王 丹，楊 峰，李新圃，羅金印，劉龍海，張 哲,2，張亞茹,2，李宏勝*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

獸醫(yī)臨床

某奶牛場(chǎng)乳房炎病原菌的分離鑒定及耐藥性分析

王 丹1，楊 峰1，李新圃1，羅金印1，劉龍海1，張 哲1,2，張亞茹1,2，李宏勝1*

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所/農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

為監(jiān)測(cè)甘肅臨洮某奶牛場(chǎng)奶牛乳房炎主要致病菌對(duì)臨床常用治療藥物的耐藥情況，指導(dǎo)臨床合理用藥。從奶牛場(chǎng)采集了45份臨床型奶牛乳房炎病樣，進(jìn)行培養(yǎng)分離，并采用16S rDNA對(duì)分離純化的細(xì)菌進(jìn)行鑒定；對(duì)主要病原菌，采用牛津杯法測(cè)定其對(duì)乳房炎常用治療藥物的耐藥情況。結(jié)果表明，從45份乳房炎奶樣中，共分離出以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌為主的7種乳房炎致病菌。耐藥性試驗(yàn)表明，金黃色葡萄球菌對(duì)無(wú)抗頭孢、頭孢力定、青霉素G鉀、強(qiáng)力乳凈、乳癰治、乳癰快克、炎乳康、乳腫康和硫酸慶大極其敏感；大腸埃希菌對(duì)頭孢力定、青霉素G鉀、強(qiáng)力乳凈、乳癰快克、炎乳康、乳腫康和硫酸慶大極其敏感。金黃色葡萄球菌對(duì)強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳炎康、乳炎康、十味乳炎清、無(wú)抗乳腫消、獲特鍵和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)耐藥作用較強(qiáng)。大腸埃希菌對(duì)強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳腫消、乳房腫炎立消、獲特鍵和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)耐藥作用較強(qiáng)。研究結(jié)果為該奶牛場(chǎng)乳房炎的防治提供了參考。

奶牛乳房炎；金黃色葡萄球菌；大腸埃希菌；藥物敏感性

奶牛乳房炎是奶牛乳房受到物理、化學(xué)、微生物等致病因子的刺激所發(fā)生的一種炎癥，不僅可導(dǎo)致產(chǎn)奶量和乳品質(zhì)的下降，嚴(yán)重時(shí)甚至可使奶牛泌乳機(jī)能喪失，使患牛淘汰，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。經(jīng)調(diào)查，目前全世界約有1/3的奶?；加懈鞣N類型的乳房炎，每年造成的損失高達(dá)350億美元，僅美國(guó)就高達(dá)30億美元[2]。我國(guó)平均每年損失1.35億人民幣[3]，日本平均每年每頭患病奶牛損失5萬(wàn)日元，丹麥、美國(guó)和加拿大平均每年每頭奶牛乳房炎奶牛損失200美元～300美元[4]。國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者表明，引起奶牛乳房炎的病因復(fù)雜，但主要是病原菌感染所引起，最常見(jiàn)的病原菌有20余種，其中以葡萄球菌和腸桿菌為主，葡萄球菌占7.87%～83.3%，其中金黃色葡萄球菌占2.24%～83.3%，腸桿菌占5.62%～32.14%，其中大腸埃希菌占2.25%～32.14%[5-6]。

目前，國(guó)內(nèi)外治療奶牛乳房炎的方法有多種，分為全身治療、乳頭灌注治療和藥膏直接涂抹乳房治療等[7-8]。常用的藥物有抗生素、中藥等，或中西藥結(jié)合來(lái)治療奶牛乳房炎[9]。奶牛乳房炎的治療最主要是使用抗生素，但大部分奶牛場(chǎng)都是在不明確病原菌及抗生素耐藥性的情況下大量反復(fù)的使用，造成乳汁中抗生素的大量殘留，不斷出現(xiàn)耐藥菌株，使治療效果下降[10]。因此，為了準(zhǔn)確選取敏感藥物用于奶牛乳房炎的治療，非常有必要對(duì)奶牛乳房炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌進(jìn)行藥物敏感性的測(cè)定，為我國(guó)臨床奶牛乳房炎提供治療選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器、藥物和試劑 PCR擴(kuò)增儀(SEDI-G)為Wealtec公司產(chǎn)品；凝膠成像儀(c150)為Azure Biosystems公司產(chǎn)品；顯微鏡(Nikon， E200)、電泳儀(DYY-6C)為北京六一儀器公司產(chǎn)品；培養(yǎng)箱( GHP-9050)為上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；16S rDNA PCR試劑盒DNA Marker DL 1 000為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒為OMEUA公司產(chǎn)品；營(yíng)養(yǎng)肉湯和血瓊脂營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)為廣東環(huán)凱生物科技有限公司產(chǎn)品；水解酪蛋白瓊脂(MH)為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；血平板為廣州市迪景微生物科技有限公司產(chǎn)品。

