王 偉，魏玉圓，翟少華，毛麗萍，皮文輝，簡子健*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

應(yīng)用Gibson Assembly方法構(gòu)建狂犬病病毒SRV9株重組感染性cDNA克隆

王 偉1，魏玉圓1，翟少華1，毛麗萍1，皮文輝2，簡子健1*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052； 2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綿羊遺傳改良和健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832000)

應(yīng)用Gibson Assembly 連接法精確快速構(gòu)建狂犬病病毒SRV9株重組感染性cDNA克隆，為狂犬病病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建提供新的方法。應(yīng)用Gibson Assembly 連接法在同一反應(yīng)體系內(nèi)，將多個片段和經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化的載體，按設(shè)計(jì)的順序進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)多個片段的一步組裝。設(shè)計(jì)帶有20 bp～30 bp重疊序列的PCR引物，擴(kuò)增得到帶有重疊序列的狂犬病病毒5個結(jié)構(gòu)蛋白基因和增強(qiáng)型熒光蛋白基因。擴(kuò)增的片段和線性化的載體經(jīng)膠回收純化后，與Gibson連接液混合后，50℃反應(yīng)60 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定，缺失了病毒偽基因Ψ區(qū)和糖蛋白基因的跨膜區(qū)并且將增強(qiáng)型熒光蛋白基因插入糖蛋白基因終止密碼子前，構(gòu)建了全長17 600 bp的重組質(zhì)粒，完成了重組全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建。

狂犬病病毒；Gibson Assembly連接法；構(gòu)建；感染性cDNA克隆

我國屬于狂犬病的高發(fā)國家，研制新型、安全、穩(wěn)定、高效的疫苗是有效控制狂犬病的重要手段。狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)是第一個利用反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)拯救的單股負(fù)鏈RNA病毒[1]，全長感染性cDNA克隆的構(gòu)建是病毒成功拯救的關(guān)鍵所在。因此，精確快速地構(gòu)建RABV全長感染性cDNA克隆，對于開發(fā)和研制新型疫苗至關(guān)重要。Gibson Assembly連接法自2009年報(bào)道以后，被廣泛的用于人工基因組的合成[2-3]，表達(dá)載體的構(gòu)建[4]，病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建[5-6]，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的組裝[7]，極大地促進(jìn)了基因編輯技術(shù)的發(fā)展。

RABV為單股負(fù)鏈不分節(jié)段的RNA病毒，基因組全長為12 kb左右，包含5個結(jié)構(gòu)蛋白基因：核蛋白(nucleoprotein，N)基因全長1 423 bp，編碼450個氨基酸；磷蛋白(phosphoprotein，P)基因全長990 bp，編碼297個氨基酸；基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)基因全長803 bp，編碼202個氨基酸；糖蛋白(glycoprotein，G)基因全長2 069 bp，編碼524個氨基酸；RNA依賴的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，L)基因全長6 384 bp，編碼2 127個氨基酸。將病毒全長cDNA插入真核表達(dá)載體CMV啟動子下游，利用真核細(xì)胞聚合酶Ⅱ驅(qū)動CMV起始轉(zhuǎn)錄，外加輔助包裝蛋白，從而啟動病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，能夠組裝出完整的病毒顆粒[8]。全長真核表達(dá)質(zhì)粒即感染性cDNA克隆的構(gòu)建，是建立RABV反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的關(guān)鍵。在RABV反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，利用基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變、敲除、插入等，拯救出改造后的病毒可為研制新型、安全、穩(wěn)定、高效的疫苗提供基礎(chǔ)[9]。將標(biāo)記基因eGFP定向插入特定位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)對RABV的標(biāo)記，有利于研究RABV的致病機(jī)制和中和抗體快速測定[5,10-11]。精確快速的組裝RABV全長重組質(zhì)粒，對RABV新型疫苗的研制、致病機(jī)制的研究、病毒的開發(fā)利用和基因功能的研究具有重要意義。

