吳 玥，周峻崗,2，呂 紅,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海200438)

信號(hào)肽對(duì)木聚糖酶在馬克斯克魯維酵母中分泌表達(dá)的影響

吳 玥1，周峻崗1,2，呂 紅1,2

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438；2. 上海工業(yè)菌株工程技術(shù)研究中心，上海200438)

馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)是一種新型的非常規(guī)酵母，具有生長快、分泌能力強(qiáng)、安全性高等優(yōu)勢．在酵母表達(dá)系統(tǒng)中，分泌信號(hào)肽不僅介導(dǎo)了外源蛋白沿著正確途徑分泌到胞外，也在蛋白質(zhì)翻譯后加工等方面發(fā)揮了重要作用．本文分別研究了釀酒酵母α-Factor信號(hào)肽和克魯維酵母菊粉酶信號(hào)肽對(duì)耐熱木聚糖酶在馬克斯克魯維酵母中的分泌表達(dá)影響．工程菌搖瓶發(fā)酵72h后，在含有菊粉酶信號(hào)肽和α-Factor信號(hào)肽的工程菌株的發(fā)酵上清中，木聚糖酶酶活分別為318.91U/mL和117.90U/mL，表明馬克斯克魯維酵母表達(dá)木聚糖酶時(shí)，菊粉酶信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白分泌表達(dá)效果優(yōu)于α-Factor信號(hào)肽．重組表達(dá)木聚糖酶最適反應(yīng)條件是pH 5.5和65℃，在75℃處理1h后，該酶的剩余酶活保留73%以上．在5L發(fā)酵罐中，重組菌高密度發(fā)酵72h，木聚糖酶酶活高達(dá)157757U/mL，結(jié)果表明，馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)在工業(yè)酶領(lǐng)域中應(yīng)用具有非常廣闊的前景．

木聚糖酶； 馬克斯克魯維酵母； 信號(hào)肽； 高效表達(dá)

植物細(xì)胞壁的主要成分為纖維素和半纖維素，這些物質(zhì)是自然界中重要的可再生能源．半纖維素的核心組分是木聚糖，并連接了甘露糖、半乳糖等糖基組分，形成一種高度異構(gòu)的雜聚糖，自然狀態(tài)下難以分解，因此不能得到有效利用．木聚糖酶(Xylanase)是一類能夠特異降解木聚糖的酶類，主要分為3類： (1) β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)： 主要作用方式為內(nèi)切，使木聚糖或長鏈木寡糖主鏈內(nèi)部的β-1,4 糖苷鍵斷裂，水解為木二糖、木三糖等低聚寡糖；(2) β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92)： 作用于木聚糖或木寡糖的非還原端，水解產(chǎn)物為木糖[1]；(3) β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)．我們所說的木聚糖酶一般是指β-1,4-D-內(nèi)切木聚糖酶[2]．依據(jù)序列及結(jié)構(gòu)特征，木聚糖酶可以歸類到糖基水解酶家族5、7、8、10、11、26、30和43(http:/www.cazy.org/fam/acc_GH.html)，其中家族10和11木聚糖酶的研究較為深入，它們的底物特異性較低，能夠水解側(cè)鏈修飾的木聚糖[3]．

木聚糖酶可廣泛應(yīng)用于食品、造紙、飼料、生物燃料、污水處理和農(nóng)業(yè)廢棄物處理等方面[4-6]．自然環(huán)境中產(chǎn)木聚糖酶的細(xì)菌、真菌、酵母、植物以及昆蟲十分豐富，迄今為止已從降解半纖維素的微生物中分離鑒定出許多特性優(yōu)良的木聚糖酶產(chǎn)生菌，已報(bào)道的木聚糖酶基因達(dá)400多種，而且大部分產(chǎn)木聚糖酶的微生物為嗜溫性微生物[4]，其中，曲霉屬Aspergillus和木霉屬Trichoderma被認(rèn)為是產(chǎn)木聚糖酶最具潛力的菌種．迄今為止，已成功表達(dá)木聚糖酶基因的微生物有伯克霍爾德菌屬Burkholderiasp.[7]， 短小芽胞桿菌Bacilluspumilus[8-9]，鏈霉菌屬Streptomyces[10-11]， 黑曲霉Aspergillusniger[12]， 嗜熱擬青霉Paecilomycesthermophila[13]，長梗木霉Trichodermalongibrachiatum[14]，疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyceslanuginosus[15]．

