熊雅婷+白蓮英+吳益清+玄兵

擬除蟲菊酯是一類人工合成的殺蟲劑，包括醚菊酯、芐氯菊酯、溴氰菊酯、氯氰菊酯等20種農(nóng)藥，因其殺蟲譜廣且效果好而被廣泛用于防治農(nóng)業(yè)害蟲，在蔬菜、果樹害蟲防治等方面取得了較好的效果。目前，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥已成為我國使用量最大的農(nóng)藥種類之一，但是由于使用面積大、應(yīng)用范圍廣、接觸人群多、生物毒性強(qiáng)、高殘留且具有富集性及難以降解等特殊性質(zhì)，擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留也已成為一種嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，因其導(dǎo)致的中毒現(xiàn)象屢有發(fā)生，尤其是谷物、水果、蔬菜等食品中殘留的低濃度農(nóng)藥進(jìn)入人體所造成的慢性和亞慢性毒性問題。我國強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中明確規(guī)定了擬除蟲菊酯類各種農(nóng)藥的殘留限量要求，其中蔬菜中的MRL低至0.5mg/kg；歐盟也將擬除蟲菊酯類農(nóng)藥定為農(nóng)產(chǎn)品中不得檢出的農(nóng)藥品種。隨著我國國際化進(jìn)程的不斷加快，國內(nèi)的檢測標(biāo)準(zhǔn)和方法靈敏度呈現(xiàn)出越來越嚴(yán)格的趨勢，這意味著對國內(nèi)檢測方法的技術(shù)水平和便捷性提出了更高的要求。

目前，對擬除蟲菊酯殘留的檢測主要為儀器檢測法，包括氣相色譜-電子捕獲法（Gas Chromatography- Electron Capture DetectorGas，GC-ECD）、氣相色譜-質(zhì)譜法（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）等。盡管這些方法靈敏度較高，但樣品的前處理步驟較多，相對費(fèi)時(shí)且檢測費(fèi)用較高，不適用于大量樣品的檢測。

酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）作為一種基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)的檢測方法，具有特異性強(qiáng)、樣品容量大、樣品前處理簡單和分析成本低等特點(diǎn)，在大量樣本和現(xiàn)場樣本快速篩選檢測中顯現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。目前已有學(xué)者初步研究了ELISA技術(shù)用于擬除蟲菊酯類藥物檢測，文孟棠等人研究了大白菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥半定量ELISA檢測方法，優(yōu)化了抗原抗體反應(yīng)時(shí)間，但是對63個(gè)大白菜樣本檢測假陽性率達(dá)9.3%，假陰性率達(dá)2.7%，樣本少且誤判率較高，不利于實(shí)際應(yīng)用；駱愛蘭、余向陽等人研究了甲氰菊酷、氯氰菊醋、三氟氯氰菊酷、澳氰菊醋4種農(nóng)藥的ELISA同時(shí)檢測，但是檢出限僅能達(dá)到217.2μg/kg，且假陽性率為4.72%，檢測水平有待提高；郝曉蕾利用間接ELISA方法研究了氰基擬除蟲菊酯的快速檢測，但是靈敏度不高，檢測指標(biāo)有限。由此看來，目前關(guān)于酶聯(lián)免疫吸附法用于擬除蟲菊酯類藥物檢測的文獻(xiàn)報(bào)道較為匱乏，多種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測技術(shù)、相關(guān)產(chǎn)品研制與應(yīng)用均存在巨大潛力。

本研究通過自主研發(fā)人工抗原及多克隆抗體，建立了蔬菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留ELISA快速檢測方法，用于氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯等多種藥物的同時(shí)檢測，探討了擬除蟲菊酯酶聯(lián)免疫試劑盒的各項(xiàng)檢測性能，以達(dá)到保障農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全，提升菊酯類藥物快速檢測技術(shù)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜樣本均購買于北京大型超市；擬除蟲菊酯類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；去離子水、濃縮洗滌液（磷酸緩沖液）（北京維德維康生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀（MK3型，美國Thermo）；離心機(jī)（TDL-40C型，上海安亭科學(xué)儀器廠）；渦動儀（HQ-60型，北京方正生物科技發(fā)展有限公司）；超純水儀（Milli-Q Academic A10型號，美國Milli-Q公司）；氮吹儀（N-EVAP型，美國Organomation公司）等。

