潘偉 沈飛霞 谷雪梅

高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗大鼠對不同脂肪組織水通道蛋白7的影響

潘偉 沈飛霞 谷雪梅

目的 研究胰島素抵抗大鼠不同脂肪組織水通道蛋白7（AQP7）的表達水平，探討AQP7與脂肪組織發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)系。方法 20只雄性SD大鼠隨機分為對照組（CG）和高脂喂養(yǎng)誘導(dǎo)胰島素抵抗模型組（IRG）。觀察兩組大鼠體重變化，檢測TG、TC、HDL-C、LDL-C、甘油、空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）及脂肪因子的水平，同時比較皮下脂肪和附睪脂肪組織AQP7 mRNA、蛋白以及不同脂肪組織蛋白激酶B（PKB）及磷酸化蛋白的表達水平。結(jié)果 至12周末，IRG組較CG組血清LDL、FBG、FINS、IL-6、TNF-α 及胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）明顯升高（P＜0.05或 0.01），而 HDL、脂聯(lián)素水平下降（P＜0.05）。對mRNA和蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，在IRG組中內(nèi)臟脂肪組織AQP7表達水平高于皮下脂肪組織，并且較CG組升高。在IRG組中內(nèi)臟脂肪組織PKB磷酸化蛋白表達水平較皮下脂肪表達下降，并且較CG組下降。結(jié)論 內(nèi)臟脂肪組織AQP7的異常表達，可能與胰島素抵抗的發(fā)生有關(guān)。

水通道蛋白7 脂肪組織 胰島素抵抗

隨著社會發(fā)展和人們生活方式的改變，肥胖癥在世界范圍內(nèi)已形成流行趨勢，可引起2型糖尿病、心血管疾病、腫瘤等一系列慢性非傳染性疾病，給人類社會造成了巨大的經(jīng)濟、心理負擔(dān)。隨著人們對脂肪組織認識的不斷加深，近年來關(guān)于肥胖的研究越來越集中于在體液代謝紊亂方面。肥胖，尤其是內(nèi)臟脂肪的堆積，與胰島素抵抗關(guān)系密切，最近研究發(fā)現(xiàn)，水通道蛋白7（AQP7）能夠促進脂肪細胞內(nèi)甘油向細胞外排泄，減少細胞內(nèi)TG的合成，從而抑制脂肪細胞的肥大，而且不同脂肪組織AQP7表達不同[1]。因此，了解AQP7在脂肪組織的分布差異，以及與胰島素抵抗的關(guān)系，可為肥胖癥的防治提供了新的研究方向。筆者通過檢測胰島素抵抗大鼠不同脂肪組織AQP7的表達水平，探討AQP7與脂肪組織發(fā)生胰島素抵抗的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料

選擇健康SD雄性大鼠20只，鼠齡4周，體重100~120g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，自由攝食、飲水，室溫（22±1）℃，濕度（50±5）%，12h晝夜交替，每日更換干凈墊料。主要儀器和試劑：Western blot裝置（美國Bio-Rad公司），StepOne PlusTMReal-time quantitative PCR儀（美國ABI公司），酶標(biāo)儀（美國Thermo scientific公司），AQP7兔多克隆抗體（#32826，1∶500，美國Abcam公司），蛋白激酶B（PKB）兔多克隆抗體（#9272，1∶1 000，美國CST公司），磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）（Ser473）小鼠多克隆抗體（#4051，1∶1 000，美國CST公司），蛋白定量試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)有效公司），甘油檢測試劑盒（美國BioVision公司），ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所），PCR試劑（大連寶生物公司）；引物由上海博蘊生物科技有效公司合成。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型建立 20只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗組（IRG）和對照組（CG），每組10只。CG組喂養(yǎng)普通飼料，IRG組喂養(yǎng)高脂飼料（基礎(chǔ)飼料80%，豬油18%，膽固醇2%），喂養(yǎng)12周后兩組大鼠體重差異顯著，檢測胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）評估胰島素抵抗。HOMA-IR=空腹胰島素（FINS，mmol/L）×空腹血糖（FBG，mIU/L）/22.5。

