陳寧波 陳祥興 楊維仁* 姜淑貞 黃麗波

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

鐮刀菌毒素污染飼糧導(dǎo)致的斷奶仔豬肝臟損傷與自然修復(fù)研究

陳寧波1陳祥興2楊維仁1*姜淑貞1黃麗波1

(1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，泰安 271000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095)

本試驗旨在研究階段性飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧對仔豬血清和肝臟生化指標(biāo)、抗氧化指標(biāo)以及肝臟炎性細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)mRNA相對表達量的影響。選用體重為(8.45±0.94) kg的35日齡“杜×長×大”雌性仔豬30頭，隨機分為3組，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。對照組持續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼糧，鐮刀菌毒素組持續(xù)飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧(玉米赤霉烯酮0.90 mg/kg，嘔吐毒素1.43 mg/kg，煙曲霉毒素5.85 mg/kg)，自然恢復(fù)組在飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧35 d后，改飼喂基礎(chǔ)飼糧。預(yù)試期7 d，正試期56 d。結(jié)果表明：1)與對照組相比，鐮刀菌毒素組仔豬肝臟相對重量顯著升高(P<0.05)，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和堿性磷酸酶(ALP)活性顯著升高(P<0.05)，血清總蛋白(TP)和球蛋白(GLB)含量顯著降低(P<0.05)，血清谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、血清和肝臟總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性顯著下降(P<0.05)，血清和肝臟丙二醛(MDA)含量顯著升高(P<0.05)；肝臟炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。2)經(jīng)21 d自然恢復(fù)后，與鐮刀菌毒素組相比，自然恢復(fù)組仔豬肝臟相對重量有所降低(P>0.05)，血清AST、ALT和ALP活性顯著降低(P<0.05)，血清TP和GLB含量顯著升高(P<0.05)，血清T-SOD活性顯著升高(P<0.05)，血清和肝臟GSH-Px、肝臟T-SOD活性有所升高(P>0.05)，血清和肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05)，肝臟炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)。由此可見，本試驗條件下，長期飼喂鐮刀菌毒素能夠造成仔豬肝臟損傷，影響肝臟的抗氧化、蛋白質(zhì)合成和免疫功能，而經(jīng)過21 d恢復(fù)期，仔豬肝臟抗氧化和免疫功能得到了一定程度的改善。

鐮刀菌毒素；仔豬；肝臟損傷；白細(xì)胞介素-1β；白細(xì)胞介素-6

鐮刀菌毒素是鐮刀菌屬真菌在生長過程中產(chǎn)生的各種次級代謝產(chǎn)物的總和，是導(dǎo)致全球飼料業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟損失最大的一類霉菌毒素[1]，其中最常見的包括玉米赤霉烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)和伏馬菌素(FUM)等[2]。鐮刀菌毒素可對動物產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)，包括降低動物生產(chǎn)性能和營養(yǎng)物質(zhì)消化率、導(dǎo)致組織器官的代謝紊亂及對各類細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)等[3-5]。而鐮刀菌毒素在經(jīng)飲食攝入后，被運送到肝臟進行分解代謝[6]，因此肝臟的組織形態(tài)和功能變化常被作為鐮刀菌毒素中毒亞臨床診斷的重要依據(jù)。前人研究表明，鐮刀菌毒素能夠引起動物肝臟功能受損[7]，導(dǎo)致氧化應(yīng)激[8]和炎癥反應(yīng)的發(fā)生，并且造成肝細(xì)胞腫脹變性[9]以及血管管壁增厚和管腔擴張[10]等組織病理學(xué)損傷。研究發(fā)現(xiàn)肝臟的損傷與細(xì)胞因子的增加具有一定的關(guān)系[11-12]，但鐮刀菌毒素引起的斷奶仔豬肝臟損傷中細(xì)胞因子的表達量變化研究較少，且對肝臟損傷后自然恢復(fù)情況的研究也不明確。因此，本試驗通過研究鐮刀菌毒素對肝臟功能損傷的各項指標(biāo)及分子水平上細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)mRNA相對表達量的影響，探討鐮刀菌毒素對仔豬肝臟損傷的影響及其自然恢復(fù)情況，為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與設(shè)計

