng)細(xì)菌和硝化細(xì)菌完成生物絮凝的前提。

Boyd等[7]發(fā)現(xiàn)，堿度只要高于75 mg/L就可以形成絮體；Chen等[6]認(rèn)為，水產(chǎn)生物絮凝系統(tǒng)中堿度應(yīng)維持在100～150 mg/L，高于200 mg/L時(shí)有益于絮體的形成。Furtado等[8]研究了生物絮凝系統(tǒng)中堿度對水質(zhì)的影響，證實(shí)當(dāng)堿度低于100 mg/L，pH<7時(shí)，水體中氨氮和亞硝態(tài)氮含量比堿度為150～300 mg/L條件下高。上述研究均未見堿度對生物絮體微生物的影響。本研究利用花鰻鱺(Anguillamarmorata)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)固體廢棄物，通過向異位序批式生物絮凝反應(yīng)器中添加碳酸氫鈉控制反應(yīng)器中堿度來培養(yǎng)絮體，監(jiān)測堿度對生物絮體形成過程中氮素轉(zhuǎn)化、絮體的生物學(xué)特性及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為生物絮凝技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)共用9個(gè)相同的圓柱形聚乙烯生物絮凝反應(yīng)器(內(nèi)徑15 cm,高15 cm，有效容積11 L)，每個(gè)反應(yīng)器裝一個(gè)石英沙聚合曝氣石(直徑3 cm，高3.5 cm)，3個(gè)曝氣石連接到一臺(tái)電磁式空氣壓縮機(jī)(型號(hào)ACO-008，135 W，100 L/min,浙江森森有限公司)。

殘餌糞便取自上海海洋大學(xué)花鰻鱺循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)的固液分離裝置，投喂鰻魚黑仔配合飼料。飼料水分≤10.0%，粗蛋白質(zhì)≥48.0%，粗脂肪≥4.0%，粗纖維≤3.0%，粗灰分≤17.0%，總磷1.0%～2.8%(數(shù)據(jù)由廠家提供)。收集的殘餌糞便經(jīng)過65 ℃烘干，測得粗蛋白質(zhì)(34.25±0.20)%，粗脂肪(6.55±0.71)%，粗灰分(61.91±0.4)%。

試驗(yàn)開始前，向一聚乙烯桶中添加適量殘餌糞便和曝氣自來水，混勻，測得初始總懸浮固體物含量為3500 mg/L，之后轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中培養(yǎng)30 d。添加葡萄糖為碳源，維持反應(yīng)器中碳氮比15以上，以溶解有機(jī)碳∶氨氮含量計(jì)算，溫度23～25 ℃，溶解氧6.5～8.6 mg/L。

通過碳酸氫鈉和1 mol/L HCl的比例控制反應(yīng)器中堿度(以CaCO3在3個(gè)處理組水平：a組≥250 mg/L; b組150～200 mg/L; c組75～100 mg/L;每組設(shè)3個(gè)重復(fù))。試驗(yàn)期間每日向反應(yīng)器中加純水至10 L，補(bǔ)充蒸發(fā)和采樣損失的水。

1.2 測定指標(biāo)與方法

試驗(yàn)期間，每日9:00用Multi3430型多參數(shù)水質(zhì)分析儀測定反應(yīng)器中溫度、溶解氧含量和pH。試驗(yàn)前7 d每日9:00從系統(tǒng)取水經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，測氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、溶解有機(jī)碳含量，系統(tǒng)穩(wěn)定后每2 d測定一次。氨氮含量用納氏試劑分光光度法(型號(hào)UV2000，上海優(yōu)尼科，中國)、亞硝態(tài)氮含量采用鹽酸萘乙二胺比色法、硝態(tài)氮含量采用N-(1-萘基)-紫外分光光度法、溶解有機(jī)碳含量采用總有機(jī)碳分析儀測定(N/C?2100，analytikjenamulti，德國)。每日9:00和20：00用酸堿指示劑滴定法測定系統(tǒng)堿度變化并進(jìn)行調(diào)節(jié)。