1.2.2 標(biāo)本采集 分別于實驗第0、2、4、6、8、12周給每組大鼠稱重，至12周后禁食12h，次日采用2%戊巴比妥鈉（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉，打開大鼠腹腔，腹腔靜脈采血8～10ml離心取血清，采用全自動生化分析儀檢測 FBG、TG、TC、HDL-C、LDL-C 等指標(biāo)；采用甘油檢測試劑檢測血清甘油水平；采用ELISA法檢測血清瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α、IL-6；采用放射免疫法檢測血清胰島素水平；同時分離皮下及附睪脂肪組織（代表內(nèi)臟脂肪組織），部分取新鮮組織檢測，部分立即液氮凍存后備檢，所有操作在冰浴上進行。

1.2.3 real-time PCR檢測脂肪組織AQP7 mRNA的表達 將超低溫凍結(jié)的大鼠脂肪組織稱量后用液氮預(yù)冷的研缽研磨，用Trizol法抽提脂肪組織總RNA，經(jīng)ND2000測定濃度后逆轉(zhuǎn)錄cDNA。Primer-Express 3.0軟件設(shè)計引物。AQP7的上下游引物分別為：5′-TCGGTGTCAACTTGGGTTTTG-3′，5′-GAGATGCCGCCTGCTACAT-3′（64bp）；β-actin 的上下游引物分別為：5′-CTTCTTTGCAGCTCCTTCG-3′，5′-TTCTGACCCATTCCCACC-3′（198bp）。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 30s，95℃變性 5s，60℃退火 30s，共進行 40 個循環(huán)。以 2-△△CT表示處理組相對于正常對照組的變化倍數(shù)，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 蛋白免疫印跡法檢測脂肪組織AQP7、PKB、p-PKB的表達 分離脂肪組織，在蛋白裂解液中制成勻漿，離心后取上清液，BCA法測定蛋白濃度。行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后加一抗（AQP7兔多克隆抗體、PKB兔多克隆抗體、p-PKB小鼠多克隆抗體），4℃ 孵育過夜。TBST漂洗濾膜3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG）振蕩孵育1h。TBST洗膜，顯色后曝光。采用Image J軟件進行吸光度度分析，以 β-actin為內(nèi)參，結(jié)果用目的蛋白與β-actin吸光度的比值表示其相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠體重變化的比較

分組前兩組大鼠的體重相近，在高脂飲食喂養(yǎng)過程中，IRG組大鼠的體重逐漸高于CG組，在第6~12周時差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或 0.01），詳見表 1。

表1 兩組大鼠體重變化的比較（g）

2.2 兩組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的比較

第12周時，IRG組大鼠FBG、FINS較CG組明顯升高，進一步計算HOMA-IR，結(jié)果顯示IRG組HOMA-IR明顯高于CG 組（P＜0.01），詳見表 2。

表2 兩組大鼠FBG、FINS及HOMA-IR的比較

2.3 兩組大鼠血脂及甘油水平的比較

IRG組HDL明顯低于CG組（P＜0.05），而LDL明顯升高（P＜0.05），兩組TG、TC、甘油水平均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表3。

表3 兩組大鼠血脂及甘油水平的比較

2.4 兩組大鼠脂肪細胞因子的比較

IRG組脂聯(lián)素水平低于CG 組（P＜0.05），而 TNF-α 明顯升高（P＜0.05），IL-6差異更明顯（P＜0.01），兩組瘦素、抵抗素均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05），詳見表4。

表4 兩組大鼠脂肪細胞因子的比較

2.5 兩組大鼠不同脂肪組織AQP7 mRNA和蛋白表達水平的比較 CG組大鼠內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪AQP7 mRNA表達無明顯差異，IRG組內(nèi)臟脂肪AQP7 mRNA表達高于皮下脂肪組織（P＜0.05）；相比CG組，IRG組內(nèi)臟脂肪組織AQP7 mRNA表達顯著增加（P＜0.01），在蛋白水平其表達趨勢一致，詳見圖1。

