王宏偉，楊麗坤，趙文博，李林鋒，邢清朝，謝恒輝

( 1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區(qū)楊村一中，天津 300000 )

諾氟沙星對中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響

王宏偉1，楊麗坤1，趙文博1，李林鋒1，邢清朝1，謝恒輝2

( 1.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 河北 保定 071002； 2.天津武清區(qū)楊村一中，天津 300000 )

在沉積物中均勻加入諾氟沙星，模擬研究了沉積物中諾氟沙星對中國圓田螺不同組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響。結(jié)果表明，諾氟沙星的處理使中國圓田螺各組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活性發(fā)生了變化，不同和相同含量諾氟沙星對同種或不同組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性的影響不同?？偟内厔轂椋旱秃恐Z氟沙星對肝、腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為前期誘導(dǎo)后期抑制；中、高含量諾氟沙星抑制腎、胃等組織氨基比林-N-脫甲基酶活性；諾氟沙星一直抑制卵巢和肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性。

中國圓田螺；諾氟沙星；氨基比林-N-脫甲基酶活性

諾氟沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥，近年廣泛用于防治水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害[1]，但殘留物對環(huán)境的影響不可忽略，尤其是沉積物對底棲生物造成影響[2]。這些殘留物經(jīng)過生物濃縮、生物放大等作用及食物鏈傳遞對人類健康也會有影響。中國圓田螺(Cipangopaludinachinensis)，俗稱螺螄、田螺，是中國各淡水水域的底棲生物，很多人喜食，對環(huán)境具有指示作用，但相應(yīng)的研究工作很少。本試驗?zāi)M中國圓田螺的生存環(huán)境，研究了沉積物中不同含量諾氟沙星對中國圓田螺肝、腎、胃、卵巢以及肌肉5種組織器官的藥物代謝Ⅰ相酶氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響[3]，以期探討諾氟沙星對中國圓田螺代謝的影響，為評價水產(chǎn)品對人類健康的安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國圓田螺取自河北白洋淀，平均質(zhì)量(5.89±1.75) g，殼高(31.40±5.08) mm，殼寬(18.81±1.88) mm，試驗前中國圓田螺暫養(yǎng)3 d，以適應(yīng)試驗環(huán)境。取12個2 L白瓷缸，每個缸放入經(jīng)高錳酸鉀溶液消毒過的細(xì)沙200 g，同時加入根據(jù)文獻(xiàn)[4]中諾氟沙星的環(huán)境含量范圍配制的諾氟沙星母液，按諾氟沙星與沉積物(細(xì)沙)質(zhì)量比分別為0 μg/g(空白對照組)、500 μg/g(低含量組)、1000 μg/g(中含量組)、1500 μg/g(高含量組)配制，每組3個平行。沿缸壁加曝氣水至150 mL，將其靜止24 h后，每個缸內(nèi)加入中國圓田螺10只。試驗過程中，水溫(23±1) ℃，pH 7.0～7.2，溶解氧10.1～10.3 mg/L。在試驗的第2、4、6、8、10 d分別測定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個組織中的氨基比林-N-脫甲基酶活力。測定各組螺肝、腎、胃、卵巢、肌肉5個組織中氨基比林-N-脫甲基酶活力時，各采3只螺(即每個平行取1只)，作為平行樣本，以減少誤差。解剖中國圓田螺，分別在肝、腎、胃、卵巢、肌肉等部位用解剖針和剪刀取10 μg組織，放入研缽中(4 ℃預(yù)冷)，加入990 μL蒸餾水[5]，研碎，制成1∶100(m/V)的組織勻漿，吸入1.5 mL離心管，4 ℃，3000 r/min離心10 min，取上清液。試驗用酶標(biāo)儀(普朗醫(yī)療器械公司)，諾氟沙星純度高于98%(天津市化學(xué)試劑一廠)，氨基比林-N-脫甲基酶測定試劑盒(上海滬尚生物科技有限公司)。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定法。

1.2 氨基比林-N-脫甲基酶活力測定

氨基比林-N-脫甲基酶活性的酶聯(lián)免疫吸附法測定：加樣參照表1。用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃恒溫箱溫育60 min，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜止1 min，甩去洗滌液，吸水紙上排干，重復(fù)洗板5次(表1)。15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔OD值(表2)。

