張集祥，孔 雪，王 軍，王政富，陳 芳，趙海全，劉為民

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231)

雞海馬結(jié)構(gòu)傳入纖維的腦干及小腦起始核—HRP逆行示蹤法

張集祥，孔 雪，王 軍，王政富，陳 芳，趙海全，劉為民*

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528231)

研究雞海馬結(jié)構(gòu)的傳入纖維在腦干及小腦內(nèi)的起始核。將40%辣根過氧化物酶(HRP)水溶液注入雞左端腦海馬結(jié)構(gòu)，逆行追蹤投射到海馬結(jié)構(gòu)的纖維在腦干和小腦內(nèi)的起始核。結(jié)果在腦干的淺小細(xì)胞核(SPC)、圓下核(SRt)、蔡氏區(qū)(AVT)和小腦的第Ⅰ～Ⅹ葉浦肯野細(xì)胞層內(nèi)均出現(xiàn)被標(biāo)記的神經(jīng)元。初步表明上述部位為端腦海馬結(jié)構(gòu)的起始核。

雞；海馬結(jié)構(gòu)；辣根過氧化物酶；逆行追蹤；起始核

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，海馬結(jié)構(gòu)作為邊緣系統(tǒng)的一部分，在學(xué)習(xí)、記憶、情緒、內(nèi)臟活動(dòng)中扮演著重要角色。O'Keefe J在1978年發(fā)表了其代表作“Hippocampal place unites in the freely moving rat:Why they fire where they fire”，標(biāo)志著人們對(duì)海馬結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)有了突破性進(jìn)展，從而認(rèn)識(shí)到海馬結(jié)構(gòu)在動(dòng)物體的空間認(rèn)知和空間記憶方面發(fā)揮著重要作用[1]。繼O'Keefe J在海馬發(fā)現(xiàn)“位置細(xì)胞”后，人們又相繼發(fā)現(xiàn)“網(wǎng)絡(luò)細(xì)胞”和“邊緣細(xì)胞”，它們都存在于海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)，在動(dòng)物行為中發(fā)揮著定位系統(tǒng)的作用[2]。

在禽類，已經(jīng)有較多的報(bào)道表明海馬結(jié)構(gòu)在功能、細(xì)胞構(gòu)筑、纖維聯(lián)系、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)諸方面與哺乳動(dòng)物有許多相似之處，特別是在空間導(dǎo)航和空間記憶方面[3-4]。幾十年來，學(xué)者們對(duì)禽類海馬結(jié)構(gòu)的纖維聯(lián)系的研究較多的是在鴿子和斑雀上進(jìn)行的，對(duì)雞的研究仍待補(bǔ)充。本實(shí)驗(yàn)室前期曾采用DiI注射海馬結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在端腦的副高紋狀體、內(nèi)側(cè)隔核、古紋狀體、帶核和后背外側(cè)區(qū)出現(xiàn)標(biāo)記神經(jīng)元，但除了在端腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記神經(jīng)元外，腦干和小腦等均未發(fā)現(xiàn)標(biāo)記神經(jīng)元[5]。為此，本試驗(yàn)應(yīng)用辣根過氧化物酶(HRP)逆行追蹤法進(jìn)一步示蹤腦干和小腦的起始核，以便全面了解雞海馬結(jié)構(gòu)的傳入聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2月齡～3月齡粵禽黃雞20只，雌雄不拘，體重約1.0 kg～1.5 kg，均購自佛山種雞場。

1.1.2 主要試劑 多聚甲醛購自天津百世化工有限公司；戊二醛購自天津大茂化學(xué)試劑廠；水合氯醛(分析純)購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP,RZ=3,SigmaⅣ型)、硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉,sodium nitroferricyanide)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺,TMB)均購自Sigma-Aldrich公司。

1.1.3 主要儀器 江灣Ⅰ型C小動(dòng)物腦立體定位儀，上海奧爾科特生物科技有限公司產(chǎn)品；KD-500型推拉式三用切片機(jī)，KD-Ⅳ電腦快速制冷器，浙江科迪儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；1 μL微量進(jìn)樣器，上海光正醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；Tiger顯微圖像分析系統(tǒng)，暨南大學(xué)組織與胚胎學(xué)教研室研制。

