成海建 游 偉* 靳 青 劉倚帆 萬(wàn)發(fā)春 宋恩亮 劉桂芬 譚秀文 張相倫 劉曉牧**

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

白藜蘆醇通過激活去乙?；?/腺苷一磷酸激活的蛋白激酶信號(hào)通路影響牛脂肪細(xì)胞凋亡

成海建1，2游 偉1，2*靳 青1，2劉倚帆1，2萬(wàn)發(fā)春1，2宋恩亮1，2劉桂芬1，2譚秀文1，2張相倫1，2劉曉牧1，2**

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，濟(jì)南 250100；2.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

本試驗(yàn)旨在研究植物提取物白藜蘆醇(RES)對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡率以及去乙?；?(SIRT1)/腺苷一磷酸激活的蛋白激酶(AMPK)信號(hào)通路關(guān)鍵因子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響。選取18月齡魯西黃牛的皮下前體脂肪細(xì)胞，在細(xì)胞分化的第0天，更換為RES濃度分別為0(對(duì)照)、100、200和400 μmol/L的培養(yǎng)液處理48 h，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。應(yīng)用Hoechst 33342染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，熒光定量PCR(qPCR)和免疫印跡試驗(yàn)(Western-blot)分別檢測(cè)SIRT1/AMPK信號(hào)通路上的關(guān)鍵因子SIRT1、AMPKα、叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(FoxO1)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量，并利用油紅O染色鑒定脂肪細(xì)胞。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比：不同濃度RES處理后的牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡率均極顯著增高(P<0.01)；不同濃度RES處理后的SIRT1、AMPKα、caspase-3、Bax的mRNA表達(dá)量均顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)，Bcl-2的mRNA表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)；不同濃度RES處理后的SIRT1、AMPKα、caspase-3的蛋白質(zhì)表達(dá)量均顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；200和400 μmol/L RES處理后，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)，Bax的蛋白質(zhì)表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)，Bcl-2的蛋白質(zhì)表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。100 μmol/L RES處理后時(shí)，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量以及Bcl-2、Bax的蛋白質(zhì)表達(dá)量均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。由此可見，RES通過激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路，同時(shí)激活通路下游的FoxO1，促進(jìn)了牛皮下脂肪細(xì)胞的凋亡，為通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)降低牛皮下脂肪沉積提供了一定的理論基礎(chǔ)。

去乙?；?；腺苷一磷酸激活的蛋白激酶；叉頭轉(zhuǎn)錄因子1；白藜蘆醇；牛；脂肪細(xì)胞；凋亡

脂肪細(xì)胞凋亡，即能量?jī)?chǔ)存的死亡。通過凋亡來調(diào)整脂肪細(xì)胞的數(shù)目被認(rèn)為是脂肪組織生長(zhǎng)和分化過程中維持正常生理機(jī)能所必需的，細(xì)胞凋亡存在整個(gè)脂肪細(xì)胞分化過程中，和增殖分化共同維持機(jī)體細(xì)胞數(shù)目的恒定[1]。對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡過程及其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行深入研究，為治療人類肥胖相關(guān)疾病、控制動(dòng)物體脂沉積進(jìn)而改善肉品質(zhì)，具有重要的研究意義。