試驗選用體重為(8.45±0.94) kg的35日齡“杜×長×大”雌性仔豬30頭，隨機分為3組，各組間仔豬初始體重差異不顯著(P>0.05)，每組10個重復(fù)，每個重復(fù)1頭豬。對照組(control group)持續(xù)飼喂基礎(chǔ)飼糧，鐮刀菌毒素組(Fusariumtoxins group)持續(xù)飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧(玉米赤霉烯酮0.90 mg/kg，嘔吐毒素1.43 mg/kg，煙曲霉毒素5.85 mg/kg)；自然恢復(fù)組(natural recovery group)在飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧35 d后，改飼喂基礎(chǔ)飼糧。預(yù)試期7 d，正試期56 d。仔豬單欄飼養(yǎng)，每欄安裝有料槽和乳頭式飲水器便于仔豬自由采食和飲水。試驗在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實驗站進行。

1.2 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧參考NRC(2012)[13]仔豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)并根據(jù)實際生產(chǎn)配制，鐮刀菌毒素污染飼糧用霉變玉米和霉變玉米蛋白粉替代50%基礎(chǔ)飼糧中的玉米和玉米蛋白粉配制，飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provided the following per kg of diets：VA 3 300 IU，VD3330 IU，VE 24 IU，VK30.75 mg，VB11.50 mg，VB25.25 mg，VB62.25 mg，VB120.026 mg，泛酸 pantothenic acid 15.00 mg，尼克酸 niacin 22.5 mg，生物素 biotin 0.075 mg，葉酸 folic acid 0.45 mg，Mn 6.00 mg，F(xiàn)e 150 mg，Zn 150 mg，Cu 9.00 mg，I 0.21 mg，Se 0.45 mg。

2)粗蛋白為實測值，其余為計算值。CP was a measured value, while the others were calculated values.

所有試驗飼糧在試驗開始前一次性配齊，試驗開始和結(jié)束后分別取樣，用以分析飼糧中的毒素和粗蛋白質(zhì)含量[14]。飼糧中玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素(AFL)、伏馬毒素和T-2毒素采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和熒光技術(shù)進行測定，嘔吐毒素采用高效液相色譜法(HPLC)測定。試驗飼糧中主要霉菌毒素的含量見表2，黃曲霉毒素和T-2毒素未檢出。

表2 試驗飼糧中主要霉菌毒素的含量

“—”表示該毒素未檢出。

“—” shows that the toxin is not detected out.

1.3 試驗樣品的采集

試驗結(jié)束當(dāng)天早飼前對仔豬進行前腔靜脈空腹采血。血樣靜置30 min后離心(3 000 r/min、10 min)制備血清，分裝于Eppendorf管內(nèi)，-20 ℃保存，待測。采血后的仔豬電擊致死后放血，迅速剖開腹腔，在肝臟右葉內(nèi)側(cè)相同部位采集2份肝臟組織于凍存管中，迅速置于液氮中，再轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存，用于測定肝臟組織抗氧化指標(biāo)和RNA的提取。最后分離整個肝臟并稱重，計算肝臟相對重量。

肝臟相對重量(g/kg)=肝臟重量(g)/活體重量(kg)。

1.4 測定指標(biāo)與方法

1.4.1 血清生化指標(biāo)

用Cobus-Mira-Plus全自動生化分析儀進行血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性及總蛋白(TP)、球蛋白(GLB)含量的測定，具體方法嚴(yán)格按照試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書進行。

1.4.2 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)

稱取一定量肝臟組織，在冰面上解凍，按重量體積比為1∶9加入生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿(10 000～15 000 r/min)后，3 000 r/min離心15 min，吸取上清液備用。血清和肝臟組織勻漿上清液中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量采用試劑盒檢測，試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4.3 肝臟炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-1β mRNA相對表達量

表3 PCR反應(yīng)的引物序列

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.2統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟相對重量的分析

由圖1可知，與對照組相比，鐮刀菌毒素組的仔豬肝臟相對重量顯著高于對照組(P<0.05)。自然恢復(fù)組的仔豬肝臟相對重量低于鐮刀菌毒素組而高于對照組，但差異均不顯著(P>0.05)。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05). The same as Fig.2.