無(wú)抗頭孢和抗乳必治為哈爾濱文明獸藥廠產(chǎn)品；頭孢力定為廣州天王動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品；青霉素G鉀為哈爾濱生物制品二廠有限責(zé)任公司產(chǎn)品；消炎無(wú)痕為四川維爾康動(dòng)物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；強(qiáng)力乳康和抗乳腫消為西鄉(xiāng)長(zhǎng)江動(dòng)物藥品有限責(zé)任公司產(chǎn)品；強(qiáng)力乳凈、無(wú)抗乳炎康、乳癰、獲特鍵為北京華盛藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；乳炎康為新鄉(xiāng)市華畜商貿(mào)有限公司產(chǎn)品；十味乳炎清為江西一領(lǐng)藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；無(wú)乳癰快克為河南官渡獸藥制造有限公司產(chǎn)品；炎乳康和硫酸慶大為黑龍江省北安市飛龍動(dòng)物藥廠產(chǎn)品；乳腫康為山西芮城亞寶獸藥有限公司產(chǎn)品；乳房腫炎立消和宮乳霸為鄭州黑白花生物科技有限公司產(chǎn)品；強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)為北京華泰源動(dòng)物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳樣采集 臨床型乳房炎奶樣采自臨洮某奶牛場(chǎng)。用溫水清洗患病乳區(qū)，酒精棉消毒乳頭，棄去頭2把乳，擠取適量乳汁在滅菌試管中，遠(yuǎn)途乳樣擠在瓊脂斜面上，并做好標(biāo)記。采集乳樣需冷藏保存，并盡快進(jìn)行細(xì)菌分離。

1.2.2 細(xì)菌分離 挑取均勻乳樣(或瓊脂斜面上的菌落)劃分在血平面上，同時(shí)接種增菌肉湯一管，37℃孵育18 h～20 h。從血平面上挑選單個(gè)菌落，接種到增菌肉湯中，37℃孵育18 h～20 h。進(jìn)行載玻片涂片、革蘭染色、顯微鏡觀察，已分離純化的細(xì)菌可進(jìn)入細(xì)菌鑒定程序，未分離純化的細(xì)菌需重新進(jìn)行血平面劃分，直至細(xì)菌分離純化方可進(jìn)入細(xì)菌鑒定程序。若血平面上未長(zhǎng)菌，而相應(yīng)的增菌肉湯管長(zhǎng)菌，則挑取肉湯管中的細(xì)菌培養(yǎng)物進(jìn)行血平面劃分、純化。分離純化菌株可以加入到脫脂乳中冷凍保存。

1.2.3 16S rDNA鑒定 采用OMEGA提取試劑盒提取細(xì)菌DNA，并以此作為DNA模板，使用16S rDNA PCR試劑盒對(duì)DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像，將符合測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)的PCR產(chǎn)物純化，并送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。使用PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)所測(cè)得序列片段進(jìn)行在線Blast，搜索比對(duì)，確定細(xì)菌種屬。

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 從血斜面分別挑取各試驗(yàn)菌株1～2鉑耳圈接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h～20 h，經(jīng)涂片鏡檢純粹后，用生理鹽水稀釋1 000倍，用棉棒蘸取菌液均勻涂布到MH平板上，在平板中央放置一個(gè)牛津杯，周邊等距離放置4個(gè)牛津杯，將藥液(按照說(shuō)明書(shū)推薦劑量配制)加到牛津杯中，每個(gè)加200 μL，然后置37℃溫箱中培養(yǎng)18 h～20 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，每種藥物平行測(cè)3次，取平均值。