表 1 氨基比林-N-脫甲基酶活力測定試劑盒加樣量及測定過程 μL

表2 不同含量標(biāo)準(zhǔn)品的OD值

氨基比林-N-脫甲基酶標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：根據(jù)表2操作測得120、60、30、15、7.5、0 U/L標(biāo)準(zhǔn)品的OD值。在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品含量作為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線(圖1)。

圖1 氨基比林-N-脫甲基酶標(biāo)準(zhǔn)品曲線

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果為3次測定值的平均值，數(shù)據(jù)誤差線為標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示處理組與對照組差異顯著，用*表示。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結(jié)果

中國圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化見圖2。由圖2可知，除低含量組(500 μg/g)第4、6 d和8 d外，其他試驗組均表現(xiàn)出顯著性差異，暴露第2 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高；第4 d時低含量組無顯著差異，中含量組(1000 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，高含量組(1500 μg/g)氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第6、8 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性無顯著變化，中、高含量組活性顯著下降；第10 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，另外兩試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降。這種變化表明，低含量諾氟沙星處理前期誘導(dǎo)肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性，中期影響不大；而中、高含量諾氟沙星在處理前期誘導(dǎo)氨基比林-N-脫甲基酶活性，后期表現(xiàn)為抑制，含量越高誘導(dǎo)作用持續(xù)時間越短。

圖2 中華圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化*表示與對照組比較有顯著性差異(P<0.05).余同.

2.2 腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結(jié)果

中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化見圖3。由圖3可知，低含量諾氟沙星暴露組第4 d時，中國圓田螺腎中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著上升，第8 d時，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，其余時間段無顯著影響。中含量諾氟沙星組除第8 d 氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著受抑制外，其余時間均為顯著誘導(dǎo)。高含量諾氟沙星組暴露第2 d和6 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，其余時間則顯著下降。這表示低含量諾氟沙星組腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性作用表現(xiàn)為先誘導(dǎo)后抑制；中含量諾氟沙星組影響的總趨勢為抑制作用；而高含量諾氟沙星組的作用與低含量組相似，呈先誘導(dǎo)后抑制。

2.3 胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結(jié)果

諾氟沙星對中國圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖4。由圖4可知，暴露第2 d時，低含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性上升，其余組氨基比林-N-脫甲基酶活性下降；第4 d時，低、中含量組酶活性上升，高含量組顯著下降；第6 d時，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，高含量組無明顯變化，第8 d時，各含量組酶活性達(dá)到峰值，各試驗組中氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降；第10 d時，試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對照組, 表明低含量諾氟沙星對胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為先誘導(dǎo)后抑制，高、中含量組對氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制。

圖3 中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

圖4 中國圓田螺胃組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.4 卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的測定結(jié)果

諾氟沙星對中國圓田螺卵巢組織中氨基比林-N-脫甲基酶的活性變化見圖5。由圖5可知，低含量諾氟沙星組在暴露第2、4、10 d時，氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著下降，第6、8 d時氨基比林-N-脫甲基酶含量顯著高于對照組；中含量諾氟沙星組處理第2 d氨基比林-N-脫甲基酶活性無顯著變化；第4 d酶活性顯著上升，其余時間顯著下降；高含量組除第10 d酶活性的受限制程度高于對照組，其他時間均顯著低于對照組，表明諾氟沙星對氨基比林-N-脫甲基酶活性均表現(xiàn)為抑制作用。

圖5 中國圓田螺卵巢組織氨基比林-N-脫甲基酶活性變化

2.5 肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶的測定結(jié)果

諾氟沙星對中國圓田螺肌肉組織中氨基比林-N-脫甲基酶活性的影響見圖6。由圖6可知，第2、4 d時各個試驗組氨基比林-N-脫甲基酶活性均低于對照組。第6、8 d時低含量組肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性無明顯影響，中含量組在第6 d時氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著高于對照組，第8 d時低于對照組；高含量組則相反；第10 d時，低、中含量組氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著低于對照組，高含量組則高于對照組。這表明諾氟沙星對肌肉組織氨基比林-N-脫甲基酶活性的作用為抑制作用。