每2 d測定反應(yīng)器中總懸浮固體顆粒物、揮發(fā)性懸浮固體含量、生物絮體沉降性能，觀察絮體形態(tài)、提取疏松結(jié)合胞外聚合物和緊密結(jié)合胞外聚合物；測定絮體粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量?？倯腋」腆w顆粒物和揮發(fā)性懸浮固體含量采用稱量質(zhì)量法測定。殘餌糞便和絮體經(jīng)65 ℃干燥后使用元素分析儀測定碳、氮含量。粗灰分通過馬福爐550 ℃灼燒4 h測定。粗脂肪采用氯仿—甲醇溶液(2∶1，體積比)抽提法測定。粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量均按照絮體干質(zhì)量測定和計(jì)量(%)。在奧林帕斯體視鏡(Olympus SZ2-STS)、掃描電子顯微鏡(S3400NII，日本日立公司，日本)下觀察絮體的形態(tài)、拍照。參照文獻(xiàn)[9]的方法提取及測定胞外聚合物的含量。

試驗(yàn)第30 d取生物絮體進(jìn)行原核及真核微生物高通量測序。使用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(美國OMEGA Biotek公司)提取絮體基因組DNA，針對16S rRNA、18S rRNA基因，合成帶有barcode的特異引物。PCR采用TransGen AP221-02：TransStartFastpfu DNA聚合酶反應(yīng)體系。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，TrisHCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結(jié)果，用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)定量檢測PCR產(chǎn)物，按照每個(gè)樣本的測序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，之后采用Illumina公司的Miseq進(jìn)行測序分析(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成)。

2 結(jié) 果

2.1 3組系統(tǒng)堿度的控制及水中3種形態(tài)氮含量的變化

將混勻的殘餌糞便添加到反應(yīng)器中時(shí)3組水體堿度相同，初始平均堿度為355.56 mg/L，加酸使3組堿度分別達(dá)到試驗(yàn)設(shè)置水平(圖1)。2～6 d 3組系統(tǒng)堿度持續(xù)降低，每日分別需補(bǔ)充碳酸氫鈉，第3 d 3組平均降至41.95 mg/L。第4 d，堿度開始緩慢回升，堿度75～100 mg/L組開始穩(wěn)定，其他兩組還需要加堿，在第6 d后穩(wěn)定且維持在試驗(yàn)設(shè)置的水平。

圖1 3組反應(yīng)器水中堿度的變化

3組反應(yīng)器運(yùn)行期間3種形態(tài)氮質(zhì)量濃度變化趨勢相同，但堿度75～100 mg/L組質(zhì)量濃度與其他兩組間存在明顯差異。微生物對殘餌糞便的降解使得各反應(yīng)器中氨氮釋放，第2 d堿度≥250 mg/L組和堿度150～200 mg/L組的氨氮質(zhì)量濃度達(dá)最高(24.05 mg/L和31.93 mg/L)，第6 d降至0.22 mg/L和0.15 mg/L，之后均保持在3.5 mg/L以下，啟動(dòng)階段這兩組中氨氮的轉(zhuǎn)化率分別為88.5%和99.53%；堿度75～100 mg/L組氨氮變化速度較其他兩組緩慢，在第3 d達(dá)最高(37.20 mg/L)，第7 d降至0.99 mg/L，轉(zhuǎn)化率為97.34%，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)質(zhì)量濃度維持在6 mg/L以下。各組反應(yīng)器均發(fā)生了明顯的硝化作用，第5 d堿度≥250 mg/L組和堿度150～200 mg/L組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度達(dá)最高，為40.68 mg/L、43.50 mg/L，明顯高于堿度75～100 mg/L組(18.28 mg/L)，之后前兩組亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度快速下降，至第14 d 后趨于穩(wěn)定，質(zhì)量濃度均低于0.05 mg/L。第14、15 d堿度75～100 mg/L組堿度異常升高，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度升至23.20 mg/L，第18 d降低并穩(wěn)定。試驗(yàn)中硝態(tài)氮含量不斷變化，3個(gè)試驗(yàn)組的最高質(zhì)量濃度分別為38.30 mg/L、48.43 mg/L和30.37 mg/L，在第16 d開始發(fā)生了明顯的反硝化作用，未發(fā)生積累，至第20 d 3組硝態(tài)氮質(zhì)量濃度均降至0.05 mg/L以下。