本研究采用Gibson Assembly法將糖蛋白基因(G基因)由原來的第4位移至第2位，缺失了G基因的CD區(qū)132個堿基和偽基因Ψ區(qū)的423個堿基。在G基因的終止密碼子前定點(diǎn)插入了eGFP增強(qiáng)型熒光蛋白基因。成功組裝了狂犬病病毒SRV9株重組全長感染性cDNA克隆，實(shí)現(xiàn)了基因片段的精確快速組裝，為RABV反向遺傳系統(tǒng)的建立、研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pcDNA3.1+載體，Stbl3菌種為Invitrogen公司產(chǎn)品，pMD19-T-N，pMD19-T-G，pMD19-T-PM，pMD19-T-L1，pMD19-T-L2，pMD19-T-L3均由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。Gibson Assembly組裝預(yù)混液為NEB公司產(chǎn)品，DL 2 000 DNA Marker，Primer STAR DNA Polymerase為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，小量質(zhì)粒提取試劑盒為美國OMEGA公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品； peGFP-C1質(zhì)粒為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的SRV9(AF499686)和peGFP-C1的eGFP基因序列設(shè)計(jì)Gibson連接引物，為方便后續(xù)檢測設(shè)計(jì)了2對檢測引物(表1)。通過錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶的切割作用產(chǎn)生精確地3′末端和5′末端可提高病毒的拯救效率[12]。本研究采用PCR的方法將核酶序列添加到了全長質(zhì)粒的兩端，合成序列為：

F:TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGA- GGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTAT- AGTCACGCTTAACAACCAGATCAAAG(下劃線為錘頭狀核酶序列)；

R：GGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTC- GCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGAC- GCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGC- GGGTACCACGCTTAACAAATAAACAAC(下劃線為丁型肝炎核酶序列)。運(yùn)用上游引物F和下游引物NR擴(kuò)增N基因，上游引物L(fēng)3F和下游引物R擴(kuò)增L3基因，可將核酶序列添加到全基因組的兩端。本研究在構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-N和pMD19-T-L3時(shí)，將核酶序列通過PCR加入。

表1 引物名稱及序列

1.2.2 狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白基因和eGFP基因的擴(kuò)增 以pMD19-T-N、pMD19-T-G、pMD19-T-PM、pMD19-T-L1、pMD19-T-L2、pMD19-T-L3、peGFP-C1質(zhì)粒為模板PCR擴(kuò)增狂犬病病毒SRV9株各結(jié)構(gòu)蛋白基因和eGFP增強(qiáng)型熒光蛋白基因。L基因全長為6 475 bp，分為L1、L2、L3三段擴(kuò)增。PM基因中間沒有調(diào)整，所以可以一起擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max mix(2×)25 μL；forward primer 1 μL；reverse primer 1 μL；模板 0.5 μL；RNase Free dH2O 22.5 μL。PCR反應(yīng)條件： 98℃，10 s，60℃，15 s，72℃，15 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物于10 g/L 瓊脂糖凝膠中電泳。按照OMEGA 高純度DNA膠回收純化試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 重組質(zhì)粒pcDNA-L的構(gòu)建 用NheⅠ限制性內(nèi)切酶 (Takara公司)過夜酶切pcDNA3.1+質(zhì)粒，50 μL反應(yīng)體系：10 mol/L buffer 5 μL、質(zhì)粒5 μg、NheⅠ 1 μL、補(bǔ)水至50 μL。酶切產(chǎn)物用OMEGA膠回收試劑盒回收純化。

按照NEB公司Gibson Assembly Master Mix試劑盒操作說明，組裝片段摩爾數(shù)是載體的3倍，配置10 μL連接體系：NheⅠ酶線性化的pcDNA3.1+0.035 4 pmols，L1、L2、L3均為0.106 2 pmols，補(bǔ)水至5 μL，Gibson Assembly Master Mix(2×)連接液5 μL，混勻，PCR儀控溫50℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后立即放在冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

將連接產(chǎn)物加入100 μL Stbl3感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃水浴1 min，立即放在冰上2 min～3 min，加入800 μL LB培養(yǎng)基200 r/min、37℃培養(yǎng)1 h，3 500 r/min離心10 min，棄上清800 μL，輕輕的吹打混勻后涂布于含Amp的平板上，37℃培養(yǎng)12 h～14 h。