20世紀(jì)90年代發(fā)現(xiàn)人類脂肪細(xì)胞凋亡后，才將減脂減重、脂肪細(xì)胞數(shù)目減少與脂肪細(xì)胞凋亡聯(lián)系起來[2]。隨后許多學(xué)者對(duì)脂肪細(xì)胞凋亡過程及其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行了更為深入的研究，但這些研究主要集中在3T3-L1脂肪細(xì)胞系[3]和人、鼠原代培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞以及豬的前體脂肪細(xì)胞。本研究團(tuán)隊(duì)初步探討了魯西黃牛皮下前體脂肪細(xì)胞和肌內(nèi)前體脂肪細(xì)胞的凋亡差異，發(fā)現(xiàn)去乙?；?(sirtuin type 1，SIRT1)通過叉頭轉(zhuǎn)錄因子1(forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)及其靶基因來調(diào)控肉牛前體脂肪細(xì)胞凋亡，并且皮下脂肪細(xì)胞SIRT1基因表達(dá)量和凋亡率均高于肌間脂肪細(xì)胞[4]，但調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。SIRT1是依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)的組蛋白去乙?；福瑸槌聊畔⒄{(diào)節(jié)因子2(silent information regulator 2，Sir2)家族成員之一[5]，與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡和代謝密切相關(guān)，已成為生命科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。腺苷一磷酸激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)能與腺苷一磷酸(adenosine monophosphate，AMP)結(jié)合，通過AMP感知細(xì)胞的能量水平和代謝平衡水平來調(diào)節(jié)酶的活性，被稱為“能量開關(guān)”，參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控[6]。AMPK作為能量感受器和調(diào)節(jié)器，成為眾多熱點(diǎn)信號(hào)通路的整合關(guān)鍵點(diǎn)，AMPK和SIRT1之間存在內(nèi)在聯(lián)系，從而在調(diào)節(jié)能量代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。AMPK與SIRT1的復(fù)雜關(guān)系及其與上下游的信號(hào)分子在脂肪細(xì)胞凋亡中的作用值得進(jìn)一步深入研究。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)作為一種非黃酮類多酚化合物，主要來源于花生、葡萄(紅葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物，具有多種生物活性和藥理作用，如抗氧化、神經(jīng)及心血管保護(hù)、抗腫瘤和抗衰老等作用[7-8]。RES常用來作為SIRT1的激活劑，在人和模型動(dòng)物上進(jìn)行了大量研究，尤其是在表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面取得了令人矚目的成果。但RES作為植物提取物，在動(dòng)物尤其在反芻動(dòng)物上進(jìn)行的研究基本上集中在表現(xiàn)型方面，很少涉及到機(jī)理方面。如在綿羊上做了有關(guān)RES降低甲烷排放的研究[9]；在奶牛飼糧中添加葡萄渣后，改變了瘤胃細(xì)菌和古菌菌落，同時(shí)降低了大約20%的甲烷產(chǎn)量[10]。RES對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化以及與機(jī)體表觀遺傳機(jī)制調(diào)控之間作用的認(rèn)識(shí)和研究還存在許多空白，需要系統(tǒng)詳細(xì)的研究。因此，本試驗(yàn)通過研究RES對(duì)肉牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡率以及SIRT1/AMPK信號(hào)通路關(guān)鍵基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響，旨在為通過營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)降低肉牛皮下脂肪沉積提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康無病、450 kg左右、18月齡的魯西黃牛閹公牛3頭，屠宰后，無菌條件下分離皮下脂肪組織。試驗(yàn)得到山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的許可(IACUC20060101)，并符合相關(guān)試驗(yàn)動(dòng)物福利的規(guī)則和制度。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 牛皮下脂肪細(xì)胞培養(yǎng)[4]

將牛皮下脂肪組織剪成1 mm3大小的組織塊，加入膠原酶Ⅰ消化液[杜氏改良Eagle培養(yǎng)基/營(yíng)養(yǎng)混合物F12(Dulbecco’s modified eagle medium/nutrient mixture F12，DMEM/F12)+1 g/L膠原酶Ⅰ]，恒溫振蕩水浴37 ℃消化30 min。加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液[DMEM/F12+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)]終止消化，200目細(xì)胞篩過濾，濾液用低速離心機(jī)(TDL-40B，上海安亭科學(xué)儀器廠)1 385×g離心5 min，棄上清液，加入DMEM/F12洗(692.5×g，離心10 min)2次后，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)液混勻，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、接種，即獲得牛前體脂肪細(xì)胞。待細(xì)胞匯合后，更換DMEM/F12生長(zhǎng)培養(yǎng)液為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液[DMEM/F12+10% FBS+1%青、鏈霉素原液+5 μg/mL胰島素(insulin，INS)+1 μmol/L地塞米松(dexamethasone，DEX)+0.5 mmol/L甲基異丁基黃嘌呤(1-methyl-3-isobutylmethylxanthine，IBMX)]，誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞。48 h后，更換誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液為基礎(chǔ)分化培養(yǎng)液(DMEM/F12+10% FBS+1%青、鏈霉素原液+5 μg/mL INS)，以后每2 d換1次基礎(chǔ)分化培養(yǎng)液。一般在第8天，有80%以上的前體脂肪細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。RES、膠原酶Ⅰ、FBS、DMEM/F12和青、鏈霉素原液均購(gòu)自美國(guó)Gibico公司；INS、DEX和IBMX均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2.2 Hoechst 33342染色