馬克斯克魯維酵母K.marxianus是一種新型的食品安全級(jí)酵母，已通過美國GRAS(Generally Regarded as Safe)和歐洲QPS(Qualified Presumption of Safety)安全認(rèn)證[16-17]．馬克斯克魯維酵母具有生物量高、生長快、耐高溫、可利用多種碳源等特性，在工業(yè)領(lǐng)域有很大的應(yīng)用潛力[18-19]．構(gòu)建和改造酵母表達(dá)系統(tǒng)是提高外源基因分泌表達(dá)能力的關(guān)鍵因素之一．其中，信號(hào)肽直接影響著新合成蛋白質(zhì)的分泌效率．在酵母中，小分子多肽或蛋白的分泌表達(dá)一般采用釀酒酵母α-factor信號(hào)肽[20]，而在克魯維酵母中，菊粉酶信號(hào)肽也是一種高效的蛋白分泌信號(hào)肽．本研究將α-factor信號(hào)肽和菊粉酶信號(hào)肽分別用于在馬克斯克魯維酵母中表達(dá)木聚糖酶基因，分析這兩種信號(hào)肽對(duì)馬克斯克魯維酵母分泌表達(dá)木聚糖酶的影響，從而為馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)的完善和木聚糖酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α、馬克斯克魯維酵母菌株K.marxianusFim-1(ura3Δ)、質(zhì)粒pUKDN118、質(zhì)粒pPIC9K-C60A-G201C(含有融合有α-Factor的木聚糖酶基因XYN)均為本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.1.2 主要試劑

實(shí)驗(yàn)中所用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase購于南京諾唯贊生物科技有限公司；QuickCutTMSpeⅠ、QuickCutTMSacⅡ等購于TaKaRa；1kb plus DNA Ladder和Prestained Protein Ladder購于Thermo Fisher Scientific公司；Gibson Assembly?Master Mix購自New England Biolab公司；小量質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購于杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司；阿拉伯木聚糖購于Megazyme公司；樺木木聚糖購于Sigma-Aldrich公司．其他試劑均為國產(chǎn)分析純．

1.1.3 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基(1L)： Glucose 20g；Polypeptone 20g；Yeast extract 10g；115℃高壓滅菌15min．

YD培養(yǎng)基(1L)： Glucose 40g；Yeast extract 20g；115℃高壓滅菌15min．

SD-Ura-培養(yǎng)基(1L)： Yeast nitrogen base w/o amino acids 6.7g；Glucose 20g；agar 20g；115℃高壓滅菌15min．

合成培養(yǎng)基(1L)： Glucose 5g；(NH4)2SO45g；MgSO4·7H2O 0.5g；KH2PO43g；ethylene diaminetetra acetic acid(EDTA) 15mg；ZnSO4·7H2O 4.5mg；MnCl2·7H2O 1mg；CoC12·6H2O 0.3mg；CuSO4·5H2O 0.3mg；Na2MoO4·2H2O 0.4mg；CaC12.2H2O 4.5mg；FeSO4·7H1O 3mg；H3BO31mg；KI 0.1mg；biotin 0.1mg；Ca-pantothenate 1mg；nicotinic acid 1mg；115℃高壓滅菌15min．

1.2 方法

1.2.1 含不同信號(hào)肽木聚糖酶馬克斯克魯維酵母工程菌的構(gòu)建

以Neocallimastixpatriciarum來源的XYN的質(zhì)粒為模板，利用引物Inu-xyn-F(5’-TACAAGAGA GACGGTCCGCGGCAAAGTTTCTGTAGTTCAGC)和Inu-xyn-R(5’-AGCTTGCGGCCTTAACTAGTATC-ACCAATGTAAACCTTTG)，PCR擴(kuò)增獲得XYN片段，然后采用PCR擴(kuò)增的方法，將菊粉酶信號(hào)肽序列(atgaagttagcatactccctcttgcttccattggcaggagtcagtgcttcagtgatcaattacaagaga, 69bp)融合在XYN的5’端，而融合α-Factor信號(hào)肽序列(atgagatttccttcaatttttactgcagttttattcgcagcatcctccgcattagctgctccagtcaacactacaacagaagatgaaacggc-acaaattccggctgaagctgtcatcggttactcagatttagaaggggatttcgatgttgctgttttgccattttccaacagcacaaataacgggttattgtttataaatacta-ctattgccagcattgctgctaaagaagaaggggtatc, 242bp)的XYN片段的PCR擴(kuò)增則采用引物α-Factor-xyn-F(5’-TT-TTTTTGTTAGATCCGCGGATGAGATTTCCTTCAATTTT)和α-Factor-xyn-R(5’-AGCTTGCGGCCTTAAC-TAGTATCACCAATGTAAACCTTTG)，擴(kuò)增產(chǎn)物通過常規(guī)分子生物學(xué)方法[21]分別克隆到KM表達(dá)載體pUKDN118(中國發(fā)明專利申請(qǐng)201510562564)，構(gòu)建含XYN的重組KM菊粉酶信號(hào)肽分泌表達(dá)載體pUKD-Inu-xyn和α-Factor信號(hào)肽分泌表達(dá)載體pUKD-α-Factor-xyn．通過馬克斯克魯維酵母化學(xué)轉(zhuǎn)化[22]，將兩種表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入K.marxianusFim-1(ura3Δ)，用SD-Ura-平板進(jìn)行轉(zhuǎn)化子的篩選，利用引物Inu-xyn-F和Inu-xyn-R、α-Factor-xyn-F和α-Factor-xyn-R，對(duì)SD-Ura-平板上形成的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并送上海杰李生物技術(shù)有限公司測序．