2.6 兩組大鼠不同脂肪組織PKB、p-PKB水平的比較 CG組內(nèi)臟脂肪和皮下脂肪p-PKB水平無明顯差異，IRG組內(nèi)臟脂肪p-PKB表達較皮下脂肪組織減少（P＜0.05）；相比CG組，IRG組內(nèi)臟脂肪組織p-PKB表達明顯下降（P＜0.05），詳見圖 2。

3 討論

現(xiàn)代生活方式的改變、高脂飲食的流行導(dǎo)致機體攝入過多的能量，最終會引起與肥胖相關(guān)的一系列以胰島

圖1 兩組大鼠不同脂肪組織AQP7 mRNA和蛋白水平的比較（a：不同脂肪組織AQP7 mRNA水平比較；b：不同脂肪組織AQP7水平比較；與CG組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與皮下脂肪組織比較，△P＜0.05）

圖2 兩組大鼠不同脂肪組織PKB磷酸化蛋白水平的比較（與CG 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與皮下脂肪組織比較，△P＜0.05）

素抵抗為病理基礎(chǔ)的疾病。筆者采用高脂飼料誘導(dǎo)胰島素抵抗模型，旨在模擬人類營養(yǎng)性肥胖代謝紊亂的自然病理過程。實驗結(jié)果顯示，與CG組相比，IRG組體重明顯增加，血糖、血脂升高，胰島素敏感性下降，表明模型建立成功。

脂肪組織是肥胖、胰島素抵抗發(fā)生的重要部位。脂肪組織存在區(qū)域性分布差異，約有80%分布在皮下，其余分布在腹部內(nèi)臟周圍[2]。內(nèi)臟脂肪組織相比皮下脂肪組織除了代謝產(chǎn)物能直接通過門靜脈入肝之外，其脂肪合成、分解代謝較皮下脂肪更為活躍，這種差異導(dǎo)致了在激素刺激下內(nèi)臟脂肪組織會水解釋放更多的游離脂肪酸和甘油進入肝臟，而皮下脂肪組織攝取游離脂肪酸合成TG，避免脂質(zhì)在非脂肪組織的異位沉積[3]。內(nèi)臟脂肪組織不僅是儲能器官，而且是一個功能活躍的內(nèi)分泌器官，可以分泌多種細胞因子，如瘦素、IL-6、TNF-α、抵抗素、脂聯(lián)素等，這些因子與胰島素抵抗的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。本研究中發(fā)現(xiàn)IRG組分泌過多的IL-6、TNF-α，而脂聯(lián)素的分泌量卻是減少的，這些細胞因子的異常分泌導(dǎo)致發(fā)生胰島素抵抗的風(fēng)險增加。

胰島素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮有賴于細胞內(nèi)各級信號分子的逐級轉(zhuǎn)導(dǎo)。任何一種信號分子的抑制或降解，均會導(dǎo)致機體出現(xiàn)糖脂代謝紊亂等胰島素抵抗現(xiàn)象。正常情況下，胰島素在細胞表面與胰島素受體結(jié)合，誘導(dǎo)胰島素受體底物（IRS）的酪氨酸磷酸化，該底物被激活。IRS激活后，引起下游PI3K介導(dǎo)的PKB絲氨酸殘基磷酸化，這個過程是胰島素介導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。本研究發(fā)現(xiàn)在高脂飼料喂養(yǎng)后，內(nèi)臟脂肪組織P－PKB表達下降，證實了Sandeep等[5]研究顯示內(nèi)臟脂肪更易導(dǎo)致胰島素抵抗。

