田純見，楊舒展，段喻燕，劉志玲，林志雄，羅 瓊，陳 茹

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623)

研究論文

非洲豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)基因?qū)崟r(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法的建立

田純見*，楊舒展，段喻燕，劉志玲，林志雄，羅 瓊，陳 茹

(廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東廣州 510623)

為建立非洲豬瘟病毒(ASFV)通用型高通量檢測(cè)技術(shù)，利用高度保守的非結(jié)構(gòu)DNA聚合酶G1211R基因，制備質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立實(shí)時(shí)熒光LAMP方法，出現(xiàn)典型的S形核酸擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增產(chǎn)物具有特異的熔解曲線。G1211R基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在1.81×105拷貝數(shù)/μL～1.81×109拷貝數(shù)/μL對(duì)數(shù)值與Ct值之間的線性關(guān)系良好。以ASFV E70株病毒核酸為模板，LAMP檢測(cè)靈敏度達(dá)到21 pg，優(yōu)于熒光定量PCR方法。重復(fù)性試驗(yàn)LAMP檢測(cè)批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于5%。LAMP方法檢測(cè)ASFV特異性良好，與豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒及昆蟲核酸無(wú)交叉反應(yīng)。以ASFV Arm 07株制備各種臨床模擬樣品，檢出陽(yáng)性率達(dá)到17.31%。檢測(cè)方法的建立，可為非洲豬瘟防控提供新的技術(shù)手段，有利于不同基因型毒株檢測(cè)和出入境快速篩查。

非洲豬瘟病毒；DNA聚合酶；環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增；標(biāo)準(zhǔn)曲線；模擬樣品

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的豬的烈性傳染病，對(duì)生豬及豬肉產(chǎn)品國(guó)際貿(mào)易產(chǎn)生重要影響。該病是我國(guó)一類動(dòng)物疫病，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)法定報(bào)告的動(dòng)物疫病之一。目前，ASF疫情在歐洲由西向東擴(kuò)散，波及俄羅斯、烏克蘭及多個(gè)歐盟成員國(guó)。在我國(guó)“一帶一路”建設(shè)中，中歐貿(mào)易日益頻繁，對(duì)我國(guó)ASF防控提出新的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

ASFV基因組為線狀雙股DNA，全長(zhǎng)170 kb～192 kb。在其結(jié)構(gòu)基因中，編碼主要衣殼蛋白p72的基因B646L及與編碼形態(tài)發(fā)生有關(guān)蛋白p54的基因E183L，目前常用于ASFV分子生物學(xué)診斷[1-6]。但是，病毒分子流行病學(xué)研究表明ASFV 結(jié)構(gòu)基因變異，存在22個(gè)不同的基因型，會(huì)影響分子生物學(xué)檢測(cè)效果。一般認(rèn)為，動(dòng)物病毒非結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定性更高，在口蹄疫、禽流感等動(dòng)物疫病診斷中發(fā)揮著重要作用。在ASFV非結(jié)構(gòu)基因中，DNA聚合酶編碼基因G1211R位于病毒基因組的中間保守區(qū)，是本研究ASFV檢測(cè)的靶基因。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplifycation，LAMP)技術(shù)具有快速、敏感和特異的特點(diǎn)[7-9]，在動(dòng)物疫病診斷中具有重要作用，值得深入研究和推廣應(yīng)用。本研究基于ASFV非結(jié)構(gòu)基因建立實(shí)時(shí)熒光LAMP檢測(cè)方法，并與熒光定量PCR進(jìn)行比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及昆蟲 ASFV E70毒株(基因Ⅰ型)核酸和Arm 07毒株(基因Ⅱ型)滅活材料，均由ASF參考實(shí)驗(yàn)室CISA-INIA(西班牙)提供；豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒及豬繁殖與呼吸綜合征病毒由廣東永順生物制藥股份有限公司惠贈(zèng)；蜱蟲由本實(shí)驗(yàn)室采集和保存。