3 討 論

低含量短時間的暴露處理使中國圓田螺肝臟中的氨基比林-N-脫甲基酶活性顯著升高，對氨基比林-N-脫甲基酶表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，這與Li 等[5]的試驗研究結(jié)果相似，而接下來的幾天與對照組沒有顯著性差異，這與其他研究結(jié)果不太一致，可能是由于中國圓田螺的機(jī)體適應(yīng)能力所致；當(dāng)暴露第10 d時酶的活性顯著上升，說明低含量的諾氟沙星可使中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性升高，進(jìn)而使其有更高的藥物代謝功能；中含量與高含量的諾氟沙星暴露試驗過程中分別在第6 d和第4 d以后顯示出對氨基比林-N-脫甲基酶的抑制作用，這種結(jié)果說明諾氟沙星對中國圓田螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性具有抑制作用，且這種抑制作用存在一定的時間和劑量效應(yīng), 這可能與藥物含量高、暴露時間長, 藥物在中國圓田螺體內(nèi)的殘留時間較長有關(guān)。

腎臟是生物的排毒器官，對藥物的排泄起重要的作用。本試驗結(jié)果表明，中、高含量組處理下中國圓田螺腎臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性先升后降再上升。初步認(rèn)為，由于天氣較熱，暴露環(huán)境中容易滋生細(xì)菌，對中國圓田螺的生長有很大的負(fù)面影響，諾氟沙星的殺菌作用有利于試驗組螺的存活，因此在暴露前期對照組酶活性低于這兩組的酶活。在試驗后期高含量組螺肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性低于空白組，說明藥物積累對中國圓田螺肝臟氨基比林-N-脫甲基酶的活性的負(fù)面影響，甚至比細(xì)菌的危害還要大。

在諾氟沙星的作用下，胃組織氨基比林-N-脫甲基酶的活性呈現(xiàn)出不規(guī)律的波動趨勢，總的趨勢還是先誘導(dǎo)后抑制，其原因可能是胃食物中的諾氟沙星對胃壁產(chǎn)生了影響，由于個體差異，每一只中國圓田螺的胃中的食物不可能完全一致，因此產(chǎn)生波動的趨勢，說明胃組織不適合作為藥物殘留或者酶活測定的指標(biāo)。

在諾氟沙星的作用下，卵巢的氨基比林-N-脫甲基酶活性全都表現(xiàn)出抑制的效應(yīng)。試驗時期為中國圓田螺的繁殖期，這個時期卵巢非常敏感，因此盡管在低含量作用前期，其氨基比林-N-脫甲基酶活性也是被抑制的狀態(tài)。

在諾氟沙星作用下，肌肉中氨基比林-N-脫甲基酶活性的變化趨勢與卵巢一樣，其原因可能是中國圓田螺的足直接與沉積物中的藥物接觸，諾氟沙星直接并快速對肌肉起作用，快速在肌肉中蓄積。

4 結(jié) 論

本試驗中，處理前期，各含量諾氟沙星對肝臟組織氨基比林-N-脫甲基酶活性有誘導(dǎo)作用，隨含量升高，藥物的誘導(dǎo)作用持續(xù)時間變短，誘導(dǎo)力度減小，后期則呈現(xiàn)抑制作用。在腎臟和胃組織中，低含量諾氟沙星對氨基比林-N-脫甲基酶活性先誘導(dǎo)后抑制，而中高含量對氨基比林-N-脫甲基酶為抑制作用。各含量諾氟沙星對敏感卵巢或直接接觸的肌肉氨基比林-N-脫甲基酶有抑制作用，含量越高抑制程度越大，但對中國圓田螺無明顯的致死效應(yīng)。低含量的諾氟沙星對中國圓田螺氨基比林-N-脫甲基酶活性有顯著誘導(dǎo)作用，可以有效降解其他毒性物質(zhì)，含量較高時不僅不能促進(jìn)解毒作用，甚至可能會因為抑制氨基比林-N-脫甲基酶活性而使其對其他藥物的抗性降低，并沿著食物鏈進(jìn)入人的生產(chǎn)生活中。因此，必須重視諾氟沙星以及其他抗生素的污染，及時有效治理。

[1] 王瑞旋, 陳畢生. 喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究概況[J]. 南方水產(chǎn), 2007, 3(3):73-79.