1.3 方法

1.3.1 半抗原制備

半抗原結(jié)構(gòu)一的合成：稱取500mg化合物1于50mL三口瓶中，加入10mL DMF溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反應(yīng)30min，加入琥珀酸酐室溫反應(yīng)4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，點(diǎn)板化合物1反應(yīng)完后，加水和乙酸乙酯萃取3次，將有機(jī)相合并后用無水硫酸鈉干燥半小時(shí)，濃縮，得到的物質(zhì)即為半抗原結(jié)構(gòu)一。

半抗原結(jié)構(gòu)二的合成：稱取500mg化合物1于50mL三口瓶中，加入10mL N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）溶解，加入160mg NaH（6.7mmoL）冰浴反應(yīng)30min，加入鄰苯二甲酸酐室溫反應(yīng)4h；石油醚∶乙酸乙酯=6∶1，點(diǎn)板化合物1反應(yīng)完后，加水和乙酸乙酯萃取3次，將有機(jī)相合并后用無水硫酸鈉干燥半小時(shí)，濃縮，得到的物質(zhì)即為半抗原結(jié)構(gòu)二。

1.3.2 人工抗原的制備

免疫原制備：將14.52mg半抗原結(jié)構(gòu)一用1.5mL DMF溶解，200rpm攪拌10min，加入1-（3-二甲基胺丙基）-3-乙基碳二亞胺（1-（3-dimethylaminopropyl）3-ethylcarbodiimide，EDC）225.7mg，溶解后再加入NHS 20.3mg，室溫?cái)嚢杌罨?～3h。稱取牛血清白蛋白50mg溶于3.5mL 0.1M碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌10min，使其充分溶解，冰浴降溫（0～4℃），1000rpm攪拌下，將步驟1反應(yīng)液逐滴加入，500rpm攪拌反應(yīng)24h。將反應(yīng)產(chǎn)物裝入蒸餾水沖洗干凈透析袋（10cm），1L 0.01M PBS（1×，pH7.2）4℃攪拌（100rpm）透析3d，將透析產(chǎn)物5000rpm離心6min，將抗原編號，于-20℃下保存?zhèn)溆谩?img src="https://cimg.fx361.com/images/2017/12/21/spaq201711spaq20171111-1-l.jpg" style=""/>

包被原制備：將24.8mg半抗原結(jié)構(gòu)二用1.5mL DMF溶解，200rpm攪拌10min，加入EDC 38.35mg溶解后再加入NHS 23mg，室溫?cái)嚢瑁?00rpm）活化2～3h。稱取卵清蛋白50mg溶于3.5mL 0.1moL/L碳酸氫鈉溶液中，200rpm攪拌10min，使其充分溶解，冰浴降溫至0～4℃，1000rpm下攪拌，逐滴加入（1mL/min）步驟1的反應(yīng)液，500rpm攪拌反應(yīng)24h。將反應(yīng)產(chǎn)物裝入用蒸餾水沖洗干凈的透析袋（10cm），加入1L 0.01M PBS（1×，pH7.2），4℃攪拌（100rpm）透析3d，每天換液3次，將透析產(chǎn)物5000rpm離心6min，將抗原編號，于-20℃保存?zhèn)溆?。endprint

1.3.3 抗體制備與純化

以研發(fā)的人工抗原新西蘭雌性大白兔為研究對象，采用背部皮下多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫。首次用弗氏完全佐劑乳化人工抗原免疫，間隔一定時(shí)間后進(jìn)行加強(qiáng)免疫（佐劑為IFA）。每種抗原的免疫劑量是每只兔子1000μg，免疫間隔3周，收集得到的多抗血清用蛋白A親和柱進(jìn)行純化，凍干后于-20℃環(huán)境下保存。