1.1.2 主要試劑 Lyophilized general real-time LAMP Kit購(gòu)自華峰生物科技公司；ExTaqTMVersion 2.0 plus dye購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；MagNA Pure核酸提取試劑購(gòu)自羅氏公司；引物由寶生物(大連)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)及序列 利用在線軟件BLAST進(jìn)行ASFV基因序列比對(duì)，在線軟件primerexplorer設(shè)計(jì)LAMP引物(表1)。熒光PCR引物和探針按照文獻(xiàn)方法[1]，其序列為：(上游)5′-CTGCTCATGGTATCAATCTTATCGA-3′；(下游)5′-GATACCACAAGATCRGCCGT-3′；(探針)5′-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-3′。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 利用DNA Star軟件進(jìn)行ASFV E70株 G1211R基因克隆引物設(shè)計(jì)，序列為(上游)5′-CGGTGATTACCCAACGAG-3′；(下游)5′-AGAAAGAAGGGCGACAAA-3′。PCR反應(yīng)體系為：PremixTaq(ExTaqversion 2.0 plus dye)12.5 μL，ASFV E70株DNA模板2 μL，上游引物(20 μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L)1 μL，DEPC蒸餾水8.5 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃ 10 s，57℃30 s，72℃ 3 min，30個(gè)循環(huán)。取電泳條帶大小正確的PCR產(chǎn)物用于克隆測(cè)序，由寶生物工程(大連)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒命名為pMD-ASFV-G1211R(1.81×1011拷貝/μL)，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 ASFV熒光定量LAMP的引物

1.2.3 LAMP及熒光定量PCR反應(yīng) LAMP反應(yīng)液組成為：凍干反應(yīng)管(含Bst DNA polymerase、dNTP和熒光染料)1支，復(fù)溶液15 μL，待檢模板2 μL，F(xiàn)IP引物(40 μmol/L)1 μL，BIP引物(40 μmol/L)1 μL，F(xiàn)3引物(5 μmol/L)1 μL，B3引物(5 μmol/L)1 μL，DEPC蒸餾水4 μL。60℃～65℃不同溫度，每個(gè)溫度反應(yīng)10 s～30 s，65℃收集FAM熒光值，60個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR反應(yīng)參照文獻(xiàn)[1]的方法進(jìn)行。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線 將pMD-ASFV-G1211R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10×連續(xù)稀釋，應(yīng)用LAMP反應(yīng)體系按照上述條件進(jìn)行檢測(cè)，StepOne軟件(v2.1)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

對(duì)ASFV熒光定量LAMP產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，確定引物特異性。熔解曲線反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 15 s，60℃ 1 min，接著0.3℃/s升溫到95℃ 15 s，在升溫過(guò)程中收集SYBR熒光值，形成熒光值隨溫度變化的熔解曲線。

1.2.5 特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn) 提取豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和蜱蟲的核酸作為模板，與ASFV核酸一起應(yīng)用LAMP反應(yīng)體系分別進(jìn)行檢測(cè)，觀察檢測(cè)方法的特異性。

將ASFV E70毒株核酸進(jìn)行10×連續(xù)稀釋，應(yīng)用LAMP反應(yīng)體系按照上述條件進(jìn)行敏感性檢測(cè)，并與熒光PCR進(jìn)行比較。

應(yīng)用pMD-ASFV-G1211R質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)。以1.81×106、1.81×107、1.81×108拷貝/μL 3個(gè)滴度，均進(jìn)行4個(gè)重復(fù)，評(píng)價(jià)批內(nèi)變異情況。分別對(duì)每個(gè)稀釋度連續(xù)進(jìn)行4次試驗(yàn)，評(píng)價(jià)批間變異情況。獲得數(shù)據(jù)在Excel軟件計(jì)算平均Ct值、標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)。

1.2.6 模擬樣品檢測(cè)應(yīng)用 抽取實(shí)驗(yàn)室保存的進(jìn)出境豬血清樣品30份，豬鼻拭子樣品15份，豬尿液2份，豬場(chǎng)昆蟲3份，豬飼料2份，共計(jì)52份。應(yīng)用ASFV Arm 07株模擬強(qiáng)弱陽(yáng)性樣品提取核酸，應(yīng)用所建立的LAMP方法和熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩個(gè)方法的檢測(cè)實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化

