成旭東，范文剛，趙振娜，漢武嬌，袁莉剛

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

高原地區(qū)成年藏綿羊和小尾寒羊附睪組織中eNOS差異表達(dá)研究

成旭東，范文剛，趙振娜，漢武嬌，袁莉剛*

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070)

采用免疫組化SP法結(jié)合IPP統(tǒng)計(jì)分析法，比較高原地區(qū)成年藏綿羊和小尾寒羊附睪組織中eNOS的定位及分布特征。平均光密度數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，eNOS的平均光密度值在藏綿羊附睪尾部顯著高于附睪頭和附睪體(P<0.05)，藏綿羊附睪頭和附睪體之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，但在小尾寒羊附睪體顯著高于附睪頭(P<0.05)。小尾寒羊附睪體的平均光密度值顯著高于藏綿羊(P<0.05)，附睪頭和附睪尾之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，eNOS的活性在附睪尾部最高，提示NO與精子運(yùn)輸相關(guān)，對(duì)于高原地區(qū)不同品種綿羊附睪中eNOS分布較大差異的原因尚需深入研究。

內(nèi)皮型一氧化氮合酶；藏綿羊；小尾寒羊；附睪；免疫組織化學(xué)SP法

一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)有神經(jīng)元型(nNOS)、誘導(dǎo)型(iNOS)和內(nèi)皮型(eNOS)三個(gè)同工酶亞型。eNOS參與合成一氧化氮(NO)，而NO作為一種調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程的信號(hào)分子，其中與附睪局部分泌及精子發(fā)生等生理活動(dòng)均有密切關(guān)系。目前關(guān)于NOS的研究方向包括氧化應(yīng)激[1-2]、鋅缺乏與細(xì)胞免疫應(yīng)答[3-4]、缺血再灌注[5]。Ha T Y等[6]發(fā)現(xiàn)，上述3種NOS定位于馬附睪上皮；Zini A等[7]發(fā)現(xiàn)eNOS蛋白共定位陽(yáng)性區(qū)域取決于NADPH黃遞酶的活性，eNOS定位于人的附睪和輸精管上皮。附睪為精子成熟提供了特殊的酸性環(huán)境，精子成熟主要通過(guò)精子與附睪管腔液蛋白的相互作用改變精子膜表面成分。Herrero M B等[8]應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)NOS主要分布在人和小鼠精子的頂體和尾部,提示 NO與精子的運(yùn)動(dòng)、獲能以及頂體反應(yīng)密切相關(guān)。

藏綿羊是我國(guó)畜種遺傳資源中寶貴的基因庫(kù)，其總?cè)后w具有豐富的遺傳多樣性。小尾寒羊?qū)倜晒叛蛳?，其遺傳性能穩(wěn)定、生長(zhǎng)發(fā)育快、繁殖力及適應(yīng)性強(qiáng)，被國(guó)家定為名畜良種，蒙古羊與藏綿羊間具有一定的遺傳親緣關(guān)系，二者在青海、甘肅等地均能正常生長(zhǎng)繁育。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)研究了成年藏綿羊和小尾寒羊附睪eNOS的表達(dá)分布特點(diǎn)，分析高原地區(qū)不同品種綿羊附睪中eNOS的分布及變化特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)用動(dòng)物 2015年1 月份在甘肅省武威天祝牧區(qū)通過(guò)外科去勢(shì)手術(shù)分別采集成年藏綿羊和小尾寒羊(經(jīng)齒齡鑒別法確定3歲齡)睪丸(附有附睪)各10 對(duì)，40 mL/L多聚甲醛溶液固定。

1.1.2 主要藥品試劑 兔抗羊內(nèi)皮型一氧化氮合酶抗體(bs-0163R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；免疫組化染色試劑盒(SP-0023)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DAB 顯色試劑盒(ZLI-9018)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 組織化學(xué)樣本制備和觀察 新鮮組織樣品經(jīng)40 mL/L多聚甲醛溶液固定,修成1 cm×1 cm×0.6 cm 大小，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，Epon812包埋機(jī)進(jìn)行包埋，LKB8800型超薄切片機(jī)連續(xù)切片，切片厚5 μm，進(jìn)行蘇木精-伊紅(H.E)常規(guī)染色。

