曹國弟，張玉良，張孝清，孫子龍

(1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西朔州 036002；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

圍產(chǎn)期氟暴露對仔鼠焦慮行為的影響

曹國弟1，2，張玉良2，張孝清1，孫子龍2

(1.朔州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西朔州 036002；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

氟對機體的神經(jīng)毒性漸漸引起了人們的重視，為研究氟中毒對小鼠焦慮行為的影響，采用高架O迷宮檢測斷奶仔鼠的行為學(xué)，用Smart V 3.0跟蹤系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，分析仔鼠行為學(xué)變化。母鼠在圍產(chǎn)期的飲用水中分別添加0、25、50、100 mg/L氟化鈉，仔鼠出生21日齡開始檢測其行為學(xué)變化。結(jié)果與對照組相比，加氟組進入開放區(qū)的次數(shù)、時間、跑動的路程均減少，說明圍產(chǎn)期氟暴露會增加后代焦慮癥狀的發(fā)生。

氟中毒；焦慮；小鼠；O迷宮

氟是一種微量元素，適量的攝入對人體有益，但過量的氟對機體有害，可導(dǎo)致氟中毒。氟中毒不僅對骨骼和牙齒等硬組織有損害，還對肝、腎、腦等軟組織有損害[1]。氟容易透過各種組織結(jié)合細胞中的原生質(zhì)，對細胞造成損害，破壞細胞的結(jié)構(gòu)和正常的生理狀態(tài)，神經(jīng)組織對氟的敏感性很高，過量的氟進入腦組織后可對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)或生理方面的損傷。長期過量的氟攝入引起動物大腦神經(jīng)細胞的髓鞘異常，小腦浦肯野氏細胞總數(shù)減少，樹突數(shù)目減少，海馬回神經(jīng)細胞、突觸結(jié)構(gòu)、亞顯微結(jié)構(gòu)和功能等均出現(xiàn)病理變化[2-4]。

流行病學(xué)調(diào)查顯示氟中毒患者有頭痛、頭暈、記憶力減退、焦慮等神經(jīng)功能障礙癥狀[5]，試驗表明氟中毒動物表現(xiàn)有震顫、緊張、麻痹等神經(jīng)癥狀[6]。近年來氟中毒對腦損傷的研究成為人們的關(guān)注點。焦慮以過分擔(dān)心、恐懼害怕、頭暈心慌、出汗等為主要癥狀的一種精神疾病，嚴重的影響著人們的正常工作和生活，患者長期患病甚至對身邊的家人和朋友造成不利的影響。本研究建立圍產(chǎn)期小鼠氟暴露模型，通過高架O迷宮檢測仔鼠焦慮情況，分析氟的神經(jīng)毒性，為氟的進一步研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

高架O迷宮，深圳瑞沃德公司產(chǎn)品；Smart V 3.0 tracking system，西班牙Panlab公司產(chǎn)品；氟化鈉(分析純)，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 8周齡健康性成熟的ICR雌鼠40只，雄鼠20只，體重在25 g～30 g，SPF級動物，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠飼料為標(biāo)準的顆粒飼料，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供。小鼠飼養(yǎng)地點為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧場，飼養(yǎng)過程中，12 h/12 h光照/黑暗交替，食物和水自由采食。

購回的小鼠進行1周適應(yīng)性飼養(yǎng)后，每天晚8點進行合籠，雌雄比例為2∶1，次日早晨檢查雌鼠陰道，查到陰道栓的當(dāng)天定為懷孕第0天(gestation day 0,GD0)。懷孕雌鼠隨機分為4組，分別為對照組(C組，去離子水)、低氟組(L組，25 mg/L NaF)、中氟組(M組，50 mg/L NaF)、高氟組(H組，100 mg/NaF)。母鼠懷孕第7天通過飲水?dāng)z氟，仔鼠出生后第21天(PND 21)終止攝氟。仔鼠出生當(dāng)天記為出生后第0天(postnatal day，PND 0)，出生當(dāng)天即分辨雌雄，稱取仔鼠體重。仔鼠出生后第21天(PND 21)每窩隨機選取9只仔鼠進行行為學(xué)檢測。小鼠飼養(yǎng)期間，觀察小鼠的活動情況和精神狀態(tài)。