1.2 方法

HRP逆行追蹤，按2 mL/kg經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行全麻，將動(dòng)物固定于江灣Ⅰ型C小動(dòng)物腦立體定位儀，外科方法開顱，將已吸取40% HRP水溶液的玻璃微針(內(nèi)徑20 μm～40 μm)固定于立體定位儀的電極夾持器上，在正中矢狀面(以矢狀竇判定)稍偏左側(cè)的部位向端腦海馬進(jìn)針[6]，注射量0.6 μL，留針15 min后縫合創(chuàng)口。術(shù)后存活3 d，按Mesulam(1982)[7]方法灌注固定，取端腦兩半球、小腦和腦干，翌日制冰凍連續(xù)切片，片厚40 μm。切片經(jīng)TMB成色，自然干燥后中性紅復(fù)染，脫水、透明、中性樹脂封片后顯微鏡觀察，拍照。

2 結(jié)果

2.1 注射點(diǎn)位置

德國學(xué)者Redies C[8]和西班牙學(xué)者Suárez J[9]將雞的海馬結(jié)構(gòu)劃分為6個(gè)部分，分別為海馬(hippocampus,Hp)、旁海馬內(nèi)側(cè)區(qū)(medial subdivision of parahippocampus,APHm)、旁海馬中間內(nèi)側(cè)區(qū)(medial part of the intermediate subdivision of parahoppocampus,APHim)、旁海馬中間外側(cè)區(qū)(lateral part of the intermediate subdivision of parahoppocampus,APHil)、旁海馬外側(cè)區(qū)(lateral part of parahippocampus,APHl)以及后背外側(cè)區(qū)(area corticoidea dorsolateralis,CDL)。本試驗(yàn)將HRP注射左側(cè)海馬結(jié)構(gòu)，注射點(diǎn)選擇在旁海馬中間區(qū)(intermediate subdivision of parahoppocampus,APHi)和內(nèi)側(cè)區(qū)之間，以往進(jìn)針點(diǎn)的數(shù)據(jù)為：在雞左腦離原點(diǎn)左0.5 mm，前后4 mm～8 mm處注射，注射角度為向正中矢狀面傾斜3°，進(jìn)針1.5 mm左右。本試驗(yàn)的注射點(diǎn)較為理想，注射點(diǎn)位于在APHi與APHm之間(圖1)。

距“0”點(diǎn)向前8.8 mm，黑色箭頭示注射方向及深度。Hp為海馬；APHm為旁海馬內(nèi)側(cè)區(qū)；APHi為旁海馬中間區(qū)；APHl為旁海馬外側(cè)區(qū)；VL為側(cè)腦室

At the level of 8.8 mm anterior to the zero point,the black arrowhead showed the injection direction and depth.Hp is hippocampus; APHm is medial subdivision of parahippocampus; APHi is intermediate subdivision of parahippocampus; APHl is lateral part of parahippocampus; VL is lateral ventrical

圖1左側(cè)端腦海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)HRP注射點(diǎn)(中性紅染色，40×)

Fig.1 The injection site of HRP in the left telencephalon
(Stained with neutral red,40×)

2.2 間腦內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元

腦干內(nèi)雙側(cè)淺小細(xì)胞核可見少量標(biāo)記神經(jīng)元，胞內(nèi)標(biāo)記顆粒較大且密集(圖2C)；注射側(cè)圓下核可見大量標(biāo)記神經(jīng)元，胞內(nèi)分布大量細(xì)小的標(biāo)記顆粒(圖2D)；注射側(cè)蔡氏區(qū)可見少數(shù)標(biāo)記細(xì)胞，胞內(nèi)標(biāo)記顆粒分布稀疏且細(xì)小(圖2E)。

2.3 小腦內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元

雞小腦內(nèi)Ⅰ～Ⅹ葉皮質(zhì)的浦肯野細(xì)胞層中均發(fā)現(xiàn)被逆行標(biāo)記的浦肯野細(xì)胞，其中Ⅷ、Ⅸ、Ⅹ葉的標(biāo)記細(xì)胞最多，標(biāo)記細(xì)胞以對(duì)側(cè)較多，細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記顆粒針點(diǎn)狀密集分布(圖3)。