圖2 3個(gè)試驗(yàn)組反應(yīng)器水中3種形態(tài)氮質(zhì)量濃度的變化

2.2 絮體氮素轉(zhuǎn)化率和營養(yǎng)成分含量

隨著糞便分解和氨化作用的進(jìn)行，試驗(yàn)第2 d 3個(gè)試驗(yàn)組分別有氮(884.70±17.01) mg、(906.28±18.21) mg和(915.60±30.9) mg釋放在反應(yīng)器中，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，3個(gè)試驗(yàn)組絮體中每克揮發(fā)性懸浮物分別含有氮(563.66±24.17) mg、(642.01±12.37 ) mg和(542.45±11.89) mg。氮素轉(zhuǎn)化率[10](終末絮體中每克揮發(fā)性懸浮物所含氮/初始總氮)分別為(63.71±4.98)%、(70.84±7.67)%、(59.25±6.36)%，說明生物絮凝可將水產(chǎn)養(yǎng)殖固體廢棄物中氮素有效轉(zhuǎn)化，堿度150～200 mg/L組高于其他兩組。

培養(yǎng)第14 d時(shí)絮體的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量如表1。堿度≥250 mg/L組和堿度150～200 mg/L組粗蛋白含量高于培養(yǎng)初期殘餌糞便中的粗蛋白含量(34.25%)，堿度150～200 mg/L組粗蛋白含量顯著高于其他兩組。3組絮體粗脂肪含量均比培養(yǎng)初期殘餌糞便粗脂肪含量高。3組絮體粗灰分含量明顯低于培養(yǎng)初期殘餌糞便粗灰分含量。

表1 第14 d不同堿度組絮體的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量

注：表中同一列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，余同.

2.3 絮體的外觀形態(tài)

在顯微鏡和電鏡下觀察，培養(yǎng)初期的固體廢棄物是粒徑較大、緊致的顆粒，充滿了有機(jī)碎屑，隨著微生物的分解逐漸發(fā)展成為以絲狀菌、菌膠團(tuán)為骨架的團(tuán)狀物，結(jié)構(gòu)松散，大小有幾微米到幾百微米，甚至超過1000 μm。堿度≥250 mg/L組和堿度150～200 mg/L組絮體結(jié)構(gòu)松散、邊緣模糊，含大量絲狀菌；堿度75～100 mg/L組絮體粒徑較小、結(jié)構(gòu)緊密、邊緣整齊，以菌膠團(tuán)為主。對絮體形成動(dòng)態(tài)進(jìn)行觀察時(shí)發(fā)現(xiàn)，堿度75～100 mg/L組微生物的量明顯減少，但纖毛蟲類的數(shù)量增多，與真核域的檢測結(jié)果一致，堿度≥250 mg/L組和堿度150～200 mg/L組中含有原生動(dòng)物的卵、藻類、輪蟲、砂殼蟲、線蟲較堿度75～100 mg/L組多(圖3，圖4)。

2.4 絮體胞外聚合物含量

利用超聲波—高速離心法提取生物絮體的疏松結(jié)合胞外聚合物和緊密結(jié)合胞外聚合物。第6 d 3組中氨氮含量降低時(shí)的胞外聚合物含量見表2。絮體胞外聚合物的主要組成部分是蛋白質(zhì)和多糖，DNA 所占比例最少，蛋白質(zhì)主要存在于緊密結(jié)合胞外聚合物中。包裹著疏松結(jié)合胞外聚合物的異養(yǎng)活性污泥表面負(fù)電性強(qiáng)且疏水性差，不利于生物絮凝，緊密結(jié)合胞外聚合物通過疏水性與菌細(xì)胞緊密結(jié)合在一起，絮凝性能和吸附污染物質(zhì)的能力更強(qiáng)[11-12]。目前，較多研究發(fā)現(xiàn)，胞外聚合物的蛋白質(zhì)與多糖質(zhì)量濃度比與污泥表面性質(zhì)有相關(guān)性，比值越高，越有利于絮狀污泥絮凝，其脫水性能越差[13]。堿度150～200 mg/L組絮體胞外聚合物蛋白質(zhì)/多糖比值最高，且與其他兩組有顯著性差異。

圖3 第24 d時(shí)3組絮體在顯微鏡下的形態(tài)(×200倍)

圖4 第24 d 時(shí)3組絮體在電子顯微鏡下的形態(tài)(×5000倍)

