劉曼莉，方六榮，肖少波，陳煥春，譚 臣，石麗橋，王開梅，楊自文

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

豬鏈球菌2型感染的A549細胞表達譜研究

劉曼莉1*，方六榮2，肖少波2，陳煥春2，譚 臣2，石麗橋1，王開梅1，楊自文1

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070)

采用人全基因組芯片的方法研究豬鏈球菌2型感染的A549細胞中各基因的表達變化。結(jié)果表明，有130個基因的表達具有顯著性差異，其中61個基因表達為上調(diào)，69個基因表達下調(diào)。通過分析，其中77個差異表達基因可分為32個生物學(xué)功能類別，包括了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、Toll樣受體信號通路、細胞分化等生物學(xué)過程。

豬鏈球菌2型；A549細胞；基因芯片；基因表達

豬鏈球菌(Streptococcussuis)是一種重要的細菌性傳染病病原，33個血清型中豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)具有流行廣、致病力強的特點，是一種重要的人獸共患傳染病病原，能引起包括人和豬在內(nèi)的多種動物的多種疾病，造成感染甚至死亡，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展和人類健康[1]。感染豬鏈球菌2型菌能引起豬的敗血癥、腦膜炎、肺炎等病變，并造成突然死亡。人通過接觸病死豬及其副產(chǎn)品經(jīng)傷口、消化道感染豬鏈球菌2型，可引起人鏈球菌中毒休克綜合征(STSS)和鏈球菌腦膜炎綜合征(SMS)，導(dǎo)致腦膜炎、敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎、永久性耳聾及突發(fā)性死亡等，病死率高[2]。1998年夏季，在我國江蘇省部分地區(qū)暴發(fā)了人感染豬2型鏈球菌病，造成14人死亡；2005年夏季，豬2型鏈球菌病在四川省的暴發(fā)，造成204人發(fā)病，38人死亡[2]。

SS2感染豬和人之后主要導(dǎo)致腦膜炎、肺炎以及敗血癥等癥狀和病理變化。目前的研究大多集中在腦膜炎和敗血癥的形成，為了深入了解鏈球菌造成的肺炎的致病機制，本試驗采用基因芯片的方法研究SS2感染人肺癌上皮細胞A549后，細胞基因表達譜的變化，為進一步研究感染機制和致病機理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 豬鏈球菌2型(Streptococcussuistype 2，S.suis2，SS2)SC19菌株由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物國家重點實驗室分離與保存。取凍干保存的豬鏈球菌2型菌種，劃線接種于含100 mL/L血清的TSA培養(yǎng)平皿中，37℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落于含100 mL/L血清的TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。12 000 r/min離心沉淀細菌，加入PBS洗2次，12 000 r/min離心后去上清，加入一定量的PBS懸浮細菌，并稀釋至約為1×107CFU/mL。

1.1.2 細胞 人肺癌細胞A549(CCL-185)，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)。取長滿單層的A549細胞，棄去培養(yǎng)液，加入3 mL胰酶-EDTA消化液洗細胞1次，加入2 mL消化液，于37℃培養(yǎng)箱中消化3 min～5 min，棄去消化液加入5 mL含100 mL/L胎牛血清的DMEM生長液輕輕吹打使之完全消化成單個細胞，按1∶3的比例傳至3個T75細胞瓶中，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.1.3 基因芯片 Affymetrix GeneChip?系列人類基因組表達譜芯片Human Genome U133 Plus 2.0 array，購自于上海晶泰生物技術(shù)有限公司，細胞樣品總RNA的提取、與芯片的雜交均由該公司完成。

1.2 方法

1.2.1 豬鏈球菌2型感染A549細胞 在試驗組A549細胞中加入一定量的SS2菌體至細菌和細胞的比例約為1∶1，同時，對照組細胞中加入相同體積的PBS做對照，每組做4個重復(fù)。感染3 h后(前期試驗結(jié)果表明SS2作用細胞3 h，細胞狀態(tài)正常，但隨時間增加細胞存活率急劇下降，結(jié)果在此不做贅述)分別收集試驗組和對照組的A549細胞，加入一定量的Trizol溶液，用無RNAase的吸管反復(fù)吹打以充分裂解細胞，混勻后分裝于無RNAase的離心管中于-80℃保存。