1.2.4 pcDNA-L重組質(zhì)粒的菌體PCR檢測 挑取轉(zhuǎn)化的單菌落在含Amp的平板上劃線，37℃培養(yǎng)8 h，挑取少量菌體利用設(shè)計(jì)的檢測引物JCLF/JCLR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。配制25 μL反應(yīng)體系：10×Taqbuffer 2.5 μL；dNTP Mix(2.5 mmol/L)，2 μL；上下游引物各1 μL；TaqDNA polymerase 0.25 μL； RNase Free dH2O，18.25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min；4℃終止反應(yīng)。取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.5 pcDNA-L重組質(zhì)粒的酶切鑒定 用BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒產(chǎn)生187、2 361、2 869、6 666 bp大小的4個片段。酶切體系Fast Digest buffer(10×)2 μL；pcDNA-L、500 ng；BamHⅠ 1 μL；補(bǔ)水至15 μL。37℃水浴2 h，8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 重組質(zhì)粒pcDNA-N-G-eGFP-PM-L的構(gòu)建 全長重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖(圖1)。將鑒定正確的1.2.5中的重組質(zhì)粒pcDNA-L，用NheⅠ限制性內(nèi)切酶線性化后，膠回收純化，按照NEB公司Gibson Assembly Master Mix試劑盒操作說明配置10 μL連接體系：線性化的pcDNA-L質(zhì)粒0.047pmols，N、G、PM、eGFP均為0.141 pmols， 補(bǔ)水至5 μL，Gibson Assembly Master Mix(2×)5 μL輕輕混勻，PCR儀控溫50℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后立即放在冰上進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化步驟同1.2.3中轉(zhuǎn)化步驟。菌體PCR引物為JCNGF/JCNGR，體系同1.2.4中菌體PCR檢測體系。

a.重組質(zhì)粒pcDNA-L的組裝；b.重組質(zhì)粒pcDNA-N-G-eGFP-PM-L的組裝a.Recombinant plasmid pcDNA-L assembly; b.Recombinant plasmid pcDNA-N-G-EGFP-PM-L assembly

1.2.7 pcDNA-N-G-eGFP-PM-L重組質(zhì)粒的酶切鑒定 用BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒會產(chǎn)生187、930、1 844、2 361、2 869、9 409 bp大小的6個片段。酶切體系Fast Digest buffer(10×)、2 μL；重組質(zhì)粒、1 μg；BamHⅠ、1 μL；補(bǔ)水至15 μL。37℃水浴2 h，8 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測。XhoⅠ酶切會產(chǎn)生3 842、5 705、7 408 bp 3個片段酶切體系與BamHⅠ酶切體系相同。取經(jīng)過菌體PCR檢測為陽性，酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒50 μL，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

2 結(jié)果

2.1 狂犬病病毒SRV9株各蛋白基因和eGFP基因的PCR擴(kuò)增

以各蛋白基因重組質(zhì)粒為模板，用設(shè)計(jì)的Gibson連接引物擴(kuò)增各基因片段，用于Gibson連接的引物含有重疊片段，所以引物比較長。PCR擴(kuò)增得到N基因1 589 bp、G基因1 473 bp、PM基因1 849 bp、eGFP基因763 bp、L1基因2 116 bp、L2基因2 272 bp、L3基因2 194 bp。結(jié)果顯示每個基因片段擴(kuò)增正確(圖2)，5′端的修飾基本不影響擴(kuò)增效果，經(jīng)膠回收純化后可直接用于Gibson連接。

M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000; 1.N; 3.G; 5.PM; 7.L1; 9.L2; 11.L3; 13.eGFP; 2、4、6、8、10、12.陰性對照; M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL15 000

M1.DNA Maker DL 2 000; 1.N; 3.G; 5.PM; 7.L1; 9.L2; 11.L3; 13.eGFP; 2,4,6,8,10,12.Negative control; M2.DNA Maker DL15 000

圖2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

Fig.2 The result of PCR amplification

2.2 全長重組質(zhì)粒的菌體PCR檢測

分別用設(shè)計(jì)的檢測引物JCNGF/JCNGR擴(kuò)增序列跨N基因和G基因，按設(shè)計(jì)順序連接理論片段大小為889 bp(圖3a)；JCLF/JCLR菌體PCR檢測理論片段大小為719 bp(圖3b)。菌體PCR初步可以判斷是按照設(shè)計(jì)順序連接成功。

a 1～10.引物 JCLF/JCLR 菌體PCR結(jié)果; M.DNA Marker DL 2 000;b 1～10.引物JCNGF/JCNGR菌體PCR 結(jié)果; M.DNA Marker DL 2 000

a 1-10.Primer JCLF/JCLR bacteria PCR results; M.DNA Marker DL 2 000; b 1-10.Primer JCNGF/JCNGR bacteria PCR results; M.DNA Marker DL 2 000