2.5 絮體微生物群落

2.5.1 樣品序列數(shù)目和多樣性

絮體細(xì)菌16S序列數(shù)目和平均長度分別為：堿度≥250 mg/L組，40 956條、434.38 bp；堿度150～200 mg/L組，32 623條、434.58 bp；堿度75～100 mg/L組，38 450條、443.76 bp。真核18S 序列數(shù)目和平均長度分別為：堿度≥250 mg/L組，3214條、400.85 bp；堿度150～200 mg/L組，29 155條、401.0 bp；堿度75～100 mg/L組，40 319條、400.59 bp。用Usearch對序列進(jìn)行歸類操作，按照97%相似性得到OTU的代表序列，利用Mothur軟件計(jì)指數(shù)分析，通過單樣品的多樣性分析可以反映微生物的豐度和多樣性(表3)。細(xì)菌16S OTU數(shù)量和微生物豐度排序?yàn)椋簤A度≥250 mg/L組>堿度150～200 mg/L組>堿度75～100 mg/L組；真菌18S OTU數(shù)量和微生物豐度排序?yàn)椋簤A度75～100 mg/L組>堿度≥250 mg/L組>堿度150～200 mg/L組。Shannon值是估算樣品中微生物多樣性指數(shù)之一，其值越大，說明群落多樣性越高。利用3組絮體的測序量在不同測序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線，當(dāng)曲線趨向平坦時(shí)，說明測序數(shù)據(jù)量足夠大，可以反映絮體中絕大多數(shù)的微生物物種信息。Shannon指數(shù)曲線表明(圖5)，堿度150～200 mg/L組細(xì)菌16S多樣性指數(shù)最優(yōu)，Shannon值最高4.35，Simpson值最低0.03；3組絮體真菌18S多樣性整體較低，相對于其他兩組，堿度150～200 mg/L組Shannon值最高1.4，Simpson值最低0.33，可知堿度150～200 mg/L組絮體原核、真核微生物多樣性最高。

表3 不同堿度組絮體原核16S、真核18S的 OTU 數(shù)量及 alpha 多樣性

圖5 原核16S(左)、真核18S(右)多樣性Shannon 指數(shù)曲線

2.5.2 微生物群落組成分析

絮體中原核、真核微生物各門的分布情況見表4。由表4可見，3組絮體原核微生物主要隸屬于8個(gè)菌門，分別為變形菌門、Saccharibacteria門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門、厚壁菌門、疣微菌門、浮霉菌門，不同堿度的3組絮體所含微生物在門水平上相似，但堿度75～100 mg/L組所占比例與其他兩差異顯著。

A組生物絮體原核微生物包括205個(gè)菌屬，相對豐度大于1% 的有18個(gè)屬，其中相對豐度大于10%的2個(gè)菌屬，分別是Saccharibacteria_norank占21.2%和突柄微菌屬(Prosthecomicrobium)占12.28%；堿度150～200 mg/L組生物絮體原核微生物包括187個(gè)菌屬，相對豐度大于1% 的有19個(gè)屬，其中相對豐度大于10%的2個(gè)菌屬，分別為Saccharibacteria_norank占21.3%和Caldilineaceae_uncultured占12.36%；堿度75～100 mg/L組生物絮體原核微生物包括162個(gè)菌屬，相對豐度大于1%的有11個(gè)屬，其中相對豐度大于10%的菌屬有1個(gè)，是克雷伯氏菌屬(Klebsiella)占61.19%。3組生物絮體真核微生物所包含的屬分別為: 堿度≥250 mg/L組，18個(gè)；堿度150～200 mg/L組，15個(gè)；堿度75～100 mg/L組，16個(gè)。3組中優(yōu)勢菌群及所占比例分別為瓶霉屬(Phialophora)43.56%、47.58%、60.16%和糞殼菌綱—未分類43.06%、28.98%、15.89%。原核、真核微生物屬的分布情況見圖6，其中相對豐度低于1%的菌屬合并為其他。