制作細(xì)胞爬片，在細(xì)胞分化的第0天，更換為RES濃度分別為0(對(duì)照)、100、200和400 μmol/L的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，處理48 h后，傾去培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗細(xì)胞3次。根據(jù)Hoechst 33342染色液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)說明書，進(jìn)行染色，利用日本Olympus公司Microscope Digital Camera Model DP71顯微鏡成像系統(tǒng)及Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.3 油紅O染色

制作細(xì)胞爬片，在細(xì)胞分化的第8天，更換為RES濃度分別為0(對(duì)照)、100、200和400 μmol/L的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。48 h后按油紅O(南京建成生物工程研究所)染色法鑒定脂肪細(xì)胞：傾去培養(yǎng)液，PBS洗細(xì)胞3次，10%甲醛的等滲鹽緩沖液固定40 min后，PBS漂洗，吸取油紅O工作液10 mL，油紅O染色30 min，60%異丙醇分色10～20 s，自來水沖洗，蘇木精染色10 min，自來水沖洗，甘油明膠封片拍照[4]。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脂肪細(xì)胞凋亡

以5×104個(gè)/cm2的密度將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，在皮下前體脂肪細(xì)胞分化第0天，更換為RES濃度分別為0(對(duì)照)、100、200和400 μmol/L的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。48 h后取出培養(yǎng)瓶，分別收集細(xì)胞，以磷脂結(jié)合蛋白V異硫氰酸熒光素(annexin V fluorescein isothiocyanate，Annexin V FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，按照Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)說明進(jìn)行操作。同時(shí)制備3個(gè)質(zhì)控樣本設(shè)定美國(guó)BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償和設(shè)置十字門范圍：a)沒有染色的細(xì)胞；b)僅用熒光標(biāo)記的Annexin V FITC染色的細(xì)胞；c)僅用PI染色的細(xì)胞。結(jié)果利用BD FACSCalibur分析平臺(tái)進(jìn)行分析，通過計(jì)數(shù)凋亡區(qū)細(xì)胞數(shù)量得出凋亡率。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

表1 PCR引物序列

續(xù)表1基因Genes序列號(hào)Accessionnumber引物序列Primerssequence(5′—3′)產(chǎn)物大小Productsize/bpB細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2Bcl?2NM＿173894．1F：CCCTTTTGCTTCAGGGTTTCATR：TCTCGGGGAGAGTCTGTGTC199β-肌動(dòng)蛋白β?actionNM＿173979．3F：CACCGCAAATGCTTCTAGGCR：TGTCACCTTCACCGTTCCAG186

F和R分別代表上游引物和下游引物。

F and R indicate forward and reverse primers, respectively.

1.2.6 免疫印跡試驗(yàn)(Western-blot)