在線設(shè)計(jì)8組G1211R基因LAMP引物，利用序列保守性、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和Ct值優(yōu)選一組引物見表1。按照凍干通用型恒溫實(shí)時(shí)熒光試劑建立反應(yīng)體系，結(jié)果反應(yīng)條件為60℃、61℃、62℃、63℃、64℃和65℃共6個(gè)溫度各反應(yīng)10 s，出現(xiàn)典型的S型核酸擴(kuò)增曲線。

2.2 敏感性試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)分析結(jié)果，直線方程為y=-3.232x+30.714，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999，擴(kuò)增效率為0.934。結(jié)果表明，所建立的熒光定量LAMP檢測(cè)方法的Ct值與質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)之間的線性關(guān)系良好，所制備的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品合格。

熒光定量LAMP檢測(cè)ASFV核酸(1 050 ng/μL)靈敏度達(dá)到10-5以上(圖2)，相當(dāng)于每個(gè)反應(yīng)體系可以檢出21 pg病毒DNA，優(yōu)于熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果(10-3)。

(A)1.81×109；(B)1.81×108；(C)1.81×107；(D)1.81×106；(E)1.81×105，27.482(1)；23.259(2)；19.176(3)；17.628(4)；14.555(5)

A.10-3；B.10-4；C.10-5；D.10-6

2.3 特異性性試驗(yàn)

在ASFV實(shí)時(shí)熒光定量LAMP熔解曲線中，82.02℃(Tm)處出現(xiàn)單一特異峰(圖3)，無(wú)引物二聚體和非特異性產(chǎn)物。

圖3 ASFV熒光定量LAMP熔解曲線

LAMP方法檢測(cè)ASFV出現(xiàn)特異的S型擴(kuò)增曲線，而豬圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和昆蟲核酸均未出現(xiàn)特異擴(kuò)增曲線(non-ASFV)(圖4)。

圖4 ASFV熒光定量LAMP特異性試驗(yàn)

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

3個(gè)滴度樣品進(jìn)行批內(nèi)試驗(yàn)和批間試驗(yàn)(表2)，結(jié)果變異系數(shù)均小于5%，具有良好的重復(fù)性。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

在進(jìn)出境豬血清、鼻拭子、尿液、飼料和有關(guān)昆蟲樣品中(表3)，LAMP 檢測(cè)陽(yáng)性率17.31%，比熒光定量PCR方法略高。

3 討論

據(jù)OIE通報(bào)，2017年第一季度俄羅斯、波蘭、立陶宛、烏克蘭和南非等國(guó)家存在家豬和野豬持續(xù)感染非洲豬瘟的情況，其中俄羅斯自2014年起在伏爾加格勒州等30個(gè)地區(qū)發(fā)生163起野豬和281起家豬非洲豬瘟疫情，871頭野豬和10 188頭家豬感染。目前，對(duì)ASF不能進(jìn)行預(yù)防接種和有效治療，防控工作必須采取撲殺凈化措施[10]，嚴(yán)重干擾正常生產(chǎn)和生活秩序，造成重大經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的巨大威脅，其研究結(jié)果具有重大政治經(jīng)濟(jì)意義。

表2 ASFV熒光定量LAMP重復(fù)性試驗(yàn)

表3 ASFV熒光定量LAMP對(duì)模擬樣品的檢測(cè)結(jié)果

ASF與我國(guó)廣泛流行的豬瘟、高致病性藍(lán)耳病等出血性豬傳染病具有相似的臨床癥狀和病理變化，其鑒別診斷必須開展實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[11]。ASFV特異性分子生物學(xué)方法是重要的鑒別診斷工具。與常規(guī)PCR方法比較，LAMP引物針對(duì)模板6～8個(gè)區(qū)段，其特異性更高；擴(kuò)增過(guò)程無(wú)需變性與退火，所需時(shí)間更短；實(shí)時(shí)檢測(cè)無(wú)需探針，成本更低。本研究建立的熒光定量LAMP方法與電泳、顯色法[8]比較，適宜于高通量大規(guī)模篩查，可減少人工操作，結(jié)果判定準(zhǔn)確可靠，其技術(shù)優(yōu)勢(shì)將在快速診斷和疫情防控工作中進(jìn)一步發(fā)揮作用。