1.3.4 ELISA方法的建立

取1.0±0.01g均質(zhì)后的蔬菜樣品于50mL離心管中，加入5mL甲醇，充分渦動1min；4000rpm離心5min；取100μL上清液于新的離心管中，加入400μL樣品稀釋液，充分渦動30s；用于后續(xù)檢測。

用包被緩沖液稀釋包被抗原，每孔加入100μL，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌4次，每次30s，拍干；在每孔中加入200μL封閉液，37℃溫育2h，傾去封閉液，用洗滌液洗滌4次，每次30s，拍干；依次將50μL各標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣品溶液、80μL酶標(biāo)抗體工作液加入對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品/樣本孔中，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25±2℃）避光反應(yīng)40min；洗滌4次，拍干；立即在每孔中加入100μL A、B混合液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下（25±2℃），避光反應(yīng)10～15min；揭開蓋板膜，在每孔中加入50μL終止液，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻；5min內(nèi)用酶標(biāo)儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標(biāo)板吸光度值。

1.3.5 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

在空白標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入擬除蟲菊酯（氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯），使標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)到一系列濃度（0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43μg/L），根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算擬除蟲菊酯的半抑制濃度（IC50）。

1.3.6 試劑盒性能驗(yàn)證

為了評價(jià)該分析方法和測量系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，采用空白樣品（不含擬除蟲菊酯類農(nóng)殘）進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，分別考察ELISA技術(shù)的檢出限、準(zhǔn)確度、精密度以及特異性。

檢出限：分別測定20份小白菜、油菜、菠菜、圓白菜等蔬菜樣本，取其測定平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差（SD）即為本方法的檢出限。

特異性試驗(yàn)：選取氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、聯(lián)苯菊酯、溴氰菊酯、樂果、對硫磷等常見農(nóng)藥，計(jì)算各自的IC50，并按照下式計(jì)算交叉反應(yīng)率—交叉反應(yīng)率（CR%）=IC50（氯氰菊酯）/IC50（結(jié)構(gòu)類似物）×100%。

準(zhǔn)確度驗(yàn)證：取空白小白菜、油菜、菠菜、圓白菜樣本分別添加5.0μg/L、10.0μg/L氯氰菊酯，6.0μg/L、15.0μg/L甲氰菊酯、溴氰菊酯，15.0μg/L、30.0μg/L順式氰戊，7.0μg/L、15.0μg/L氰戊菊酯，每個(gè)樣本進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，并檢測，記錄檢測結(jié)果，計(jì)算回收率。

精密度驗(yàn)證：隨機(jī)抽取3批次酶標(biāo)板進(jìn)行檢測，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算批內(nèi)、批間變異系數(shù)。

儀器確證試驗(yàn)：利用本研究開發(fā)的擬除蟲菊酯試劑盒和氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分別對20個(gè)蔬菜樣本進(jìn)行檢測，比對檢測結(jié)果，確定該檢測方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過對抗原抗體制備，優(yōu)化反應(yīng)條件（抗原抗體濃度、包被方式、加樣體系、反應(yīng)時(shí)間等），選擇IC50最低值作為最佳工作條件，此時(shí)靈敏度最高。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖所示，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值（μg/L），縱坐標(biāo)為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合率（B/B0×100%），計(jì)算得R2=0.995；IC50=0.47μg/L；標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為：0.08～0.81μg/L。

2.2 交叉反應(yīng)率

本研究所用的擬除蟲菊酯多克隆抗體與其它農(nóng)藥的交叉反應(yīng)率情況見表1，所研制的多克隆抗體可以實(shí)現(xiàn)氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5種菊酯類藥物的同時(shí)檢測，并與其它藥物交叉反應(yīng)率小于0.1，說明抗體特異性強(qiáng)，與其他藥物無交叉，檢測指標(biāo)全面，可以實(shí)現(xiàn)5種菊酯藥物的特異性檢測。