圖1鐮刀菌毒素污染飼糧對斷奶仔豬肝臟相對重量的影響

Fig.1 Effects ofFusariumtoxins contaminated diet on relative weights of liver of weaned gilts

2.2 血清生化指標(biāo)的分析

由表4可知，與對照組相比，鐮刀菌毒素組仔豬血清AST、ALT和ALP活性顯著升高(P<0.05)，血清TP和GLB含量則顯著降低(P<0.05)。與鐮刀菌毒素組相比，自然恢復(fù)組仔豬血清AST、ALT和ALP活性顯著降低(P<0.05)，血清TP和GLB含量顯著升高(P<0.05)，但仍與對照組有顯著差異(P<0.05)。這說明鐮刀菌毒素可造成肝臟蛋白質(zhì)合成功能損傷，并在停止飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧后得到一定的恢復(fù)。

2.3 血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的分析

由表5可知，與對照組相比，鐮刀菌毒素組仔豬血清GSH-Px、T-SOD活性和肝臟T-SOD活性顯著降低(P<0.05)，血清和肝臟MDA含量顯著升高(P<0.05)。與鐮刀菌毒素組相比，自然恢復(fù)組仔豬血清T-SOD活性顯著升高(P<0.05)，血清和肝臟MDA含量顯著降低(P<0.05)，且均與對照組差異不顯著(P>0.05)。自然恢復(fù)組血清GSH-Px活性和肝臟T-SOD活性與對照組和鐮刀菌毒素組差異均不顯著(P>0.05)。這說明鐮刀菌毒素造成了仔豬肝臟的氧化損傷，并在飼喂基礎(chǔ)飼糧后得到一定程度的改善。

2.4 肝臟IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量的分析

由圖2可知，與對照組相比，鐮刀菌毒素組仔豬肝臟IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量顯著升高(P<0.05)。與鐮刀菌毒素組相比，自然恢復(fù)組仔豬肝臟IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05)，且與對照組差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

本課題組于2013年相繼從山東省多個飼料廠和養(yǎng)殖場抽檢飼料原料樣品共計153個，檢測其霉菌毒素含量，從中選擇自然霉變玉米和霉變玉米蛋白粉配制鐮刀菌毒素污染飼糧，選擇毒素水平低于檢測限的原料配制基礎(chǔ)飼糧。但是遺憾的是，在基礎(chǔ)飼糧中依然檢測到少量毒素，這進一步說明我國飼料原料普遍受到鐮刀菌毒素的污染。由于基礎(chǔ)飼糧中各毒素含量均遠低于我國飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的小于0.5 mg/kg(GB 13078.2—2006)、1 mg/kg(GB 13078.3—2007)(我國對于飼料中伏馬菌素還沒有制定相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn))以及歐盟關(guān)于仔豬飼糧中玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和伏馬菌素小于0.1、0.9和5.0 mg/kg[16]的最高限量規(guī)定，且鐮刀菌毒素組毒素水平均超過上述標(biāo)準(zhǔn)，因此我們可以認(rèn)為對照組鐮刀菌毒素含量不影響對鐮刀菌毒素組結(jié)果的判斷。