圖3菌體PCR電泳檢測

Fig.3 The result of bacteria PCR detection

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

選擇合適的限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒，如果電泳呈現(xiàn)的DNA片段大小與預(yù)期的片段大小一致，說明重組質(zhì)粒是按照設(shè)計(jì)的順序連接。pcDNA-L用BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期產(chǎn)生187、2 361、2 869、6 666 bp大小的4個片段，XhoⅠ酶切產(chǎn)生3 842 bp、8 241 bp兩個片段(圖4a)。pcDNA-N-G-eGFP-PM-L全長重組質(zhì)粒用BamHⅠ酶切重組質(zhì)粒，預(yù)期產(chǎn)生187、930、1 844 、2 361、2 869、9 409 bp大小的6個片段。XhoⅠ酶切產(chǎn)生3 842、5 705、7 408 bp 3個片段(圖4b)。電泳結(jié)果顯示全長重組質(zhì)粒pcDNA3.1-N-G-eGFP-PM-L酶切片段大小與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 全長質(zhì)粒的測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示，G基因由原來的第四位M基因后移至第2位N基因后，敲除了G基因的跨膜區(qū)(CD區(qū))，并在其終止密碼子前插入了eGFP增強(qiáng)型熒光蛋白標(biāo)記基因。完全按照預(yù)期試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行組裝，連接部位完全正確。全長測序結(jié)果與NCBI公布結(jié)果進(jìn)行比對，L基因由三處堿基突變?？赡茉?yàn)镻CR擴(kuò)增過程中的錯配(圖5)。

(a) M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL15 000; 1.plasmid pcDNA-L；2.XhoⅠ； 3.BamHⅠ；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000;(b) M1.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL15 000; 1.plasmid pcDNA-N-G-eGFP-PM-L；2.XhoⅠ；3.BamHⅠ；M2.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

(a) M1.DNA Maker DL15 000; 1.plasmid pcDNA-L；2.XhoⅠ； 3.BamHⅠ；M2.DNA Maker DL 2 000;(b) M1.DNA Maker DL15 000; 1.plasmid pcDNA-NGEPML；2.XhoⅠ； 3.BamHⅠ；M2.DNA Maker DL 2 000

圖4重組質(zhì)粒酶切pcDNA-L(a)和pcDNA-N-G-eGFP-PM-L(b)

Fig.4 Restriction enzyme digestion of recombinant plasmid PCDNA-L(a)and PCDNA-N-G-EGFP-PM-L(b)

圖5 重組質(zhì)粒pcDNA-N-G-eGFP-PM-L測序結(jié)果

3 討論

目前RABV感染性cDNA克隆的構(gòu)建多采用傳統(tǒng)的酶切連接的方法，此方法需要選擇合適的酶切位點(diǎn)，將多個片段逐個連接[5,10-11]。利用此方法進(jìn)行基因插入時(shí)，會在連接片段之間殘存限制性內(nèi)切酶的結(jié)合位點(diǎn)，無法實(shí)現(xiàn)基因的精確編輯。對于基因的定點(diǎn)突變、敲除就更加困難。Gibson Assembly連接法構(gòu)建RABV感染性cDNA克隆時(shí)，利用片段之間的重疊序列，不額外的添加任何堿基，并且一次可連接多個片段，大大提高了連接效率。

ⅡS型限制性內(nèi)切酶(ⅡS restriction enzymes)的發(fā)現(xiàn)讓多片段快速無縫連接成為可能。ⅡS型限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)在切割位點(diǎn)之外，通過與傳統(tǒng)的連接酶結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)了PCR產(chǎn)物的環(huán)化和基因片段的無縫連接[13-14]。Engler C等[15]利用ⅡS型限制性內(nèi)切酶，成功實(shí)現(xiàn)了多個片段的無縫快速組裝。采用“Goden gate”克隆法一步連接3個片段，成功構(gòu)建了同源重組靶向載體[16]。利用此方法進(jìn)行多個大片段連接時(shí)，受到 IIS 型限制性內(nèi)切酶的識別位點(diǎn)限制，可能無法找到合適的IIS型限制性內(nèi)切酶。因此，無法用于RABV感染性cDNA的構(gòu)建。