肥胖不僅表現(xiàn)為脂肪組織質(zhì)量和體積增加，更體現(xiàn)在脂肪組織內(nèi)TG代謝的異常。AQP7作為水通道蛋白家族成員之一，在脂肪組織中大量表達，參與介導(dǎo)甘油轉(zhuǎn)運[6-7]，促進脂肪細胞內(nèi)甘油向細胞外排泄，減少甘油在脂肪細胞內(nèi)的積聚，與糖脂代謝密切相關(guān)[8]，進一步研究發(fā)現(xiàn)：這種肥胖是由于AQP7的缺乏，甘油向細胞外轉(zhuǎn)運減少，激活甘油激酶，TG合成增加，最終引起脂肪細胞體積增加。在AQP7基因敲除小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，缺乏AQP7出現(xiàn)肥胖和胰島素抵抗[9-10]。本課題組前期實驗通過地塞米松處理3T3-L1脂肪細胞誘導(dǎo)胰島素抵抗，發(fā)現(xiàn)AQP7表達下降，在轉(zhuǎn)染高表達AQP7的腺病毒之后可以改善胰島素抵抗，其機制可能與PKB信號通路有關(guān)[11]。在人類研究中發(fā)現(xiàn)，在肥胖伴2型糖尿病患者內(nèi)臟脂肪中AQP7 mRNA表達升高更明顯[12-13]，不僅如此，Rodriguez等[14]在蛋白水平也同樣證實這一現(xiàn)象，推測內(nèi)臟脂肪組織AQP7的表達與胰島素抵抗密切相關(guān)。內(nèi)臟脂肪蓄積過多會轉(zhuǎn)移到肝臟、骨骼肌、心臟等其他組織，不僅產(chǎn)生脂毒性、造成臟器損傷，而且會引起一系列代謝紊亂疾病，本研究發(fā)現(xiàn)AQP7 mRNA在內(nèi)臟脂肪組織中高表達，同時也在蛋白水平證實了AQP7在肥胖個體是增高的，從轉(zhuǎn)錄水平到蛋白水平表達趨勢一致。由此推測AQP7在內(nèi)臟脂肪中表達升高，可能與機體的代償性調(diào)節(jié)有關(guān)。

綜上所述，本研究以通過高脂飲食構(gòu)建胰島素抵抗模型，發(fā)現(xiàn)主要是內(nèi)臟脂肪的AQP7與肥胖和糖尿病的發(fā)生相關(guān)，對其深入發(fā)掘可能為肥胖、糖尿病的防治提供一個嶄新的思路。

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Effects of aquaporin 7 in different adipose tissues of rats with insulin resistance

PAN Wei,SHEN Feixia,GU Xuemei.Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the expression of aquaporin 7(AQP7)in different adipose tissues of insulin resistance rats. Methods Male SD rats were randomly divided into insulin resistant and control groups with 10 animals in each.The insulin resistance model was induced by feeding with high-fat diet.The changes of body weight,serum triglyceride,cholesterol,high density lipoprotein,low density lipoprotein,glycerol,fasting blood glucose,insulin and adipokines in two groups were observed.The expression of AQP7 mRNA and protein,and the expression of PKB and phosphorylated protein in subcutaneous adipose tissue(SAT)and epididymal adipose tissue(visceral adipose tissue,VAT)were detected and compared. Results Compared to control group,the serum low density lipoprotein,fasting blood glucose,insulin,IL-6,TNF-α and HOMA-IR in insulin resistance group were higher(P＜0.01 or P＜0.05),while high density lipoprotein and adiponectin were lower(P＜0.05)at 12th week after high diet feeding.The level of AQP7 expression in VAT was higher than that in SAT,and the expression of AQP7 in VAT of insulin resistance group was higher than that of control group in both gene and protein level.The expression of PKB phosphorylated protein in VAT was lower than that in SAT,and the expression level in insulin resistance group was lower than that in control group. Conclusion The abnormal expression of AQP7 in visceral adipose tissue may be related to the occurrence of insulin resistance.

AQP7 Adipose tissue Inulin resistance

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.22.2017-990

國家自然科學(xué)基金青年資助項目（81000356）；浙江省自然科學(xué)基金（Y2080418）

325000 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科

沈飛霞，E-mail:sfx301@163.com

2017-05-01）

嚴瑋雯）