[2] 王宏偉，賴照，張潔，等. 水體沉積物中環(huán)境雌激素對底棲動物的影響[J].河北大學(xué)學(xué)報，2013，33(4)：443-448.

[3] 鹿金雁. 叔丁基對羥基茴香醚和諾氟沙星對水生生物的毒性效應(yīng)[D]. 廣州：暨南大學(xué), 2007.

[4] 趙建亮, 方怡向, 應(yīng)光國. 工業(yè)廢水毒性鑒定評價方法體系的建議及其應(yīng)用示例[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報, 2011, 20(3):549-559.

[5] Li D, Yang Y L, Zhang S J, et al. Effects of mammalian CYP3A inducers on CYP3A-related enzyme activities in grass carp (Ctenopharyngodonidellus):possible implications for the establishment of a fish CYP3A induction model[J]. Comp Biochem Physiol C:Toxicol Pharmacol, 2008, 147(1):17-29.

[6] 冷欣夫, 邱星輝. 細(xì)胞色素 P450 酶系的結(jié)構(gòu)、功能與應(yīng)用前景[M]. 北京：科學(xué)出版社, 2001.

[7] 陳大健, 王加才, 張萍, 等. 氟苯尼考對鯽魚CYP2E1活性影響的藥代動力學(xué)評價[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué), 2007, 37(3):269-273.

[8] 韓華, 李健, 李吉濤, 等. 喹諾酮類藥物對牙鲆肝藥物代謝酶活性的影響[J]. 海洋科學(xué), 2009, 33(11):48-54.

[9] 何秀婷, 程章, 聶湘平, 等. 諾氟沙星對阿部鯔鰕鯱Ⅰ相、Ⅱ相酶活性及CYP1A1和P-gp mRNA 表達(dá)影響[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2011,31(4):846-853.

[10] 張喆, 李健, 陳萍, 等. 諾氟沙星對中國明對蝦鰓和血清ECOD、氨基比林-N-脫甲基酶和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)活性的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(3):514-520.

EffectsofNorfloxacinonActivityofEnzymeAminopyrineN-Demethylase(APND)inSnailCipangopaludinachinensis

WANG Hongwei1, YANG Likun1, ZHAO Wenbo1, LI Linfeng1，XING Qingchao1，XIE Henghui2

( 1. College of Life Sciences,Hebei University, Baoding 071002, China；2. Middle School No. 1 at Yang Village, Wuqing District, Tianjin Municipality，Tianjin 300000，China )

The effects of norfloxacin blended in sediments on activity of aminopyrine N-demethylase(APND) were studied in different tissues of snailCipangopaludinachinensisin simulation. The results showed that different concentrations of sedimentary norfloxacin had different influence on the activity of the enzyme. For example，there were increase tendency in activities of enzyme in liver, kidney and stomach at the beginning of the experiment at low concentrations，and then decrease tendency, while the activities of enzyme in kidney and stomach were inhibited at middle and high concentrations of sedimentary norfloxacin. The activities of enzyme were shown to be declined in muscle and ovary.

Cipangopaludinachinensis；norfloxacin；aminopyrine-N-demethylase (APND)

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.04.020

S966.281

A

1003-1111(2017)04-0519-05

2016-07-08；

2016-09-12.

國家自然科學(xué)基金聯(lián)合資助項目(U1133005)；教育部留學(xué)回國基金資助項目(2014-2016)；河北省高層次人才項目(C2015003034)； 河北省自然科學(xué)基金資助項目(D2013201105)；河北省重點(diǎn)實驗室運(yùn)行補(bǔ)助費(fèi)資助項目(14967611D)；河北省生物學(xué)強(qiáng)勢特色學(xué)科建設(shè)項目(2016)；生物學(xué)河北省國家重點(diǎn)學(xué)科培育項目(2016)；河北大學(xué)中西部高校提升綜合實力工程項目(2016)；河北大學(xué)2016年國家級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610075014)；河北大學(xué)2016年研究生創(chuàng)新項目(X2016072)；河北大學(xué)2016年校級創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(2016084); 河北大學(xué)2016年實驗室開放項目(sy201662).

王宏偉(1970—)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，博士；研究方向：水生生物學(xué). E-mail：13722283189@126.com.