表4 鐮刀菌毒素污染飼糧對斷奶仔豬血清生化指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

表5 鐮刀菌毒素污染飼糧對斷奶仔豬血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

圖2 鐮刀菌毒素污染飼糧對斷奶仔豬肝臟IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量的影響

肝臟是人和動物體解毒的重要器官，其功能的變化對動物健康具有重要意義。器官相對重量廣泛應(yīng)用于毒素對動物毒性大小的判斷，本試驗發(fā)現(xiàn)長期飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧的仔豬肝臟相對重量顯著高于對照組，這與給仔豬飼喂鐮刀菌毒素飼糧(試驗期為35 d)的前期試驗結(jié)果不同[17]，可能是由于攝入鐮刀菌毒素的時間延長而導(dǎo)致的肝臟代償性腫大所致[18]。血清中ALT、AST和ALP活性的改變是肝臟受到損害的一種應(yīng)答反應(yīng)[19]，血清中TP和GLB含量高低可直接反映肝臟蛋白質(zhì)合成能力，它們都可作為判斷肝臟中毒的指標(biāo)[20]。有研究表明，用鐮刀菌毒素污染的谷物配制的毒素飼糧飼喂仔豬35 d后，仔豬血清AST、ALT活性顯著升高，但在正常檢測范圍內(nèi)(AST活性：32～84 U/L，ALT活性：31～58 U/L)[21]，而病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟受到了一定的損傷[7]。本試驗中鐮刀菌毒素組仔豬血清ALT、AST和ALP活性均顯著升高，且血清ALT和AST活性仍在正常范圍內(nèi)，說明肝臟受到了一定程度的損傷，但具體損傷的程度還有待進一步研究。同時鐮刀菌毒素組仔豬血清TP和GLB的含量顯著降低，表明肝臟的蛋白質(zhì)合成功能受到抑制，進一步說明鐮刀菌毒素可使肝臟功能受損。血清T-SOD和GSH-Px活性能夠反映機體的抗氧化能力[22-23]，MDA是機體脂質(zhì)氧化的代謝產(chǎn)物[24]。前人對嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮在細(xì)胞的聯(lián)合毒性上的研究[25-26]表明，鐮刀菌毒素能通過損害細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)和加速自由基的產(chǎn)生來加速細(xì)胞的過氧化反應(yīng)[27]，從而造成某些臟器的氧化損傷。與Jiang等[8]在肉雞上的試驗(黃曲霉毒素102 μg/kg，玉米赤霉烯酮281 μg/kg，伏馬菌素5.87 mg/kg，嘔吐毒素2.04 mg/kg)結(jié)果相似，本試驗中鐮刀菌毒素組仔豬血清和肝臟中T-SOD和GSH-Px活性顯著降低，MDA含量顯著升高，表明本試驗條件下的鐮刀菌毒素引起了仔豬的氧化應(yīng)激，造成某些臟器包括肝臟在內(nèi)的氧化損傷。

肝臟受損時，其含有的大量天然免疫細(xì)胞和獲得性免疫細(xì)胞會釋放大量細(xì)胞因子，并在體內(nèi)激發(fā)一系列的級聯(lián)反應(yīng)[28]。研究表明三氯乙烯致敏豚鼠的肝臟損傷中，豚鼠肝臟組織內(nèi)白細(xì)胞介素-1(IL-1)和IL-6 mRNA表達量升高[29]。本試驗中，鐮刀菌毒素組肝臟中細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量均顯著增加，從分子水平表明本試驗條件下的鐮刀菌毒素能夠引起肝臟組織中細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量升高，進而可能導(dǎo)致機體免疫功能的紊亂，最終造成肝細(xì)胞的損傷，具體的損傷機制有待進一步研究。

本試驗中，飼喂鐮刀菌毒素污染飼糧35 d后改飼基礎(chǔ)飼糧，仔豬肝臟相對重量有所降低，肝臟功能指標(biāo)、蛋白質(zhì)合成能力及抗氧化能力都有所改善，這一結(jié)果與谷氨酸和精氨酸等功能性氨基酸及各種霉菌毒素吸附劑在動物上的應(yīng)用效果相似[30-31]，表明仔豬肝臟損傷得到一定程度的緩解；同時，肝臟組織細(xì)胞因子IL-1β和IL-6 mRNA相對表達量相比毒素組均顯著降低，且與對照組差異不顯著，從分子水平上進一步說明鐮刀菌毒素引起的仔豬肝臟損傷得到緩解，但具體的作用機制還需要進一步研究。