2.3 試劑盒性能驗(yàn)證

2.3.1 檢出限驗(yàn)證

分別對20份小白菜、油菜、菠菜、圓白菜等蔬菜空白樣本進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示，本試劑盒對小白菜、油菜、菠菜、圓白菜中擬除蟲菊酯的檢出限（LOD）分別為4.95μg/L、4.64μg/L、4.18μg/L、3.57μg/L，為保障試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確和穩(wěn)定，設(shè)置本試劑盒的檢出限為5.0μg/L。由各項(xiàng)藥物的交叉反應(yīng)率（如表1）可知，試劑盒對氯氰菊酯的檢出限約為5.0μg/L，對甲氰菊酯的檢出限約為6.0μg/L、順式氰戊的檢出限約為15.0μg/L、氰戊菊酯的檢出限約為7.0μg/L、溴氰菊酯的檢出限約為6.0μg/L。

2.3.2 ELISA方法的準(zhǔn)確度、精密度驗(yàn)證

通過添加藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液計(jì)算試劑盒的回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，來評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度。由表3可知，各種蔬菜樣本的添加回收率范圍為65.5%～109.6%；批內(nèi)、批間變異系數(shù)均小于5%，說明所研制的擬除蟲菊酯酶聯(lián)免疫試劑盒具有良好的回收率，準(zhǔn)確度較高，精密度達(dá)到了行業(yè)對于ELISA試劑盒要求的技術(shù)水平。

2.3.3 儀器確證試驗(yàn)

從超市購買小白菜、菠菜、油菜、圓白菜樣本各20份，分別用擬除蟲菊酯試劑盒（檢出限為5.0g/L）和氣相色譜-質(zhì)譜（檢出限為2.0g/L）進(jìn)行檢測，低于檢出限用“0.05），由此可見，兩種方法的檢測結(jié)果無顯著性差異。通過對比發(fā)現(xiàn)，本研究研制的擬除蟲菊酯ELISA試劑盒達(dá)到了與儀器確證方法相同的檢測水平，能準(zhǔn)確檢測蔬菜中擬除蟲菊酯的殘留，同時(shí)，ELISA方法操作便捷，節(jié)約了大量時(shí)間，能夠大幅度降低檢測成本。

3 結(jié)論

目前，關(guān)于擬除蟲菊酯快速檢測方法的研究報(bào)道較少，使用常規(guī)儀器的檢測方法操作繁瑣，耗時(shí)長。本研究通過人工合成抗原，突破性地建立了“一步法”酶聯(lián)免疫方法，并研制了相應(yīng)的酶聯(lián)免疫試劑盒來實(shí)現(xiàn)蔬菜中擬除蟲菊酯藥物殘留的快速檢測。此方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：

①所研制的多殘留試劑盒檢出限可低至5.0μg/L，與駱愛蘭、余向陽、孫寧浩、張婧等人的單一藥物殘留檢測方法檢出限（分別為217.2g/L、0.2 mg/L、0.01～0.02mg/kg）相比靈敏度有顯著提高。

②半抗原合成路線簡潔，僅兩步反應(yīng)即可完成抗原制備，最大限度的保留了藥物的公共部分，充分增加了交叉藥物種類，檢測指標(biāo)覆蓋氯氰菊酯、甲氰菊酯、順式氰戊、氰戊菊酯、溴氰菊酯5種擬除蟲菊酯藥物，與劉景坤、李志茹、胡久平、文孟棠等人的單一藥物檢測報(bào)道相比，藥物覆蓋全面，交叉反應(yīng)率分布平均，更具廣譜性。

③本研究開發(fā)了“一步法”酶聯(lián)免疫方法，樣本前處理簡單，檢測過程操作步驟簡潔，可在1h內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣本檢測，能夠有效降低檢測成本。

④通過驗(yàn)證所研制酶聯(lián)免疫試劑盒的檢出限、準(zhǔn)確度、精密度，各項(xiàng)指標(biāo)均符合我國殘留檢測標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，并且通過實(shí)際樣本檢測也進(jìn)一步證實(shí)了本方法的實(shí)用性。