1.2.2 免疫組化染色 采用免疫組化SP(streptavidin-perosidase)法進(jìn)行染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟，梯度酒精分化；高壓修復(fù)抗原后，加30 g/L H2O2水溶液封閉過(guò)氧化物酶10 min，正常山羊血清白蛋白孵育15 min 后；每張切片滴加50 μL一抗內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS) (稀釋度1∶100)，37℃孵育2 h，PBS振洗后每張切片滴加50 μL二抗生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG工作液，后加50 μL辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育滴加新鮮配制DAB顯色液，常規(guī)脫水透明、封片，陰性對(duì)照以PBS替代一抗進(jìn)行染色。

2 結(jié)果

2.1 eNOS在成年藏綿羊附睪組織的分布

高原型藏綿羊各附睪管上皮均可見(jiàn)主細(xì)胞呈高柱狀分布(圖1A)，管周肌樣細(xì)胞胞核呈長(zhǎng)梭形圍繞各附睪管固有膜外周(圖1B)，間質(zhì)結(jié)締組織發(fā)達(dá)，附睪頭和附睪體管腔內(nèi)纖毛較長(zhǎng)，而附睪尾管腔內(nèi)纖毛較短(圖1C)。

A～C.eNOS在成年藏綿羊附睪頭、體、尾部的免疫組織化學(xué)染色,標(biāo)尺示20 μm；G～I(xiàn).eNOS在成年小尾寒羊附睪頭、體、尾部的免疫組織化學(xué)染色,標(biāo)尺示20 μm；D～F,J～L均為相應(yīng)免疫組化染色陰性對(duì)照,標(biāo)尺示20 μm;TED.睪丸輸出管；ED.附睪管；SD.輸精管；MC.主細(xì)胞；BC.基細(xì)胞；PC.管周肌樣細(xì)胞；SV.小血管(↑)；SZ.精子；CA.纖毛

A-C.Immunohistochemical staining of eNOS in Plateau adult Tibet sheep Epididymis.Bar= 20 μm;G-I.Immunohistochemical staining of eNOS in Plateau Small-TailHan sheep Epididymis.Bar= 20 μm;D-F,J-L.Immunohistochemical negative contrast,Bar= 20 μm;TED.Testicular efferent duct;ED.Epididymal duct;SD.Seminiferous duct; MC.Main cells;BC.Base cells.PC.Peritubular myoid cells；SV.Small vessel (↑);SZ.Spermatozoon;CA.Cilia

圖1 eNOS在高原地區(qū)成年藏綿羊與小尾寒羊附睪免疫組織化學(xué)染色比較(400×)

Fig.1 Immunohistochemical staining of eNOS in epididymis of plateau adult Tibet sheep and small-tail Han sheep(400×)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，eNOS免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈淡黃色，定位于血管壁與附睪間質(zhì)，細(xì)胞核經(jīng)蘇木素復(fù)染呈淡藍(lán)色。附睪頭部管腔內(nèi)未見(jiàn)明顯精子分布，400倍顯微鏡下間質(zhì)組織陽(yáng)性表達(dá)明顯，血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1A)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1D)；附睪體間質(zhì)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，400倍鏡下間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，間質(zhì)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖1B)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1E)；附睪尾部，400倍鏡下間質(zhì)的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，間質(zhì)可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，腔內(nèi)可見(jiàn)精子分布(圖1C)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1F)。管腔上皮和精子表面均未見(jiàn)明顯表達(dá)(圖 1A、B、C)。

2.2 eNOS在小尾寒羊附睪組織上的分布

光鏡下，高原地區(qū)小尾寒羊附睪各管腔上皮主細(xì)胞呈高柱狀分布(圖1G)管周肌樣細(xì)胞胞核呈長(zhǎng)梭形圍繞各附睪管固有膜外周(圖1H)，大量成熟精子分布于腔面，附睪尾管腔內(nèi)纖毛較附睪頭和附睪體短(圖1I)，與藏綿羊附睪管腔上皮纖毛結(jié)構(gòu)類似。