以5×104個(gè)/cm2的密度將細(xì)胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，在細(xì)胞分化的第0天，更換為RES濃度分別為0(對(duì)照)、100、200和400 μmol/L的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理48 h后取出培養(yǎng)瓶，提取細(xì)胞中的總蛋白，并定量。取30 μg蛋白質(zhì)利用美國(guó)Bio-Rad公司電泳儀Mini-PROTEAN Tetra Cell進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，然后利用美國(guó)Bio-Rad公司電轉(zhuǎn)儀Mini Trans-Blot Electrophoretic transfer Cell轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，一抗孵育4 ℃過夜，三羥甲基氨基甲烷吐溫(TBST)緩沖液沖洗3次，每次10 min；二抗孵育2 h，緩沖液洗滌3次，發(fā)光液發(fā)光檢測(cè)。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為總蛋白內(nèi)參，利用美國(guó)Bio-Rad公司Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶亮度以及Quantity One軟件分析蛋白質(zhì)條帶密度值和表達(dá)量；將各目的蛋白質(zhì)密度值數(shù)據(jù)與相應(yīng)的GAPDH密度值比對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)量，以各組灰度值與對(duì)照組灰度值的比值表示，作相對(duì)表達(dá)量的柱狀分析圖。抗體SIRT1、促凋亡蛋白Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)、GAPDH為英國(guó)Abcam公司產(chǎn)品，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cystein-asparate protease，caspase)-3、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)為美國(guó)Cell Signaling Technology (CST)公司產(chǎn)品，F(xiàn)oxO1為美國(guó)Novus Biologicals公司產(chǎn)品，AMPKα為美國(guó)Gene Tex公司產(chǎn)品。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示，采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛皮下脂肪細(xì)胞的鑒定

油紅O染色是鑒定脂肪細(xì)胞特異性方法，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂滴能被親脂的油紅O著色呈現(xiàn)紅色，其他細(xì)胞因不含脂滴而無法被油紅O染色，從而證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。由圖1可見，對(duì)照組和RES組均能被油紅O染色，說明試驗(yàn)所用細(xì)胞為脂肪細(xì)胞。隨著RES濃度的增加，油紅O染色減少。

2.2 白藜蘆醇對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡的影響

由圖2-A和圖2-B可見，對(duì)照凋亡檢測(cè)圖和凋亡率，在牛皮下脂肪細(xì)胞分化第0天，用不同濃度的RES處理48 h，不同濃度的RES處理后的牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡率均極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。

Hoechst 33342可透過細(xì)胞膜，與DNA結(jié)合而發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)。由圖2-C可見，與對(duì)照組相比，RES處理48 h后，在熒光顯微鏡下觀察到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染，400 μmol/L濃度下因較多細(xì)胞凋亡脫落，故只觀察到少量細(xì)胞，但均呈碎塊狀致密濃染。

2.3 RES對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞SIRT1、AMPKα、FoxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

由表3和圖3可知，與對(duì)照組相比，SIRT1的mRNA表達(dá)量隨著RES濃度增加顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)，蛋白質(zhì)表達(dá)量也是隨著RES濃度增加極顯著提高(P<0.01)；AMPKα的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；RES濃度為200和400 μmol/L時(shí)，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)。RES濃度為100 μmol/L時(shí)，F(xiàn)oxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)?；蚝偷鞍踪|(zhì)表達(dá)量基本呈現(xiàn)濃度依賴性。

圖1 油紅O染色

A：RES對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖。B：RES對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡率的影響。C：Hoechst 33342染色檢測(cè)RES引起肉牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化(200×)。

A: Apoptotic detection of figure by flow cytometry treated with RES. B: Effects of RES on apoptosis ratio of bovine subcutaneous adipocytes. C: Morphological changes of bovine subcutaneous adipocytes apoptosis exposed to RES by Hoechst 33342 staining (200×).

數(shù)據(jù)柱標(biāo)*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，#表示與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

Value columns with * mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** mean extremely significant difference compared with control group (P<0.01), while with # mean no difference compared with control group (P>0.05). The same as below.

圖2白藜蘆醇對(duì)肉牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡的影響

Fig.2 Effects of RES on apoptosis of bovine subcutaneous adipocytes (n=3)

表3 RES對(duì)牛皮下脂肪細(xì)胞基因mRNA表達(dá)量的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)*表示與對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)，**表示與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)，#表示與對(duì)照組比較差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with * superscript mean significant difference compared with control group (P<0.05), and with ** superscript mean extremely significant difference compared with control group (P<0.01), while with # superscript mean no difference compared with control group (P>0.05).