1.2.2 實時熒光定量PCR對基因芯片結(jié)果進行驗證 將與芯片相同的細胞樣品提取RNA進行實時熒光定量PCR驗證。RNA的提取按Trizol(Invitrogen公司)試劑說明書進行。選取基因表達譜芯片中的3個基因，同時，選取GAPDH為內(nèi)參(引物序列見表1)。

表1 實時熒光定量PCR所用引物序列

使用熒光定量SYBR Green Ⅰ試劑盒(TOYOBO QPK-201)進行實時熒光定量PCR反應(yīng)，每個樣品做3個重復(fù)。反應(yīng)程序為：95℃ 60 s；接著40個循環(huán)：95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 45 s；在72℃延伸的時候收集熒光信號，整個反應(yīng)過程包括熒光信號的收集及分析均在ABI Prism 7500實時熒光定量PCR儀中進行。

分析采用ΔΔCt方法：a.計算試驗組和對照組中每個基因的ΔCt值。ΔCt(對照組基因)=Ct試驗組基因-Ct試驗組GAPDH；ΔCt(試驗組基因)=Ct對照組基因-Ct對照組GAPDH；b.計算兩組中每個基因的ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt(試驗組基因)-ΔCt(對照組基因)，計算2-ΔΔCt值，得到試驗組與對照組所對應(yīng)基因的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達基因

將感染了SS2的試驗組A549細胞與表達譜芯片雜交后的信號值，與對照組A549細胞雜交的表達譜芯片的信號值相比較，計算組間的P值，當(dāng)P≤0.05，且組間的信號值比值Fold Change (FC)≥2的轉(zhuǎn)錄本為上調(diào)(up-regulated)，F(xiàn)C≤0.5的為下調(diào)(down-regulated)，F(xiàn)C在0.5到2之間為無顯著變化。試驗結(jié)果中，共檢測到130個有顯著性差異表達變化的基因，其中61個基因的表達上調(diào)、69個基因的表達下調(diào)。

2.2 實時熒光定量PCR驗證

通過實時熒光定量PCR的方法對3個目的基因(FOS、JAK2、TRAF4)進行擴增，獲得試驗組與對照組基因表達量的比值，結(jié)果與基因芯片的結(jié)果相比較，3個基因的差異表達變化是一致的(表2)，雖然在數(shù)值上并不是完全相同，但這可能是因為兩種方法的不相同所導(dǎo)致的，試驗結(jié)果進一步證明了基因芯片的結(jié)果是可信的。

表2 實時熒光定量PCR方法驗證芯片的結(jié)果

2.3 差異表達基因的功能分析

將芯片中找到的差異表達基因，通過DAVID的Gene Ontology分析，發(fā)現(xiàn)A549細胞感染SS2后，130個差異表達基因中，89個基因的功能較清晰，其中77個差異表達基因在所屬的GO BP分類中涉及32個主要的生物學(xué)過程，包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞凋亡、Toll樣受體信號通路、細胞分化等生物學(xué)過程。將這89個基因的信息輸入STRING進行蛋白分析，找到具有密切聯(lián)系的23個基因(圖1)。

2.4 差異表達基因的KEGG PATHWAY和BIOCARTA代謝通路分析

差異表達基因通過DAVID的分析，獲得14個基因涉及BIOCARTA代謝通路，其中較為明確的通路為Regulation of MAP Kinase Pathways Through Dual Specificity Phosphatases，涉及的基因為DUSP1和DUSP6。35個基因涉及KEGG PATHWAY(部分基因見表3)，涉及的通路包括有MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路、NOD樣受體信號通路、AMPK信號通路、鈣信號通路、細胞黏附因子等。