表4 不同堿度組絮體原核和真核微生物各門的豐度 %

圖6 3組樣品微生物中不同屬的原核16S(左)和真核18S(右)的分布

3 討 論

3.1 堿度對生物絮體培養(yǎng)水質(zhì)參數(shù)的影響

通常認(rèn)為水產(chǎn)養(yǎng)殖生物絮凝系統(tǒng)中碳氮比、溫度、溶解氧、pH 等決定了水體中微生物分解作用的強(qiáng)弱。本試驗(yàn)中，反應(yīng)器中懸浮固體顆粒物含量高，隨著其分解氨氮快速增加，堿度降低，要維持較高堿度，則需要頻繁大量加堿。提高堿度可促進(jìn)氨化與硝化作用，緩沖水體pH，為微生物快速增長提供了穩(wěn)定環(huán)境。王大鵬等[14]在零換水生物絮凝養(yǎng)殖凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)時(shí)發(fā)現(xiàn)，將堿度提高至100 mg/L以上，細(xì)菌數(shù)量明顯增加，能有效提高水處理效果。當(dāng)系統(tǒng)啟動(dòng)階段結(jié)束，氨氮含量降低并穩(wěn)定，細(xì)菌將水中氮素轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，隨之系統(tǒng)的堿度也維持穩(wěn)定狀態(tài)。

3.2 堿度對生物絮體生物學(xué)特性的影響

生物絮體含有大量細(xì)菌、原生動(dòng)物、藻類等微型生物群體，其中活的生物體占10%～90%[15]，而原生動(dòng)物、輪蟲是生物絮體系統(tǒng)中的捕食者，在活性污泥凈化廢水中被用作“指示生物”，一方面通過捕食生物絮體中的細(xì)菌，促使細(xì)菌保持生長期，延緩衰老，優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)，同時(shí)捕食水體中不能自由沉降去除的小于10 μm粒徑的懸浮顆粒物質(zhì)，增強(qiáng)除氮凈水能力。另一方面能分泌黏性代謝物質(zhì)，吸附水中的懸浮顆粒，促使絮狀凝結(jié)[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，堿度為75～100 mg/L下纖毛蟲類原生動(dòng)物增多，形成的絮體較密實(shí)，堿度大于150 mg/L下輪蟲數(shù)量增多，因此可通過調(diào)節(jié)堿度來控制理想微型動(dòng)物的種類和數(shù)量，解決生物絮體老化等問題。堿度不同使生物絮凝系統(tǒng)產(chǎn)生了不同的菌群結(jié)構(gòu)，不同微生物分泌的胞外聚合物含量不同，堿度為150～200 mg/L這種較溫和的環(huán)境下，微生物分泌較多的胞外聚合物，且蛋白與多糖比較高，有利于絮體形成。絮體粗蛋白和粗脂肪含量達(dá)到了羅非魚(Oreochromis)的生長需求?？梢娧h(huán)水高密度養(yǎng)殖鰻鱺固體廢棄物基質(zhì)含量高，生物絮體資源化可利用度佳。

3.3 堿度對生物絮體原核與真核微生物的影響

本試驗(yàn)中，水產(chǎn)生物絮體中變形細(xì)菌門的數(shù)量占主導(dǎo)地位，與夏耘等[5, 17]的結(jié)果一致，但不同堿度系統(tǒng)中變形細(xì)菌門所占比例有較大差異,尤其是堿度為75～100 mg/L下培養(yǎng)的絮體，變形菌屬在細(xì)菌組成上占支配地位，其中克雷伯氏菌屬占 61.19%。該屬具有固氮作用[18]，此門細(xì)菌是污水處理系統(tǒng)中去除污染物的優(yōu)勢菌種，說明生物絮體能高效調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖的水質(zhì)。Kindaichi等[19]研究了活性污泥中Saccharibacterium門細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育多樣性和生理機(jī)能。結(jié)果表明是一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育不同的群體，之前劃分在TM7門，Saccharibacteria在有機(jī)化合物的降解中發(fā)揮作用，在有氧、缺氧和以硝酸鹽作電子受體條件下能吸收葡萄糖，一些種屬還可以利用N-乙酰葡糖胺、油酸、氨基酸和丁酸，一些絲狀Saccharibacteria表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶和脂肪酸的活性，但是Saccharibacteria不吸收乙酸、丙酮酸、丙酸、甘油和乙醇。本試驗(yàn)以葡糖糖為碳源培養(yǎng)絮體，堿度為150～200 mg/L和大于250 mg/L組Saccharibacteria所占比例分別為21.2%和21.3%，75～100 mg/L組中僅含2.29%, 說明高堿度下有利于Saccharibacteria生長，充分利碳源—葡萄糖，同時(shí)堿度大于250 mg/L組和150～200 mg/L組絮體中絲狀菌較多，也是此細(xì)菌所占比例較多所致。厚壁菌門以芽孢桿菌(Bacillus)為主，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)堿度對此門細(xì)菌的含量影響差異不顯著。芽孢桿菌分泌的蛋白酶和淀粉酶可以分解污水中的大分子有機(jī)物，在特性條件下產(chǎn)生的細(xì)菌素對某些致病菌有抑制作用。本試驗(yàn)中不同堿度條件下均未檢測到弧菌屬(Vibrio)等病原菌。細(xì)菌介導(dǎo)參與厭氧氨氧化，使得亞硝酸鹽和銨可以直接轉(zhuǎn)化成氮?dú)?，因此可以去除廢水處理中的氨氮，執(zhí)行此過程的細(xì)菌均屬于浮霉菌門[20]。本試驗(yàn)中，堿度為150～200 mg/L組浮霉菌門細(xì)菌所占比例最大超過1%，真菌作為生物絮體重要組成部分。大量研究表明，許多淡水子囊菌的子囊孢子具有膠狀的鞘、附著絲，在水里會(huì)伸展的很長，成為水體中動(dòng)物的食物，構(gòu)成生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈[21]。本試驗(yàn)檢測到絮體中超過80%的真菌均屬于子囊菌門，其中分類位置未定的糞殼菌屬(Sordaria)占主導(dǎo)地位，能夠分解纖維素和木質(zhì)素等固體基質(zhì)，促進(jìn)殘餌糞便分解形成生物絮體。