1.2.5 判斷標(biāo)準(zhǔn) 按藥理試驗(yàn)方法學(xué)記載的牛津杯法檢測(cè)計(jì)算37℃培養(yǎng)18 h的各藥抑菌圈直徑均值。抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)按《中藥藥理學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)：d≥20 mm為極其敏感；15 mm≤d<20 mm為高度敏感；10 mm≤d<15 mm為中度敏感；d<10 mm為耐藥(不敏感)[11]。

2 結(jié)果

2.1 16S rDNA鑒定結(jié)果

使用試劑盒提供的forward primer/reverse primer引物，PCR擴(kuò)增獲得500 bp～ 600 bp之間的DNA片段(圖1)，測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST搜索比對(duì)，序列對(duì)比結(jié)果見(jiàn)表1。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL1 000；1～24.待檢菌株M.DNA Marker DL 2 000； 1-24.Strains to be tested

2.2 臨床常用乳房炎治療藥物耐藥性檢測(cè)結(jié)果

從表2中可以看出，金黃色葡萄球菌對(duì)大部分臨床常用的乳房炎藥物比較敏感，對(duì)其有較強(qiáng)抑菌作用的藥物主要有無(wú)抗頭孢、頭孢力定、青霉素G鉀、強(qiáng)力乳凈、乳癰治、乳癰快克、炎乳康、乳腫康和硫酸慶大。有較強(qiáng)耐藥的藥物主要有強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳炎康、乳炎康、十味乳炎清、無(wú)抗乳腫消、獲特鍵和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)，表現(xiàn)為完全耐藥。大腸埃希菌對(duì)臨床常用的乳房炎藥物的敏感性低于金黃色葡萄球菌，對(duì)其有較強(qiáng)抑菌作用的藥物主要有頭孢力定、青霉素G鉀、強(qiáng)力乳凈、乳癰快克、炎乳康、乳腫康和硫酸慶大。表現(xiàn)為完全耐藥的藥物主要有強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳腫消、乳房腫炎立消、獲特鍵和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)。對(duì)無(wú)抗乳腫消、乳炎康、十味乳炎清和宮乳霸具有一定的耐藥性。

表1 奶牛臨床型乳房炎主要病原菌分離和鑒定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)采集的45份乳房炎奶牛乳樣均分離出了病原菌，病原菌的檢出率為100%。在采集的45份奶樣中，混合感染的有7份，占所有奶樣的15.56%。在分離出的52株病原菌中，有17株大腸埃希菌，占總分離株的32.69%，檢出率明顯高于其他多數(shù)報(bào)道[12-14]。這可能是由于大腸埃希菌為環(huán)境致病菌，該牛場(chǎng)飼養(yǎng)環(huán)境較差引起的。

金黃色葡萄球菌的檢出率僅次于大腸埃希菌，占總分離株的23.08%，金黃色葡萄球菌屬傳染性細(xì)菌，主要在擠奶過(guò)程中傳播，牛體遭其感染后即成為傳染源，即使本身不發(fā)病也可病原菌傳染給其他牛導(dǎo)致其他牛發(fā)病。本試驗(yàn)采集的奶樣中還檢出了益生菌乳酸乳球菌，檢出率為7.96%，益生菌雖然能夠抑制一些病原菌的生長(zhǎng)，但是李新圃等[15]研究認(rèn)為益生菌進(jìn)入乳房成為條件性致病菌后能引起奶牛乳房炎。糞腸球菌和屎腸球菌的檢出率分別為15.38%和13.46%，糞腸球菌和屎腸球菌屬乳酸菌，常作為條件性致病菌進(jìn)行研究[16]。本試驗(yàn)細(xì)菌分離結(jié)果提示該奶牛場(chǎng)需進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)環(huán)境管理，擠奶過(guò)程中嚴(yán)把衛(wèi)生關(guān)，徹底消毒，減少病原菌感染。