3 討論

3.1 海馬結(jié)構(gòu)與腦干的纖維聯(lián)系

已知哺乳類海馬結(jié)構(gòu)可從5個(gè)感覺系統(tǒng)(嗅覺、視覺、聽覺、體感和三叉神經(jīng)感覺)接收間接信息，其中間腦是主要的傳入途徑之一。在腦干中，海馬結(jié)構(gòu)接收來自淺小細(xì)胞核(nucleus superficialis parvicellularis,SPC)、外側(cè)下丘腦區(qū)(regio lateralis hypothalami,LHy)、后線核(nucleus lineariscaudalis,LC)和乳頭體區(qū)的傳入[10]，同時(shí)也接收源自藍(lán)斑核(locus ceruleus,LoC)和蔡氏區(qū)(area ventralis,Tsai,AVT)的兒茶酚胺能傳入纖維，來自LC的傳入纖維屬于5-羥色胺能。另外，丘腦旁正中內(nèi)核(nucleus paramedianus internus thalami,PMI)和圓下核(nucleus subrotundus,SRt)的纖維也可投射到旁海馬。在本試驗(yàn)在雞的間腦SPC、AVT和SRt均可觀察到逆標(biāo)神經(jīng)元，說明海馬結(jié)構(gòu)接收來自這些區(qū)域的投射，而AVT和SRt同是高階的內(nèi)臟感覺系統(tǒng)的一部分，這佐證了禽類海馬結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物的海馬結(jié)構(gòu)一樣屬于邊緣系統(tǒng)的一部分，與內(nèi)臟活動(dòng)有密切的聯(lián)系。然而，雖然國外學(xué)者Casini在鴿子的海馬結(jié)構(gòu)注射HRP也在SPC上發(fā)現(xiàn)標(biāo)記神經(jīng)元，但他在以往的研究中認(rèn)為SPC僅僅向副高紋狀體投射而已，其通過纖維聯(lián)系將體表感覺傳入副高紋狀體中，而SPC與海馬結(jié)構(gòu)的聯(lián)系未見其闡明原因。在研究小腦與海馬結(jié)構(gòu)的聯(lián)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，小腦有向丘腦背中前腹核(nucleus dorsalisintermedius ventralis anterior，DIVA)的直接投射，但是DIVA卻向副高紋狀體投射而非海馬結(jié)構(gòu)。而DIVA正好位于SPC腹側(cè)，兩個(gè)核團(tuán)相距較近，是否存在DIVA向SPC的投射，值得探討。如果是，則小腦就有了向海馬投射的清晰的神經(jīng)通路，其通路可能為“小腦→DIVA→SPC→海馬結(jié)構(gòu)”，但這仍需通過試驗(yàn)進(jìn)一步證明。

3.2 海馬結(jié)構(gòu)與小腦的纖維聯(lián)系

通常認(rèn)為小腦向端腦的投射是間接的，即由浦氏細(xì)胞發(fā)出纖維到達(dá)小腦深核，換元后投向丘腦腹前核或腹外側(cè)核(VA/VL)，再換元后投射到大腦皮質(zhì)的運(yùn)動(dòng)區(qū)和運(yùn)動(dòng)前區(qū)，全程經(jīng)過了三級(jí)神經(jīng)元。袁文菊等[11]曾在小腦注射HRP逆行追蹤海馬結(jié)構(gòu)向小腦的直接投射，在端腦海馬結(jié)構(gòu)出現(xiàn)標(biāo)記細(xì)胞，而本試驗(yàn)將HRP注射海馬結(jié)構(gòu)后在小腦浦肯野細(xì)胞層可發(fā)現(xiàn)大量的逆標(biāo)細(xì)胞，說明不僅僅有小腦向海馬的直接投射，而且存在海馬向小腦的直接投射，形成小腦與海馬結(jié)構(gòu)的投射環(huán)路。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為正常成年哺乳動(dòng)物端腦與小腦之間不存在直接投射，僅存在間接投射，但若試驗(yàn)性地去除某些小腦的傳入纖維的起始核，則可出現(xiàn)端腦向小腦的直接投射。這表明在小腦傳入投射的靶核上存在著某種競爭機(jī)制，且隨著發(fā)育而逐漸穩(wěn)定下來。在動(dòng)物的幼年時(shí)期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚未完善，存在不同來源神經(jīng)投射的相互競爭[12]。朱寧等[13]研究表明海馬結(jié)構(gòu)的神經(jīng)聯(lián)系在發(fā)育過程中不斷地清除出生后大量的異常的神經(jīng)聯(lián)系，從而達(dá)到神經(jīng)系統(tǒng)的高效性，避免冗余和錯(cuò)誤建設(shè)。本試驗(yàn)采用2月齡～3月齡的小雞發(fā)現(xiàn)小腦浦氏細(xì)胞直接投射到海馬結(jié)構(gòu)，表明可能是一種幼年期的現(xiàn)象，至于在成年動(dòng)物中是否仍然存在這種投射，有待進(jìn)一步研究。