3 討論

豬鏈球菌病在全球已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重要細菌性傳染病，也是一種重要的人獸共患傳染病。研究發(fā)現(xiàn)SS2能黏附多種上皮細胞和單核細胞[3]，這可能是SS2在上呼吸道定植的原因。溶血素是SS2的一種重要的毒力因子[3-4]，對細胞具有一定的毒性作用，是SS2進入血液的過程中重要的因素[5-7]。SS2可被巨噬細胞吞噬，或以細胞外的形式進入血液然后隨血液進入其他部位[8-10]。進入血液的SS2造成敗血癥，而且SS2侵入血腦屏障(BBB)也能造成腦膜炎[2,11]。SS2的毒力因子(如SLY)可以誘導(dǎo)豬、人或鼠的細胞釋放大量的促炎細胞因子[12-15]。

圖1 23個差異表達基因的關(guān)系圖

現(xiàn)有的研究大多集中在腦膜炎和敗血癥的致病機制，對肺炎的研究較少。本試驗通過基因芯片技術(shù)研究人肺癌細胞A549感染豬鏈球菌2型后，篩選出130個基因的表達量有顯著的變化，通過分析，其中的77個基因分別在98個生物學(xué)過程中發(fā)揮不同的作用。其中涉及基因數(shù)量最多的為regulation of molecular function、response to organic substance和regulation of signaling，都包含了21個基因?；騄AK2、NFKBIB、C3、CTGF、DUSP1、DUSP6、GREM2、NR4A2在這3個類別中均有涉及，主要參與了MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、趨化因子信號通路等。

DUSP1也可以稱MKP1，是MKP家族中的一員。定位于細胞核的DUSP1在細胞內(nèi)主要催化已活化的MAPK家族成員,特別是p38 MAPK激酶與JNK激酶中酪氨酸和蘇氨酸磷酸基團的水解失活,從而抑制其活性。而DUSP6(MKP-3)定位于細胞質(zhì)中，負調(diào)控ERK2的磷酸化水平，在RAS-MAPK信號通路中發(fā)揮重要的生理調(diào)節(jié)功能[16]，可作為一個免疫標(biāo)記物在肝癌、胰腺癌、乳腺癌、食管鱗癌等疾病中有著重要的診斷價值[17-18]。SS2感染與DUSP1、DUSP6的關(guān)系并不明確，而肺炎鏈球菌的溶血素試驗證明可經(jīng)MAPK途徑誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞凋亡[19]。同時，有研究表示肺炎鏈球菌導(dǎo)致中耳炎，主要由于黏蛋白分泌表達過剩造成的，而黏蛋白也能激活MKP-1，負調(diào)控ERK相關(guān)的炎癥反應(yīng)[20-21]。因此，研究豬鏈球菌感染時DUSP1和DUSP6的作用及相關(guān)的MAPK通路，有助于研制新的抗感染藥物。

表3 差異表達基因涉及的KEGG PATHWAY

FOS是細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在cAMP信號通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路等發(fā)揮作用。當(dāng)ERKs接受上游的級聯(lián)反應(yīng)信號，轉(zhuǎn)位進入細胞核，磷酸化核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子FOS、c-JUN等。通常，F(xiàn)OS在機體細胞中的表達量極低，但當(dāng)機體缺血、外傷、癲癇和外周神經(jīng)刺激時，F(xiàn)OS的表達迅速增加，參與細胞凋亡和神經(jīng)元修復(fù)等作用[22]。豬鏈球菌感染后FOS的表達上調(diào)，也許可以作為標(biāo)記物在豬鏈球菌感染的診斷中得到應(yīng)用。

NFKBIB又稱TRIP-9、IKB-β，是NF-κB抑制劑家族中的一個轉(zhuǎn)錄因子，通常在細胞質(zhì)中，阻止NF-κB的轉(zhuǎn)錄。NFKBIB的功能不是很明確，通常認為當(dāng)細胞受到外界因素，如細菌或病毒感染、紫外線照射、電離輻射等刺激后，IKB發(fā)生磷酸化并迅速降解，NF-κB被釋放、激活并進入細胞核，與特異性DNA位點結(jié)合，從而啟動一系列基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其重要的生物學(xué)作用，包括調(diào)控機體的免疫狀態(tài)、細胞凋亡等[23-24]。