圖3 RES對(duì)SIRT1、AMPKα和FoxO1蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

2.4 RES對(duì)肉牛皮下脂肪細(xì)胞caspase-3、Bax、Bcl-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

由表3和圖4可知，與對(duì)照組相比，Bcl-2的mRNA表達(dá)量隨著RES濃度增加極顯著降低(P<0.01)；RES濃度為200和400 μmol/L時(shí)，Bcl-2的蛋白質(zhì)表達(dá)量也極顯著降低(P<0.01)；caspase-3的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)；Bax的mRNA表達(dá)量顯著或極顯著提高(P<0.05或P<0.01)，RES濃度為200和400 μmol/L時(shí)，Bax的蛋白質(zhì)表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)。RES濃度為100 μmol/L時(shí)，Bcl-2和Bax的蛋白質(zhì)表達(dá)量與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 RES與脂肪細(xì)胞凋亡

由于脂肪細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴，可阻止細(xì)胞皺縮及凋亡小體的形成，再加上由于脂肪細(xì)胞密度較小，易漂浮在液面上，操作中不易洗滌和分離，所以脂肪組織細(xì)胞凋亡研究起步較晚。細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞主動(dòng)死亡的過程，最重要的調(diào)節(jié)因子之一是Bcl-2家族，該家族根據(jù)功能不同分為2類：一類是促凋亡成員如Bax、Bad等，其通過提高線粒體的外膜通透性，增加線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，激活本身不具有生物催化活性的caspase酶原，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；另一類是抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-xl等，其能夠通過穩(wěn)定線粒體膜阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而對(duì)線粒體凋亡途徑起負(fù)調(diào)控作用。

圖4 RES對(duì)caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白質(zhì)表達(dá)量的影響

用RES處理3T3-L1前脂肪細(xì)胞研究凋亡現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)SIRT1的蛋白質(zhì)表達(dá)量提高，caspase-3和caspase-9被激活[12]。RES特異性增加豬前體脂肪細(xì)胞SIRT1的表達(dá)活性，而SIRT1的上調(diào)影響caspase-3和Bcl-2家族因子的活性，同時(shí)參與調(diào)控腫瘤抑制因子p53和核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，推測(cè)SIRT1調(diào)控凋亡相關(guān)因子表達(dá)是RES誘導(dǎo)前體脂肪細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵原因[13]。本研究中RES特異性增加肉牛脂肪細(xì)胞SIRT1的表達(dá)活性，caspase-3和Bax的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量升高，Bcl-2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量降低，說明RES誘導(dǎo)牛脂肪細(xì)胞凋亡過程中，促凋亡因子的作用顯著加強(qiáng)，抑制凋亡發(fā)生因子的作用能力減弱，最終導(dǎo)致凋亡現(xiàn)象的發(fā)生，與上述的研究結(jié)果基本相似[13]。而將鼠H9c2細(xì)胞置于缺氧環(huán)境下24 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡增加，而相同條件下再用RES處理24 h，凋亡細(xì)胞明顯減少[14]。用RES處理人類退變椎間盤髓核(disc nucleus pulposus，NP)細(xì)胞48 h，可降低細(xì)胞的凋亡水平和caspase-3基因的激活，SIRT1主要通過蛋白激酶B(Akt)抗凋亡信號(hào)通路調(diào)控退變NP細(xì)胞的存活[15]。看來RES誘導(dǎo)的SIRT1對(duì)細(xì)胞凋亡的功能調(diào)節(jié)與細(xì)胞種類、細(xì)胞所處的階段、環(huán)境等其他因素有很大關(guān)系。

RES作為SIRT1的激活劑，在人和模型動(dòng)物上進(jìn)行了大量研究，但作為植物提取物，在動(dòng)物尤其在反芻動(dòng)物上進(jìn)行的研究基本上集中在降低甲烷排放方面，本研究在RES對(duì)肉牛皮下脂肪細(xì)胞凋亡方面進(jìn)行了初步探討，對(duì)肉牛脂肪沉積調(diào)控方面需要做進(jìn)一步系統(tǒng)詳細(xì)的研究。