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,eNOS主要定位于管腔上皮。附睪頭部睪丸輸出管間質(zhì)可見(jiàn)微弱陽(yáng)性表達(dá)，400倍鏡下管腔上皮可見(jiàn)微弱陽(yáng)性表達(dá)，腔內(nèi)未見(jiàn)精子分布(圖1G)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1J)；附睪管間質(zhì)可見(jiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，400倍鏡下管腔上皮可見(jiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖1H)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1K)；附睪尾部輸精管管腔內(nèi)可見(jiàn)大量精子分布，管腔上皮可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖1I)，陰性對(duì)照無(wú)表達(dá)(圖1L)。血管內(nèi)皮細(xì)胞和精子表面均未見(jiàn)明顯表達(dá)(圖 1G、H、I)。

2.3 eNOS在高原地區(qū)成年藏綿羊和小尾寒羊附睪組織平均光密度統(tǒng)計(jì)

免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示(表1，圖2)，橫向比較，eNOS的平均光密度值在藏綿羊附睪尾部顯著高于附睪頭和附睪體(P<0.05)，藏綿羊附睪頭和附睪體之間的平均光密度值無(wú)顯著差異(P>0.05)。但在小尾寒羊附睪體的平均光密度值顯著高于附睪頭(P<0.05)?？v向比較，藏綿羊和小尾寒羊相比，小尾寒羊附睪體的平均光密度值顯著高于藏綿羊(P<0.05)，附睪頭和附睪尾之間的平均光密度值無(wú)顯著差異(P>0.05)。

3 討論

3.1 eNOS在成年藏綿羊和小尾寒羊附睪頭部表達(dá)的分布比較

附睪頭作為睪丸輸出部，其管腔上皮為假?gòu)?fù)層柱狀纖毛上皮，管腔呈規(guī)則橢圓形且未見(jiàn)有游離精子分布，具有大量較濃密的長(zhǎng)纖毛，其分泌吸收功能主要由主細(xì)胞承擔(dān)完成。鐘壘等[9]發(fā)現(xiàn)，在雌激素α受體(ERα)介導(dǎo)下的雌激素對(duì)睪丸輸出管管腔液的重吸收具有重要的調(diào)節(jié)作用，推測(cè)可通過(guò)介導(dǎo)ERα增加睪丸輸出管中NO的產(chǎn)生來(lái)調(diào)節(jié)精子的成熟與發(fā)育。蘇杰等[10]發(fā)現(xiàn)雄激素能上調(diào)原代培養(yǎng)的大鼠附睪頭部上皮細(xì)胞中Bin1b(β防御素樣分子)的表達(dá)，而β防御素可能在宿主天然防御和精子成熟過(guò)程中雙重作用[11]。結(jié)合本研究，與藏綿羊相比，小尾寒羊eNOS在附睪頭部的表達(dá)主要定位于睪丸輸出管管腔上皮細(xì)胞，其柱狀纖毛上皮呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。

與附睪尾部及小尾寒羊分別進(jìn)行橫向和縱向比較,同行(大寫(xiě))或同列(小寫(xiě))所標(biāo)字母大小寫(xiě)不同表示差異性顯著(P<0.05)

Compared with the AOD of the cauda epididymis and small-tail han sheep,peer (capital) or the same column (lowercase) of the letters of different sizes indicate significant difference (P<0.05)

圖2高原地區(qū)成年藏綿羊和小尾寒羊附睪中eNOS的平均光密度檢測(cè)

Fig.2 The AOD of eNOS in epididymis of plateau adult Tibet sheep and small-tail Han sheep

3.2 eNOS在成年藏綿羊和小尾寒羊附睪體部表達(dá)的分布比較

研究表明，附睪體作為未成熟精子到成熟精子的過(guò)渡部位，在精子獲得運(yùn)動(dòng)能力過(guò)程中起關(guān)鍵作用[12]。NO可以通過(guò)作為細(xì)胞內(nèi)外信使，激活鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶sGC生成第二信使cGMP，從而完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]，控制附睪上皮基膜和間質(zhì)合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，最終完成其對(duì)精子成熟的調(diào)控。羅紅梅等[14]發(fā)現(xiàn)，eNOS在小鼠附睪間質(zhì)、血管及平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)。這與本研究eNOS在藏綿羊附睪的定位分布一致。Dun NJ[15]發(fā)現(xiàn)，NOS 在附睪內(nèi)的分布與乙膽堿酯酶在附睪內(nèi)的分布極為相似，這表明NO可能與腺體的分泌及平滑肌的收縮密切相關(guān)，推測(cè)NO作為舒血管因子，通過(guò)對(duì)血管平滑肌的控制，完成對(duì)附睪局部微循環(huán)的調(diào)節(jié)。本研究中藏綿羊附睪體eNOS的表達(dá)主要見(jiàn)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，提示NO在此處可能參與局部微循環(huán)調(diào)節(jié)。與此相比，eNOS在小尾寒羊的表達(dá)主要定位于附睪管管腔上皮細(xì)胞，其假?gòu)?fù)層柱狀上皮的纖毛呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。1978年，Eng[16]在兔精漿中提取出了附睪體部主細(xì)胞合成分泌的頂體穩(wěn)定因子(ASF),其主要作用是維持精子在附睪成熟過(guò)程中的去能狀態(tài)。