A.腦干內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(黑點(diǎn))出現(xiàn)的區(qū)域，距“0”點(diǎn)向前6.0 mm；B.腦干內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(黑點(diǎn))出現(xiàn)的區(qū)域，距“0”點(diǎn)向前3.6 mm；C.淺小細(xì)胞亞核內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(中性紅染色，400×)；D.圓下核內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(中性紅染色，400×)；E.蔡氏區(qū)內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(中性紅染色，400×)。黑色箭頭示標(biāo)記神經(jīng)元；SPC為淺小細(xì)胞亞核；SRt為圓下核；AVT為蔡氏區(qū)；Ru為紅核；NⅢ為動(dòng)眼神經(jīng)

A.The labeled neurons (dots) in different regions in the brainstem,at the level of 6.0 mm anterior to the zero point; B.The labeled neurons (dots) in different regions in the brainstem,at the level of 3.6 mm anterior to the zero point; C.The labeled neurons in the nucleus superficialis parvicellularis(Stained with neutral red,400×); D.The labeled neurons in the nucleus subrotundus(Stained with neutral red,400×); E.The labeled neurons in the area ventralis(Stained with neutral red,400×).The black arrowhead showed the labeled neurons; SPC.Nucleus superficialis parvicellularis; SRt.Nucleus subrotundus; AVT.Area ventralis(Tsai); Ru.Nucleus ruber; NⅢ.Nervus oculomtorius

圖2 HRP注射左端海馬結(jié)構(gòu)后腦干內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元

Fig.2 The labeled neurons in the brainstem after injection of HRP in the left horseradish peroxidase

A.小腦內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元(黑點(diǎn))出現(xiàn)的區(qū)域；B.小腦內(nèi)被標(biāo)記的浦肯野細(xì)胞(中性紅染色，400×)；C.高倍鏡(油鏡)下的被標(biāo)記的浦肯野細(xì)胞(中性紅染色，1 000×)。黑色箭頭示被標(biāo)記的浦肯野細(xì)胞

A.The labeled neurons(dots)in different regions in the cerebellum; B.The labeled purkinje cells in the cerebellum(stained with neutral red,400×); C.The higher magnification(oil immersion objective)of the labeled Purkinje cells in the cerebellum(stained with neutral red,1 000×).The black arrowhead showed the labeled Purkinje cells

圖3 HRP注射左端海馬結(jié)構(gòu)后小腦內(nèi)標(biāo)記神經(jīng)元

Fig.3 The labeled neurons in the cerebellum after injection of HRP in the left horseradish peroxidase

本實(shí)驗(yàn)室前期曾采用DiI注射海馬結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除了在端腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)標(biāo)記神經(jīng)元外，腦干和小腦等均無標(biāo)記神經(jīng)元出現(xiàn)[5]。采用DiI作為逆行示蹤劑，能夠靈敏地在活體試驗(yàn)中短距離內(nèi)示蹤出中樞內(nèi)的傳入神經(jīng)元，但其卻不擅長在活體試驗(yàn)中進(jìn)行長距離的逆行標(biāo)記[14]。本文采取HRP作為逆行示蹤劑，能有效地避免這個(gè)問題。雖然通過將HRP注射到海馬結(jié)構(gòu)初步了解其傳入纖維在腦干和小腦中的起始核，但其具體的傳入路徑仍有待研究，而且研究禽類的神經(jīng)投射在某些方面也對(duì)哺乳動(dòng)物的研究起一定的推進(jìn)作用，尤其在小腦與海馬結(jié)構(gòu)上，本實(shí)驗(yàn)室還將進(jìn)一步研究禽類的海馬結(jié)構(gòu)與小腦的神經(jīng)纖維聯(lián)系及其路徑。

[1] O'Keefe J,Conway D H.Hippocampal place units in the freely moving rat:Why they fire where they fire [J].Exp Brain Res,1978,31:573-590.