表2 病原菌對(duì)臨床常用藥物的耐藥性

藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)分離的金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌對(duì)臨床常用藥物頭孢力定、青霉素G鉀、強(qiáng)力乳凈、乳癰快克、炎乳康、乳腫康和硫酸慶大都極其敏感，除此之外，金黃色葡萄球菌還對(duì)無(wú)抗頭孢和乳癰治極其敏感性，這些藥物可作為該牛場(chǎng)治療金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌性乳房炎的首選藥物。但是金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌也對(duì)臨床常用藥物產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，如對(duì)強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳腫消、獲特鍵和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)均完全耐藥；大腸埃希菌還對(duì)乳房腫炎立消也完全耐藥，金黃色葡萄球菌對(duì)無(wú)抗乳炎康、乳炎康和十味乳炎消也完全耐藥。如此高的多重耐藥性與我國(guó)奶牛場(chǎng)長(zhǎng)期反復(fù)大量不按規(guī)定使用這些藥物有密切聯(lián)系。有研究表明，細(xì)菌可通過(guò)質(zhì)粒將耐藥性從一種細(xì)菌傳遞給另一種細(xì)菌[17]。這些耐藥菌株也可能在人與人之間傳播，甚至可能出現(xiàn)“超級(jí)細(xì)菌”致使感染金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌后無(wú)藥治療，給人類生命安全帶來(lái)威脅。為了防止產(chǎn)生耐藥菌株，應(yīng)做到科學(xué)、規(guī)范、合理的選用臨床藥物來(lái)治療奶牛乳房炎，并對(duì)使用藥物進(jìn)行定期的耐藥性檢測(cè)；交叉使用不同的藥物，避免長(zhǎng)期頻繁的使用同一種藥物；嚴(yán)格控制藥物的劑量。

本試驗(yàn)選用的20種藥物中，無(wú)抗頭孢、頭孢力定、抗乳必治、青霉素G鉀和硫酸慶大屬于西藥抗生素；消炎無(wú)痕、強(qiáng)力乳康、無(wú)抗乳炎康、乳癰治、乳炎康、十味乳炎清、無(wú)抗乳腫消、乳癰治、炎立消、獲特鍵和宮乳霸屬于中藥制劑；強(qiáng)力乳凈、乳癰快克、乳腫康和強(qiáng)力宮康Ⅱ號(hào)屬于中西藥混合劑。從試驗(yàn)結(jié)果可看出，西藥及中西藥結(jié)合的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果優(yōu)于純中藥制劑，但是，由于中藥成分比較復(fù)雜，且對(duì)中藥抑菌效果的研究多局限于體外，體內(nèi)的研究較少，所以不能單純的靠體外抑菌結(jié)果去評(píng)定中藥在機(jī)體內(nèi)抗感染能力。所以，奶牛乳房炎的治療不能單一的依賴于抗生素等西藥，有效的控制奶牛乳房炎的發(fā)生需要以預(yù)防為主，綜合防治，且采用中藥、生物制劑和疫苗結(jié)合的方案進(jìn)行奶牛乳房炎有效防治[18]。

[1] 張立恩,王秀杰.奶牛乳房炎對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害[J].農(nóng)民致富之友,2016(6):258.

[2] 朱江巍,劉耀川,張雅為.奶牛乳房炎病原菌分離及藥物敏感性試驗(yàn)[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016 (4):111-113.

[3] 劉來(lái)欽.奶牛乳房炎及其防治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2016(9):67-68.

[4] 李宏勝,羅金印,王旭榮,等.我國(guó)奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌抗生素耐藥性研究[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2012,31(6):5-7.

[5] 趙美盈.奶牛乳房炎致病菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)殖與飼料,2016(6):16-17.

[6] Osumi T,Kishimoto Y,Kano R,et al.Protothecazopfiigenotypes isolated from cow barns and bovine mastitis in Japan.[J].Vet Microbiol,2008,131(3-4):419-423.

[7] 劉志偉.乳房中藥涂膜劑治療奶牛乳房炎的效果試驗(yàn)[J].現(xiàn)代畜牧科技,2016(6):171-171.

[8] 張 穎,毛景東.奶牛乳房炎的治療與預(yù)防[J].中國(guó)牛業(yè)科學(xué),2016,42(2):88-90.