3.3 eNOS在成年藏綿羊和小尾寒羊附睪尾部表達(dá)的分布比較

附睪尾作為輸精管前部，其分泌吸收功能主要由主細(xì)胞和亮細(xì)胞承擔(dān)完成。李聰?shù)萚17-18]發(fā)現(xiàn)，高原地區(qū)成年藏綿羊和小尾寒羊附睪尾間質(zhì)膠原纖維和網(wǎng)狀纖維的分布較附睪頭和附睪體多，附睪各部分中PAS的反應(yīng)強(qiáng)弱與附睪上皮分泌功能的變化密切相關(guān),附睪尾輸精管和附睪頭的分泌功能均較附睪體增強(qiáng)。楊棟慧等[19]發(fā)現(xiàn)高原哺乳動(dòng)物成年牦牛附睪管腔外周網(wǎng)狀纖維與膠原纖維分布一致，且在附睪尾較為豐富，可能與其收縮能力較強(qiáng)及精子運(yùn)輸有關(guān)，推測(cè)NO參與運(yùn)輸精子可能與其豐富的管腔外周纖維相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，成年雄性Sprague Dawley大鼠NOS的活性在附睪尾段和輸精管最高，與本研究eNOS在小尾寒羊附睪的定位相一致，推測(cè)NO與精子運(yùn)輸相關(guān)。

本研究表明，eNOS在藏綿羊附睪的表達(dá)定位于附睪間質(zhì)和血管內(nèi)皮細(xì)胞，與藏綿羊相比，小尾寒羊附睪eNOS的表達(dá)與分布有其獨(dú)特性，其主要定位于管腔上皮；eNOS的活性在小尾寒羊附睪體部比藏綿羊高，推測(cè)其可能與管腔上皮的分泌相關(guān)。eNOS的活性在附睪尾部最高，推測(cè)NO與精子運(yùn)輸相關(guān)，對(duì)于高原地區(qū)不同品種綿羊附睪中eNOS分布較大差異的原因尚需深入研究。

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DifferentialDistributionofeNOSinEpididymistissuesofPlateauAdultTibetanSheepandSmall-TailHanSheep

CHENG Xu-dong,FAN Wen-gang,ZHAO Zhen-na,HAN Wu-jiao,YUAN Li-gang

(CollegeofVeterinaryMedicine,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,Gansu,730070,China)

Immunohistochemical SP method combined with Image-Pro Plus was used to compare the distribution of eNOS in the epididymis of plateau adult Tibetan sheep and small-tail Han sheep.The AOD data showed that eNOS in the cauda epididymis is significantly higher than that in caput and corpus epididymis (P<0.05),and no significant difference between the caput and corpus epididymis in the Tibetan sheep (P>0.05).But eNOS in the corpus epididymis is significantly higher than in caput epididymis of small-tail Han sheep (P<0.05).eNOS in the corpus epididymis of small-tail Han sheep is significantly higher than that of Tibetan sheep(P<0.05),and there are no significant difference between the caput and cauda epididymis(P>0.05).The highest activity of eNOS in the cauda epididymis may relate to transporting sperm.The reasons for the distribution difference need further study on eNOS in the epididymis of different breeds of plateau sheep.

endothelial nitric oxide synthase (eNOS); Tibetan sheep; small-tail Han sheep; epididymis; immunohistochemical SP method

2017-03-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31160488)；甘肅省基本科研業(yè)務(wù)項(xiàng)目基金(2012)；甘肅省農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(20150323)

成旭東(1993-)，男，甘肅天水人，碩士，主要從事動(dòng)物發(fā)育生物學(xué)研究。*

S858.24

A

1007-5038(2017)11-0061-05