[2] Hitier M,Besnard S,Smith P F.Vestibular pathways involved in cognition [J].Front Integ Neurosci,2014,8:59.

[3] Bingman V P,Bagnoli P,Ioal P,et al.Homing behavior of pigeons after telencephalica blations[J].Brain Behav Evol,1984,24:94-108.

[4] Bingman V P,Ioal P,CasiniG,et al.Impaired retention of preoperatively acquired spatial reference memory in homing pigeons following hippocampal ablation[J].Behav Brain Res,1987,24:147-156.

[5] 李少煥，魯 林，劉為民，等.雞海馬結(jié)構(gòu)傳入纖維的端腦起始核DiI法研究[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31(12)：32-36.

[6] 王 娟，劉為民，梁梓森，等.辣根過氧化物酶逆行標(biāo)記雞小腦向海馬結(jié)構(gòu)的直接投射[J].解剖學(xué)雜志，2009，32(3)：374-376.

[7] 鞠 躬，萬選才，董文新.神經(jīng)解剖學(xué)方法[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1985：95-99.

[8] Redies C,Medina L,Puelles L.Cadherin expression by embryonic divisions and derived gray matter structure in the telencephalon of the chicken [J].J Comp Neurol,2001,438:253-285.

[9] Suárez J,Dávila J C,RealM,et al.Calcium-binding proteins,neuronal nitric oxide synthase,and GABA help to distinguish different pallial areas in the developing and adult chicken.I.hippocampal formation and hyperpallium [J].J Comp Neurol,2006,497:751-771.

[10] Atoji Y,Wild J M.Fiber connections of the hippocampal formation and septum and subdivisions of the hippocampal formation in the pigeon as revealed by tract tracing and Kainic acid lesions [J].J Comp Neurol,2004,475:426-461.

[11] 袁文菊.禽類海馬結(jié)構(gòu)直接投射于小腦各葉的神經(jīng)元定位—辣根過氧化物酶(HRP)逆行追蹤法研究[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

[12] Kandler K,Friauf E.Pre- and postnatal development of efferent connections of the cochlear nucleus in the rat [J].J Comp Neurol,1993,328:161-184.

[13] 朱 寧.幾種與神經(jīng)可塑性有關(guān)的分子在出生后小鼠和鳴禽腦內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)[D].北京師范大學(xué)，2006.

[14] 凱賽爾江·多來提，古麗美熱·艾買如拉，廖禮彬，等.DiI對(duì)魚類視覺傳導(dǎo)通路的形態(tài)學(xué)研究[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，26：5012-5015.

BrainstemandCerebellarOriginsofAfferentFiberstoHippocampalFormationinChicken:byRetrogradeTracingwithHRP

ZHANG Ji-xiang,KONG Xue,WANG Jun,WANG Zheng-fu,CHEN Fang,ZHAO Hai-quan,LIU Wei-min

(FoshanUniversity,Foshan,Guangdong,528231,China)

To clarify the brainstem and cerebellum original nuclei of afferent fibers to the hippocampal formation in chicken,40% horseradish peroxidase (HRP) was injected into the hippocampal formation of the left telencephalon in chickens for retrograde tracing the origins of afferent fibers from the brainstem and cerebellum to the hippocampal formation.The labeled neurons appeared in nucleus superficialis parvicellularis (SPC),nucleus subrotundus (SRt) and area ventralis of Tsai (AVT) of the brainstem and Purkinje cells in the cerebellar cortex of the foliumⅠ-Ⅹ of the cerebellum.It indicated that all the parts mentioned above are the original nuclei to the hippocampal formation in chicken.

chicken; hippocampal formation; HRP; retrograde tracing; original nuclei

2017-03-06

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31372389)

張集祥(1991-)，男，廣東潮州人，碩士研究生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究。*

S852.16

A

1007-5038(2017)11-0033-04