3.2 SIRT1/AMPK信號(hào)通路與脂肪細(xì)胞凋亡

由于哺乳動(dòng)物的AMPK屬于高度保守的蛋白激酶家族，是蛋白激酶級(jí)聯(lián)系統(tǒng)中的中心元件，在調(diào)節(jié)能量代謝的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制中起著樞紐作用；而SIRT1作為一種NAD+依賴的組蛋白去乙?；?，通過細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變而調(diào)控細(xì)胞的能量代謝平衡。研究表明，AMPK和SIRT1之間存在內(nèi)在聯(lián)系，從而在調(diào)節(jié)能量代謝過程中起著重要的調(diào)控作用。能量降低或AMPK激活導(dǎo)致SIRT1激活，可能是提高NAD+或NAD+/還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和/或煙酰胺磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide phosphoribosyl transferase，NAMPT)，SIRT1去乙?；⒓せ罡渭っ窧1(liver kinase B1，LKB1)，隨后激活A(yù)MPK[16-18]；RES通過激活SIRT1影響AMPK[19-21]。利用RES研究鼠3T3-L1前體脂肪細(xì)胞凋亡中發(fā)現(xiàn)，SIRT1激活，抑制Akt活性，同時(shí)也提高了AMPK活性，SIRT1/AMPK信號(hào)通路激活了線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路[12]。另外SIRT1將FoxO1、生肌決定因子(mysgenic determination gene，MyoD)、p53等許多轉(zhuǎn)錄因子作為底物發(fā)揮作用。RES可上調(diào)人內(nèi)臟脂肪細(xì)胞中SIRT1、FoxO1和脂聯(lián)素(adiponectin)基因表達(dá)[22]。與上述的研究結(jié)果相類似，本研究中RES特異性增加肉牛脂肪細(xì)胞SIRT1的表達(dá)活性，AMPKα和FoxO1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)量也相應(yīng)增加，說明RES誘導(dǎo)肉牛脂肪細(xì)胞凋亡過程中，激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路，同時(shí)激活通路下游的FoxO1，促凋亡的作用顯著加強(qiáng)，導(dǎo)致凋亡現(xiàn)象。當(dāng)然還有好多相反的研究結(jié)果，利用RES抑制人骨骼肌細(xì)胞中的AMPK信號(hào)通路[23]。研究發(fā)現(xiàn)AMPK的α2催化亞基異構(gòu)體在肝細(xì)胞癌(HCC)中顯著下調(diào)，AMPK的異位表達(dá)在肝癌細(xì)胞中增強(qiáng)了p53的乙?；头€(wěn)定；p53去乙?；筍IRT1的蘇氨酸(Thr)-344位點(diǎn)可被AMPK所磷酸化，這造成SIRT1失活，從而促進(jìn)p53的乙?；透伟┘?xì)胞的凋亡[24]。可見RES誘導(dǎo)的SIRT1/AMPK信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞凋亡的功能調(diào)節(jié)比較復(fù)雜，既有抗凋亡作用，又有促凋亡作用，與細(xì)胞種類、處理的特異性、刺激的時(shí)間和強(qiáng)度等多種因素都有密切關(guān)聯(lián)。

由于抗體的種屬原因，本研究只檢測(cè)了總蛋白水平，團(tuán)隊(duì)下一步將檢測(cè)SIRT1/AMPK信號(hào)通路蛋白激酶及其亞基的磷酸化水平，以便了解白藜蘆醇激活A(yù)MPK通路的具體作用機(jī)制。同時(shí)深入研究白藜蘆醇對(duì)肉牛肌內(nèi)脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞的影響以及大群飼養(yǎng)效果，為通過飼喂植物提取物等營(yíng)養(yǎng)調(diào)控技術(shù)降低肉牛皮下脂肪沉積提供新思路。