1.2.2 高架O迷宮試驗(elevated O maze) 高架O迷宮試驗是高架十字迷宮的優(yōu)化裝置，主要用于檢測小鼠焦慮抑郁狀態(tài)，試驗裝置見圖1A，主要是一個高出地面50 cm的圓形平臺(外部直徑40 cm，運動區(qū)域?qū)? cm)和支架組成，圓形平臺由兩個開放區(qū)和兩個封閉區(qū)組成。本裝置以小鼠在開放區(qū)的運動軌跡、持續(xù)時間和進入次數(shù)等來評價其焦慮抑郁狀態(tài)。一般情況下，由于對高懸開放區(qū)的恐懼，小鼠主要在封閉區(qū)活動，但出于探究性和好奇心又會去封閉區(qū)活動。進入開放區(qū)次數(shù)及停留時間與大鼠的焦慮情緒成負相關(guān)，進入開放區(qū)次數(shù)越少，停留時間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴重[7]。

將小鼠放在封閉區(qū)內(nèi)，錄像5 min，錄像結(jié)束，將小鼠放回鼠籠，清理O迷宮中的糞便顆粒和尿洼，用抹布蘸蒸餾水擦一遍O迷宮，干布擦干后，再用蘸有750 mL/L酒精的抹布擦一遍，晾干后開始下一次試驗。進入開放臂次數(shù)及停留時間與大鼠的焦慮情緒成負相關(guān)，進入開放臂次數(shù)越少，停留時間越短，說明老鼠的焦慮情緒越嚴重。

2 結(jié)果

2.1 小鼠生長狀態(tài)觀察

母鼠在飼養(yǎng)過程中采食、飲水正常，沒有出現(xiàn)死亡等現(xiàn)象，出生后的仔鼠生長正常。

2.2 高架O迷宮試驗結(jié)果

高架O迷宮試驗結(jié)果如圖1、圖2。由圖1B、C兩幅圖可以看出，高氟組仔鼠在開放區(qū)活動的軌跡比對照組增多。由圖2可知，與對照組相比，隨著氟劑量的增加，仔鼠進入開放區(qū)的時間呈下降趨勢，且在高氟組時差異顯著(P<0.05)；加氟組小鼠在開放區(qū)運動的距離與對照組比均有所減少，高氟組顯著減少(P<0.05)；加氟組進入開放區(qū)的次數(shù)減少，在低氟組和高氟組差異顯著。

A.高架O迷宮俯瞰圖；B.對照組仔鼠運動軌跡；C.高氟組仔鼠運動軌跡

A.Bird view of the elevated O maze; B.Movement track of the mice in control group; C.Movement track of the mice in high fluoride group

圖1高架O迷宮實物圖與小鼠行動軌跡圖

Fig.1 Elevated O maze figure and movement tracks in mice

3 討論

氟中毒是一種全身性疾病，主要癥狀是以氟斑牙、氟骨癥為代表的硬組織損傷，嚴重的氟骨癥患者會殘疾、癱瘓等[8]。隨著對氟中毒研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)氟中毒患者常伴有頭痛、頭暈、記憶力減退、焦慮抑郁等神經(jīng)癥狀。1937年美國的shoutt等首次報道氟骨癥患者伴有神經(jīng)癥狀以后，人們開始重視氟中毒的神經(jīng)毒性研究[5]。大量的流行病學(xué)調(diào)查顯示焦慮的發(fā)生情況在氟中毒病區(qū)較嚴重。大量試驗研究證實，過多的氟可通過血腦屏障蓄積在腦組織，引起腦組織形態(tài)、功能的變化[9]。氟中毒對行為的影響也得到了證實，調(diào)查顯示氟中毒病區(qū)兒童的智商的發(fā)生改變[10-13]，動物試驗也肯定了高氟對學(xué)習(xí)記憶能力的負面作用[14]。氟中毒病區(qū)居民的抑郁發(fā)生情況高于正常地區(qū)居民。對氟中毒病區(qū)居民的

心理調(diào)查情況顯示，氟中毒居民會出現(xiàn)生活滿意度降低、社交焦慮、行為改變等癥狀[14]。

本研究中，與對照組相比，圍產(chǎn)期氟暴露仔鼠在開放區(qū)跑動的路程和停留時間均下降，且進入開放區(qū)的次數(shù)減少，說明圍產(chǎn)期氟暴露仔鼠焦慮心理比對照組嚴重。提示圍產(chǎn)期氟暴露會增加后代焦慮癥狀的發(fā)生。分析原因可能有以下幾個方面：氟中毒會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能造成損害，影響神經(jīng)的分化和發(fā)生；氟中毒對腦中的一些酶的活性會造成影響；氟中毒的主要癥狀之一是氟骨癥，氟骨癥會引起身體的一些疼痛，焦慮的發(fā)生可能是這些原因綜合作用的效果。氟中毒與焦慮關(guān)系的機理目前還不很清楚，本次試驗只觀察了氟中毒小鼠焦慮的發(fā)生情況，其發(fā)病機理還有待進一步研究。

圖2 高架O迷宮試驗結(jié)果

[1] Liu F,Ma J,Zhang H,et al.Fluoride exposure during development affects both cognition and emotion in mice[J].Physiol Behavior,2014(124):1-7.