[9] 孔 娜.奶牛乳房炎的中西醫(yī)結(jié)合治療方法研究[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,44(3):144-147.

[10] 王海瑞,王旭榮,張景艷,等.甘肅省某奶牛場(chǎng)腸桿菌性乳房炎主要病原菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2016,37(5):63-68.

[11] 董淑珍,付志新,宋 瑜,等.六種中藥提取物對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的比較[J] .動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010(8) :121-124.

[12] 王旭榮,李建喜,楊志強(qiáng).2012年奶牛乳房炎防治技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志,2013,49(24):35-40.

[13] 郭海軍,周 斌.奶牛乳房炎病原菌的分離鑒定與主要致病菌耐藥性分析[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2011(3):12-14.

[14] 王 娜,高學(xué)軍.哈爾濱地區(qū)奶牛隱性乳房炎病原菌的分離鑒定[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2011,42(2):29-32.

[15] 李新圃,李宏勝,羅金印,等.奶牛乳房炎致病菌的分離鑒定及耐藥性研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015,36(11):36-39.

[16] 黃仁剛,楊興祥,喻 華,等.腸球菌屬血流感染92例臨床及病原菌特點(diǎn)分析[J].中國(guó)感染與化療雜志,2015,15(1):6-10.

[17] 趙紅波,趙建宏,石 磊.質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥基因獲得及轉(zhuǎn)移研究進(jìn)展[J].臨床薈萃,2010,25 (11):1005-1007.

[18] 李宏勝,羅金印,李新圃,等.以疫苗預(yù)防為主的奶牛乳房炎綜合防治措施應(yīng)用效果觀察[J].中國(guó)草食動(dòng)物,2010,30(6):69-71.

Isolation,IdentificationandDrugResistanceAnalysisofPathogensfromaFarmofDairyCowwithMastitis

WANG Dan1，YANG Feng1，LI Xin-Pu1，LUO Jin-yin1，LIU Long-hai1，ZHANG Zhe1,2，ZHANG Ya-ru1,2， LI Hong-sheng1

(1.KeyLaboratoryofVeterinaryPharmaceuticalDiscovery,MinistryofAgriculture,KeyLaboratoryofNewAnimalDrugProjectofGansuProvince,LanzhouInstituteofAnimalHusbandryandPharmaceuticalSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou，Gansu,730050,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou，Gansu,730070,China)

The aim of this study was to monitor the clinical drug resistance of the mastitis pathogens in Lintao,and to provide a foundation for clinical treatment.45 milk samples were collected from dairy cows with clinical mastitis for bacterial isolation and the main pathogens were identified using the method of 16S rDNA identification.The resistance of clinical drugs were detected by Oxford Cup method.The results showed that the main bacteria isolated from dairy cow mastitis cases wereE.coliandS.aureus.The drug sensitivity test indicated that theS.aureuswere extremely sensitive to ceftiofur,ampiallin sodium,benzylpenicillin potassium,Qianglirujing,Ruyongzhi,Ruyongkuaike,Yanrukang,gentamycin sulfate.E.coliwere extremely sensitive to ampiallin sodium,benzylpenicillin potassium,Qianglirujing,Ruyongkuaike,Yanrukang,gentamycin sulfate.S.aureuswere highly resistant to Qianglirukang,Wukangruyankang,Ruyankang,Shiweiruyanqing,Wukangruzhongxiao,Huotejian and QiangligongkangⅡ.E.coliwere highly resistant to Qianglirukang,Wukangruzhongxiao,Rufangzhongyanlixiao,Huotejian and QiangligongkangⅡ.The results were able to provide reliable foundation for prevention and control of dairy cow mastitis in Lintao.

dairy cow mastitis;S.aureus;E.coli; drug sensitivity

2017-03-08

“十三五”國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2017YFD0502200)；甘肅省科技支撐計(jì)劃(144NKCA240)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Y2016PT43)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛疾病研究創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)

王 丹(1991-)，女，河南鄭州人，碩士研究生，主要從事奶牛乳房炎診斷及防治工作。*

S857.26

B

1007-5038(2017)11-0117-05