4 結(jié) 論

本試驗條件下，長期飼喂鐮刀菌毒素飼糧(玉米赤霉烯酮0.90 mg/kg，嘔吐毒素1.43 mg/kg，伏馬菌素5.85 mg/kg)能夠造成仔豬肝臟損傷，影響肝臟的抗氧化、蛋白質(zhì)合成和免疫功能，而經(jīng)過21 d恢復(fù)期，仔豬肝臟抗氧化和免疫功能得到了一定程度的改善。

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StudyonLiverInjurybyFusariumToxinsContaminatedDietandLiverNaturalRestorationofWeanedGilts

CHEN Ningbo1CHEN Xiangxing2YANG Weiren1*JIANG Shuzhen1HUANG Libo1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271000,China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

This experiment was conducted to investigate the effects of staged feedingFusariumtoxin contaminated diet on serum and liver biochemical and antioxidant indices and relative expressions of liver inflammatory cytokines interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) mRNA of weaned gilts. A total of 30 Duroc×Landrace×Large White female gilts at 35 days of age with body weight of (8.45±0.94) kg were randomly divided into 3 groups with 10 replicates per group and 1 pig per replicate. Gilts in control group were fed a basal diet continuously and gilts inFusariumtoxins group were fed aFusariumtoxins contaminated diet (0.90 mg/kg zearalenone, 1.43 mg/kg vomitoxin, 5.85 mg/kg fumitremorgin) continuously, while gilts in natural recovery group were fed the basal diet instead of theFusariumtoxins contaminated diet after 35 days. The adaptation period lasted for 7 days and the formal period lasted for 56 days. The results showed as follows: 1) compared with the control group, the liver relative weight of gilts inFusariumtoxins group was significantly increased (P<0.05), the activities of aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT) and alkaline phosphatase (ALP) in serum were significantly increased (P<0.05), while the contents of total protein (TP) and globulin (GLB) in serum were significantly decreased (P<0.05), the activities of glutathione peroxidase (GSH-Px) in serum and total superoxide dismutase (T-SOD) in serum and liver were significantly decreased (P<0.05), the serum and liver malondialdehyde (MDA) contents were significantly increased (P<0.05), the relative expressions of liver inflammatory cytokinesIL-1βandIL-6 mRNA were significantly increased (P<0.05). 2) After stopping supply ofFusariumtoxins contaminated diet for 21 days, compared with theFusariumtoxins group, the liver relative weight of gilts in natural recovery group was decreased to some extent (P>0.05), the activities of AST, ALT and ALP in serum were significantly decreased (P<0.05), while the contents of TP and GLB in serum were significantly increased (P<0.05), the serum T-SOD activity was significantly increased (P<0.05), the activities of GSH-Px in serum and liver and T-SOD in liver were increased to some extent (P>0.05), the serum and liver MDA contents were significantly decreased (P<0.05), the relative expressions of liver inflammatory cytokinesIL-1βandIL-6 mRNA were significantly decreased (P<0.05). These results indicated that long term feedingFusariumtoxins can induce liver injuries in gilts, and impact the liver antioxidant, protein synthesis and immunologic functions; after changing for the basal diet for 21 d, the injuries of liver in gilts are improved to a certain extent.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4570-4577]

Fusariumtoxins; gilts; liver injury; IL-1β; IL-6

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.039

S828

A

1006-267X(2017)12-4570-08

2017-06-04

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬創(chuàng)新團隊建設(shè)項目(SDAIT-06-022-05)

陳寧波(1989—)，女，山東煙臺人，碩士研究生，動物營養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail: ningbo201115@163.com

*通信作者：楊維仁，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: wryang@sdau.edu.cn

*Corresponding author, professor, E-mail: wryang@sdau.edu.cn

(責(zé)任編輯 武海龍)