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EffectofAlkalinityonNitrogenConversionandBiologicalCharacteriztionofBioflcsinBioflocculationProcessinAquaculture

MA Tao1, LUO Guozhi1,2,3, TAN Hongxin1,2,3,CHEN Wei1

( 1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;2. Shanghai Aquacultural Engeering Research Center, Shanghai 201306, China;3. Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai University Knowledge Service Platform,Shanghai 201306, China )

Sodium bicarbonate and 1 mol/L hydrochloric acid (HCl) were regularly added into a reactor containing solid wastes including feed remnants and feces collected from a system of eelAnguillamarmorataculture at various alkalinities (CaCO3/L) of ≥250 in Group a, 150—200 in Group B and 75—100 mg in Group c with three replicates to cultivate bioflocs to evaluate changes in levels of three types of nitrogen and conversion rate of nitrogen by bioflocs, and contents of crude protein, crude fat, and extracelluar polymeric substances (EPS) in the bioflocs. The diversity of microbial communities in the bioflocs was detected by Illumina Miseqsequencing technology. The results showed that there were higher nitrogen conversion rate(70.84±7.67)%, crude protein content (36.74±0.59)% and the ratio of protein and polysaccharide in loosely bound-EPS (LB-EPS) and tightly bound-EPS (TB-EPS) and higher Shannon diversity index in prokaryotic and eukaryotic microbial community in Group b than those in Group a and Group c. The nitrification was promoted in the reactor where the alkalinity was increased to above 150 mg/L (CaCO3).ProteobacteriaandSaccharibacteriawere of the dominant bacteria with significant differences in prokaryotic community in flocs of the three groups,accounting for 45.96% in Group a, 27.81% in Group b, and 80.07% in Group c. In eukaryotic community, however,AscomycotaandCiliophorawere the dominant bacteria with significant differences,Ciliophorarepresenting 7.24% in Group a, 0.43% in Group b, and 14.85% in Group c. In conclusion，the high microbial diversity, and efficiency of nitrogen conversion in bioflocculation are found in the reactor at alkalinity of over 150 mg/L (CaCO3).

alkalinity; feces; biofloc; Illumina Miseq; microbial community

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.004

S912

A

1003-1111(2017)04-0421-08

2016-07-08；

2016-09-12.

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31202033)；上海市科技委員會(huì)資助項(xiàng)目 (14320501900).

馬濤(1990-),女,碩士研究生;研究方向:水產(chǎn)養(yǎng)殖重復(fù)利用. E-mail:mt1011207@163.com.通訊作者：羅國芝(1974-),女,副教授,博士;研究方向:水產(chǎn)養(yǎng)殖重復(fù)利用和循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)與工程.E-mail: gzhluo@shou.edu.cn.