Gibson D G等[3]發(fā)明的Gibson Assembly連接法，利用DNA片段之間的重疊序列，實(shí)現(xiàn)了一步將多個DNA片段按特定順序“無縫”連接。此方法利用T5 核酸外切酶(T5 exonuclease)、Phusion DNA polymerase、TaqDNA Ligase 3個酶在50℃時(shí)都有活性，利用基因片段之間的一小段重疊序列將多個片段連接起來。利用此方法，設(shè)計(jì)60 bp的重疊序列，成功構(gòu)建了16.3 kb的小鼠線粒體基因組[17]。這一技術(shù)還被用來構(gòu)建了第一個人造細(xì)胞的基因組[2]。戢志呈等[4]利用Gibson Assembly連接法設(shè)計(jì)20 bp～25 bp互補(bǔ)重疊序列成功快速的構(gòu)建了多個植物表達(dá)載體。Gibson Assembly連接法連接片段的長度可以是幾百個堿基，最長可以達(dá)到上百kb[3]。目前Gibson Assembly連接法已經(jīng)被用于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建，病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建等[6-7,18]。因此該方法適用于各種載體的構(gòu)建，可實(shí)現(xiàn)DNA片段的“無縫”連接、基因敲除、插入。

在構(gòu)建狂犬病病毒感染性cDNA克隆時(shí)，為了產(chǎn)生精確末端，多會在全長基因組的兩端引入錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶序列，研究者們多將核酶序列利用基因合成技術(shù)合成后，利用酶切連接成功實(shí)現(xiàn)了核酶序列的插入[9-10]。本試驗(yàn)直接將核酶序列合成到PCR擴(kuò)增的引物中，實(shí)現(xiàn)了核酶序列的插入。雖然引物序列較長，試驗(yàn)結(jié)果表明，基本不影響基因片段的擴(kuò)增。

利用Gibson Assembly連接法進(jìn)行狂犬病病毒感染性cDNA克隆的構(gòu)建有如下優(yōu)點(diǎn)：①可以一步實(shí)現(xiàn)多個不同大小片段按照設(shè)計(jì)順序組裝，方便快捷。②可以實(shí)現(xiàn)基因的精確插入，本研究將eGFP基因插入G基因終止密碼子前，實(shí)現(xiàn)了基因片段的定點(diǎn)插入。③可以實(shí)現(xiàn)基因敲除，本研究成功敲除了G基因CD區(qū)的132個堿基，編碼43個氨基酸。④實(shí)現(xiàn)了基因片段的“無縫”連接，在連接片段之間不額外的添加堿基，有利于RABV基因功能的研究。

本研究采用Gibson Assembly連接法將G基因由原來的第4位移至第2位，說明此方法可以將RABV的5個結(jié)構(gòu)蛋白基因按照設(shè)計(jì)的順序進(jìn)行組裝。eGFP標(biāo)記基因的插入，說明利用Gibson連接法可以精確的插入外源基因。對Ψ區(qū)和CD區(qū)的敲除說明Gibson Assembly連接法可以實(shí)現(xiàn)任何位置的基因敲除。利用Gibson Assembly連接法可以快速構(gòu)建各種表達(dá)載體。

[1] Schnell M J,Mebatsion T,Conzelmann K.Infectious rabies viruses from cloned cDNA.[J].EMBO J,1994,13(18):4195.

[2] Gibson D G,Glass J I,Lartigue C,et al.Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome[J].Science,2010,329(5987):52-56.

[3] Gibson D G,Young L,Chuang R,et al.Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases[J].Nat Meth,2009,6(5):343-345.

[4] 戢志呈,江雁翔,劉耀光,等.應(yīng)用Gibson Assembly方法構(gòu)建植物表達(dá)載體[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014(5):112-116.

[5] Tang H,Lu Z,Wei X,et al.A recombinant rabies virus expressing a phosphoprotein-eGFP fusion is rescued and applied to the rapid virus neutralization antibody assay[J].J Virol Meth,2015,219:75-83.