對(duì)ASFV結(jié)構(gòu)蛋白p72基因的分子流行病學(xué)研究顯示，世界各國(guó)流行毒株基因型不同，如俄羅斯為基因Ⅱ型(2007-2011)、坦桑利亞為基因Ⅹ型(2013)、烏干達(dá)為基因Ⅸ型(2013)等。這種結(jié)構(gòu)基因分子結(jié)構(gòu)差異和不同基因型出現(xiàn)，會(huì)影響不同地區(qū)ASFV毒株的分子診斷準(zhǔn)確性，有必要在變異相對(duì)較少的非結(jié)構(gòu)基因穩(wěn)定區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，保證針對(duì)不同基因型病毒具有較高的檢出率。本研究為不同基因型非結(jié)構(gòu)基因通用型檢測(cè)方法打下基礎(chǔ)。

在引物設(shè)計(jì)過(guò)程中對(duì)3個(gè)ASFV分子檢測(cè)靶基因進(jìn)行BLAST分析，結(jié)果全部毒株完整基因序列一致(100%)的比例是DNA聚合酶基因G1211R(3 636 bp)26.09%、結(jié)構(gòu)蛋白p72基因B646L(1 940 bp)18.75%及E183L基因(5 526 bp)9.90%。說(shuō)明非結(jié)構(gòu)蛋白基因穩(wěn)定性較高，有利于通用型擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)。

在制備非結(jié)構(gòu)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基礎(chǔ)上，本研究初步建立了針對(duì)非結(jié)構(gòu)基因檢測(cè)的LAMP方法，可以檢測(cè)兩種不同基因型病毒，其敏感性優(yōu)于常規(guī)熒光定量PCR[12]，特異性和重復(fù)性效果良好，成功用于多種模擬樣品檢測(cè)。進(jìn)一步研究需要針對(duì)更多的不同基因型毒株進(jìn)行臨床驗(yàn)證[13]，在實(shí)際防控工作中加以完善和推廣應(yīng)用。

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EstablishmentofReal-timeFluorescenceLAMPAssayforDetectionofNon-structuralDNAPolymeraseGeneofAfricanSwineFeverVirus

TIAN Chun-jian,YANG Shu-zhan,DUAN Yu-yan,LIU Zhi-ling,LIN Zhi-xiong,LUO Qiong,CHEN Ru

(GuangdongInspectionandQuarantineTechnologyCenter,Guangzhou,Guangdong,510623,China)

A universal real-time fluorescence LAMP detection method was established by cloning the DNA polymerase gene G1211R of African swine fever virus strain E70.A specific amplification was obtained and verified by a melt curve analysis.There were good linear relationships between Ct values and logarithm of input copy numbers over a range from 1.81×105to 1.81×109copies/μL for G1211R gene.The sensitivity for detection of nucleic acid was greater than that of fluorescence PCR method.The coefficients of variation within a batch and between batches were both less than 5%.There was no cross-reactivity with a variety of clinical related viruses.The total positive rate of spiked samples with ASFV strain Arm 07 was up to 17.31%.This study can provide an important reference for the prevention and control of ASF,and needs for further verification and application with different genotypes.

African swine fever virus; DNA polymerase; loop-mediated isothermal amplification assay; standard curve; spiked sample

2017-05-10

出入境檢驗(yàn)檢疫科研項(xiàng)目(2016GDK02、2016IK046)

田純見(1965-)，男，湖北長(zhǎng)陽(yáng)人，博士，主要從事動(dòng)物疫病檢測(cè)技術(shù)研究。*

S852.659.3；S858.315.3

A

1007-5038(2017)11-0001-05