JAK2在本試驗結(jié)果中是顯著的下調(diào)的。JAK2是一種非受體酪氨酸激酶，是JAK家族的一員，是通過誘導(dǎo)胞質(zhì)信號級聯(lián)來調(diào)控各種不同細胞過程。JAK2主要參與IL-3、GM-CSF、IL-5、血小板生成因子Tpo和IFN-γ的信號通路。缺失JAK2的小鼠由于不能生成紅細胞而導(dǎo)致胚胎死亡[25]。JAK2在肺炎球菌EstA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起著重要作用[26]。JAK2能激活NF-κB應(yīng)對細菌內(nèi)毒素的反應(yīng)，而且，由于抑制JAK2的表達能調(diào)節(jié)巨噬細胞的活化和抑制炎癥細胞因子的產(chǎn)生，在敗血癥的治療中引起關(guān)注[27]。

TRAF4是TNF受體相關(guān)因子，TRAFs家族是一類胞內(nèi)接頭蛋白，能直接或間接與多種TNF和IL-1/Toll樣受體家族成員結(jié)合，介導(dǎo)下游信號通路的信號傳導(dǎo)，如NF-κB信號通路、JNK信號通路相關(guān)，參與細胞存活、分化、凋亡等[28]。

豬鏈球菌溶血素(suilysin，SLY)是已知的豬鏈球菌2型的主要毒力因子之一，SLY能裂解宿主細胞，幫助細菌逃避宿主的免疫系統(tǒng)攻擊[29]。研究表明SLY可以激活多種免疫細胞產(chǎn)生前炎癥因子TNF-α，并且能通過TLR4介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進入細胞核完成TNF-α的轉(zhuǎn)錄[20]。SLY 與豬鏈球菌性腦膜炎致病過程中豬鏈球菌的黏附、侵襲及相關(guān)炎性因子的釋放均有密切的關(guān)系。纖維蛋白原(fibrinogen)通過與細胞上的CD11b/CD18結(jié)合激活NF-κB、MAPK/PI3K參與細胞黏附、遷移、趨化性和吞噬作用等，幫助豬鏈球菌突破血腦屏障(BBB)[21]?？莶輻U菌素樣絲氨酸蛋白酶(SspA)能誘導(dǎo)巨噬細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、CXCL8和CCL5的表達[30]。

通過本試驗檢測到多個與MAPK信號通路、NF-κB信號通路、Toll樣受體信號通路等密切相關(guān)的基因是之前的報道中沒有提及的，它們參與了細胞分化、增殖、凋亡等生物過程，發(fā)揮著不同的生物學(xué)功能。這些基因及相關(guān)通路將為深入研究SS2致病機制以及抗菌藥物的研發(fā)提供依據(jù)。

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StudyonMicroarrayGeneExpressionProfileofA549CellsInfectedwithStreptococcussuisType2

LIU Man-li1,FANG Liu-rong2,XIAO Shao-bo2,CHEN Huan-chun2,TAN Chen2,SHI Li-qiao1,WANG Kai-mei1,YANG Zi-wen1

(1.HubeiBiopesticideEngineeringResearchCentre,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,Wuhan,Hubei,430064，China;2.HuangZhongAgriculturalUniversity,Wuhan,Hubei,430070,China)

The microarray was used to study the different expressions of genes in A549 cells after theStreptococcussuistype 2 infection.In the results,130 genes were expressed differentially,including 61 up-regulated genes and 69 down-regulated genes.By Biological process classification,77 major DE genes involved in 32 biological function types,including signal transduction,apoptosis,Toll-like receptor signaling pathway and differentiation.

Streptococcussuistype 2; A549; microarray; gene expression

2017-04-06

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YPD0500202)；湖北省農(nóng)科院青年基金項目(2015NKYJJ18)；湖北省農(nóng)科院創(chuàng)新崗位項目(2016-620-000-001-039)

劉曼莉(1982-)，女，廣東惠州人，助理研究員，博士，主要從事抗菌藥物的研究。*

S852.611

A

1007-5038(2017)11-0006-05