4 結(jié) 論

RES通過激活SIRT1/AMPK信號(hào)通路，同時(shí)激活通路下游的FoxO1，促進(jìn)肉牛皮下脂肪細(xì)胞的凋亡。

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ResveratrolInducesApoptosisofBovineAdipocytesthroughActiviateofSirtuinType1/AdenosineMonophosphateActivatedProteinKinaseSignalingPathway

CHENG Haijian1,2YOU Wei1,2*JIN Qing1,2LIU Yifan1,2WAN Fachun1,2SONG Enliang1,2LIU Guifen1,2TAN Xiuwen1,2ZHANG Xianglun1,2LIU Xiaomu1,2**

(1.InstituteofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShandongAcademyofAgriculturalSciences,Jinan250100,China; 2.ShandongKeyLabofAnimalDiseaseControlandBreeding,Jinan250100,China)

The aim of this study was to explore the effect of plant extracts resveratrol (RES) on the bovine adipocytes apoptosis ratio and key factors mRNA and protein expression in sirtuin type 1 (SIRTl)/adenosine monophosphate activated protein kinase (AMPK) signaling pathway. Bovine subcutaneous preadipocytes of 18-month-old Luxi yellow cattle were selected, on day 0 of cell differentiation, cells were treated with culture medium with 0 (control), 100, 200 and 400 μmol/L RES for 48 h, there were three replicates in each group. Hoechst 33342 staining was used to detect morphological changes of adipocytes apoptosis, the flow cytometry was used to detect the apoptosis ratio, quantitative real-time PCR (qPCR) and Western-blot were selected to detect the gene and protein expressions of SIRTl/AMPK signaling pathway related genes such asSIRT1,AMPKα, forkhead box protein O1 (FoxO1), B cell lymphoma/lewkmia-2 (Bcl-2), cystein-asparate protease-3 (caspase-3), Bcl-2 associated X protein (Bax), and oil red O stain was taken to identify the adipocytes. The results showed that compared with the control group, the adipocyte apoptosis rate after treatment with different concentrations of RES was extremely significantly increased (P<0.01); the mRNA expressions ofSIRT1,AMPKα, caspase-3 andBaxafter treatment with different concentrations of RES were significantly or extremely significantly increased (P<0.05 orP<0.01), but theBcl-2 mRNA expression was extremely significantly decreased (P<0.01); the protein expressions of SIRT1, AMPKα and caspase-3 after treatment with different concentrations of RES were significantly or extremely significantly increased (P<0.05 orP<0.01); after treatment with 200 and 400 μmol/L RES, the mRNA and protein expressions ofFoxO1 were significantly or extremely significantly increased (P<0.05 orP<0.01), the Bax protein expression was extremely significantly increased (P<0.01), the Bcl-2 protein expression was extremely significantly decreased (P<0.01). After treatment with 100 μmol/L RES, the mRNA and protein expressions of FoxO1 and protein expressions of Bcl-2 and Bax had no significant difference compared with control group (P>0.05). In conclusion, the regulation of apoptosis of bovine subcutaneous adipocytes by RES is through stimulation of AMPK/SIRT1 signaling pathway and activation pathway downstream of FoxO1, which provides a theoretical basis for reducing the caccumulation of subcutaneous fat by nutritional regulation techniques.[ChineseJournalofAnimalNutrition,2017,29(12)：4398-4407]

SIRT1; AMPK； FoxO1; resveratrol; bovine; adipocytes; apoptosis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.12.020

S823

A

1006-267X(2017)12-4398-10

2017-06-11

國(guó)家自然科學(xué)基金(31402098，31601966)；國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2015BAD03B04)

成海建(1978—)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事肉牛營(yíng)養(yǎng)與遺傳育種研究。E-mail: 98061107@163.com

*同等貢獻(xiàn)作者

**

劉曉牧，副研究員，E-mail: xmliu2002@163.com

*Contributed equally

**Corresponding author, associate professor, E-mail: xmliu2002@163.com

(責(zé)任編輯 武海龍)