[6] Blawid R,Nagata T.Construction of an infectious clone of a plant RNA virus in a binary vector using one-step Gibson Assembly[J].J Virol Meth,2015,222:11-15.

[7] Wang J,Wang A,Li K,et al.CRISPR/Cas9 nuclease cleavage combined with Gibson assembly for seamless cloning[J].Biotechniques,2015,58:161-170.

[8] Inoue K,Shoji Y,Kurane I,et al.An improved method for recovering rabies virus from cloned cDNA[J].J Virol Meth,2003,107(2):229-236.

[9] 解庭波,明平剛,唐 芳,等.狂犬病病毒CTN株反向遺傳系統(tǒng)的改造及拯救[J].中國生物制品學(xué)雜志,2015,28(11):1121-1126.

[10] 薛向紅,鄭學(xué)星,蓋微微,等.狂犬病病毒CVS-11株全序列測定及其感染性克隆的構(gòu)建[J].微生物學(xué)報(bào),2013,53(4):409-415.

[11] Wickersham I R,Finke S,Conzelmann K,et al.Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus[J].Nat Meth,2007,4(1):47-49.

[12] Takayama-Ito M,Inoue K I,Shoji Y,et al.A highly attenuated rabies virus HEP-Flury strain reverts to virulent by single amino acid substitution to arginine at position 333 in glycoprotein[J].Virus Res,2006,119(2):208-215.

[13] Kotera I,Nagai T.A high-throughput and single-tube recombination of crude PCR products using a DNA polymerase inhibitor and type IIS restriction enzyme[J].J Biotechnol,2008,137(1-4):1-7.

[14] Engler C,Kandzia R,Marillonnet S.A one pot,one step,precision cloning method with high throughput capability[J].PLoS One,2008,3(11):e3647.

[15] Engler C,Gruetzner R,Kandzia R,et al.Golden gate shuffling:a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes[J].PLoS One,2009,4(5):e5553.

[16] 梁 龍,楊 華,楊永林,等.“Golden Gate”克隆法構(gòu)建靶向載體[J].中國生物工程雜志,2013(3):111-116.

[17] Gibson D G,Smith H O,Hutchison III C A,et al.Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome[J].Nat Meth,2010,7(11):901-903.

[18] Bordat A,Houvenaghel M,German-Retana S.Gibson assembly:an easy way to clone potyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg[J].Virol J,2015,12(1):1.

ConstructionofRecombinantInfectiouscDNACloneofSRV9RabiesVirusbyGibsonAssembly

WANG Wei1,WEI Yu-yuan1,ZHAI Shao-hua1,MAO Li-ping1,PI Wen-hui2,JIAN Zi-jian1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi,Xinjiang,830052,China; 2.StateKeyLaboratoryforSheepGeneticImprovementandHealthyProduction,XinjiangAcademyofAgriculturalandReclamationSciences,Shihezi,Xinjiang,832000,China)

The recombinant full-length infectious cDNA clone of SRV9 rabies virus was constructed by Gibson Assembly,which provided a new method for the construction of rabies virus infectious cDNA clone.A few fragments and the enzyme linearized carriers were connected by Assembly Gibson connection method in the same reaction system according to the design of connection order for the realization of one step assembly of a number of fragments.PCR primers were designed with 20-30bp overlap sequence,and five structural protein genes and fluorescent protein gene with overlapping sequences were amplified.The amplified fragments and linearized vectors after purification by gel extraction were mixed and connected to the Gibson liquid,reacting at 50℃ for 60 min,the products were transformed into Stbl3 competent cells.The recombinant plasmid was identified by PCR,enzyme digestion and sequencing.After the deletion of the glycoprotein gene transmembrane region and virus pseudo gene ψ region inserting enhanced green fluorescent protein gene into ahead the glycoprotein gene stop codon,the 17 600 bp recombinant plasmid and the recombinant infectious full length cDNA clone were constructed successfully and quickly.

Rabies virus; Gibson Assembly;construction;infectious cDNA clone

2017-03-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31360623);新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2016AG008)

王 偉(1990-)，男，新疆鞏留人，碩士研究生，主要從事動物分子與免疫病理學(xué)研究。*

S852.659.1

A

1007-5038(2017)11-0011-07