[2] 顧何鋒,張 穎,張凱強,等.氟對大鼠成骨細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子表達影響研究[J].中國實用口腔科雜志,2014(11):665-668.

[3] Yumura S,Itoh Q,Kikuta Y,et al.Cell scale dynamic recycling and cortical flow of the actins-myosin cytoskeleton for rapid cell migration[J].Biol Open,2013,2(2):200-209.

[4] Rao T,Kumari P,Yadav A,et al.Aluminium uptake by some foods from the aluminum cookware during cooking and effect of fluoride on the uptake[J].Der Pharma Chem,2014,6(3):1-5.

[5] 李 沖.高氟對體外培養(yǎng)SD大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)細胞毒性研究[D].河南鄭州：河南科技學(xué)院,2014.

[6] Wang B,Zhao J H,Yu M,et al.Disturbance of intracellular calcium homeostasis and CaMKII/CREB signaling is associated with learning and memory impairments induced by chronic aluminum exposure[J].Neurotoxic Res,2014,26(1):52-63.

[7] 孫世光.高架〇迷宮實驗：昆明小鼠狀態(tài)焦慮動物模型的重測信度研究[J].中國藥理學(xué)通報,2016(1):133-137.

[8] 吳 宇,張 華,謝 春,等.妊娠期和哺乳期持續(xù)氟鋁聯(lián)合暴露對仔鼠海馬環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A-環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白信號通路的影響[J].環(huán)境與健康雜志,2015,(12):1001-5914.

[9] 趙 蕾.氟對小鼠生殖細胞結(jié)構(gòu)和早期受精胚胎DNA甲基化的影響[D].吉林吉林：吉林大學(xué),2016.

[10] 李薛燕,黃文麗.氟中毒致機體損傷及其機制[J].國外醫(yī)學(xué)(醫(yī)學(xué)地理分冊)，2015,36(3):186-189.

[11] 徐曉虹,竹慶杰,楊艷玲,等.出生前后DEHP暴露對小鼠神經(jīng)行為的影響[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2015,38(1):15-22.

[12] 白愛梅,李 躍,范中學(xué),等.燃煤污染型氟砷中毒病區(qū)兒童智力水平和生長發(fā)育狀況調(diào)查分析[J].中華地方病學(xué)雜志,2014,33(2):160-163.

[13] 張培華,程 琳.燃煤型地方性氟中毒對兒童體格發(fā)育及智力水平的影響[J].中國地方病防治雜志,2015(6):458-459.

[14] Liu F,Ma J,Zhang H,et al.Fluoride exposure during development affects both cognition and emotion in mice[J].Physiol Behavior,2014,124(2):1-7.

EffectofFluorideExposureDuringPerinatalStageonAnxietyBehaviorsofMousePups

CAO Guo-di1，2，ZHANG Yu-liang2，ZHANG Xiao-qing1，SUN Zi-long2

(1.CollegeofShuozhouVocationalandTechnology,Shuozhou，Shanxi,036002，China; 2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi,030801,China)

The neurotoxicity of fluorine has gradually aroused people's attention.In order to study the effects of fluorosis on anxious behavior in mice,this experiment analyzed the behavior changes in weaned mouse pups adopting the elevated O maze test and using Smart V 3.0 tracking system to collect data.Female mice of perinatal stage were added with 0,25,50,and 100 mg/L sodium fluoride in their drinking water.The behavioral change test was conducted on postnatal day 21 of the mouse offspring.The results showed that compared to the control group,the numbers and time entering open area and running distance were reduced in the mice of add fluoride group,indicating that perinatal fluorine exposure may increase the anxiety incidence of the offspring.

fluorosis; anxiety; mouse; O maze

2016-10-31

國家自然科學(xué)基金項目(31201965)

曹國弟(1980-)，女，山西應(yīng)縣人，講師，碩士，主要從事畜牧獸醫(yī)教學(xué)工作。*

S859.8

A

1007-5038(2017)11-0091-03