1.2.2 重組馬克斯克魯維酵母工程菌的木聚糖酶表達(dá)分析

挑取鑒定陽性的重組菌株單克隆于50mL YEPD液體培養(yǎng)基中，30℃，220r/min，搖床培養(yǎng)72h，吸取一定體積的菌液測定細(xì)胞內(nèi)和上清中的木聚糖酶的酶活．木聚糖酶的活性測定采用二硝基水楊酸(DNS)法[23]，100μL 50mmol/L醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)稀釋的酶液與100μL 2%木聚糖溶液混合，60℃反應(yīng)10min，立即加入200μL DNS，沸水浴反應(yīng)10min，冷卻后在570nm處測定吸光度，并以木糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行木聚糖酶的定量，1酶活單位(U)定義為每分鐘水解產(chǎn)生1μmol還原糖[24]．

1.2.3 馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)的木聚糖酶性質(zhì)分析

木聚糖酶的最適反應(yīng)pH測定： 以50mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 3.5～7.0)稀釋木聚糖酶酶液，然后加入等體積的2%木聚糖溶液，60℃反應(yīng)10min后用DNS法測定木聚糖酶活力．

木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度測定： 以50mmol/L的醋酸鈉緩沖液(pH 5.5)稀釋木聚糖酶酶液，然后加入等體積的2%木聚糖溶液，分別在45，50，55，60，65，70，75，80℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定其木聚糖酶的活力．

pH穩(wěn)定性的測定： 采用50mmol/L的醋酸鈉緩沖液pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，60℃處理木聚糖酶酶液1h后，用最適pH緩沖液適當(dāng)稀釋后，測定其木聚糖酶活力．

溫度穩(wěn)定性測定： 將酶液分別在45，50，55，60，65，70，75，80℃水浴中處理1h，冷卻后測定其木聚糖酶活力．

重組木聚糖酶水解木聚糖的產(chǎn)物分析： 將5μL木聚糖酶酶液與95μL 2%的木聚糖溶液混合，65℃分別反應(yīng)0.5h，1h，2h后，取4μL點(diǎn)在60 F254硅膠上，采用正丁醇/乙醇/水(體積比5∶3∶2)為展開劑進(jìn)行薄層層析(TLC)，展開1～2次后吹干，噴上顯色劑(5% H2SO4+95% ethanol)，110℃烘烤5min顯色．

1.2.4 重組木聚糖酶馬克斯克魯維酵母工程菌的高密度發(fā)酵

將重組木聚糖酶馬克斯克魯維酵母工程菌在新鮮的SD-URA-培養(yǎng)基進(jìn)行活化，然后挑取單克隆接種于150mL合成培養(yǎng)基中，30℃，搖床培養(yǎng)36h．將種子液按1∶10接種于裝有1.5L培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置為： 溫度30℃，罐壓0.01Mpa，溶氧控制在30%左右，攪拌速度200～800r/min．當(dāng)葡萄糖消耗完全后進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料流速30mL/h，發(fā)酵周期控制在72～96h，發(fā)酵周期測定菌體密度和木聚糖酶的產(chǎn)量．

1.2.5 木聚糖酶的糖基化分析

采用在線軟件NetNGlyc(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測木聚糖酶氨基酸序列中糖基化位點(diǎn)．利用EndoglycosidaseH(EndoH)進(jìn)行馬克斯克魯維酵母表達(dá)的木聚糖酶的去糖基化分析，酶切反應(yīng)過程如下： 取5μL重組酶液、1μL 10×Glycoprotein Denaturing Buffer和4μL ddH2O，混勻后100℃水浴10min；加入2μL 10×Glyco Buffer3、3μLEndoH、5μL ddH2O，37℃水浴1h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行SDS-PAGE分析．

2 結(jié) 果

2.1 含不同信號(hào)肽的耐熱木聚糖酶分泌表達(dá)酵母工程菌的構(gòu)建

圖1 重組菌轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定Fig.1 PCR validation of the Ura+transformantsM: 1kb DNA ladder；1,2: Fim-1/pUKD-Inu-xyn；3,4: Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn.

以含木聚糖酶基因的SEQ ID No.1序列(中國發(fā)明專利申請(qǐng)CN200810200060)為模板[25]，采用PCR擴(kuò)增的方法，將釀酒酵母α-Factor信號(hào)肽的編碼核苷酸序列和菊粉酶信號(hào)肽編碼序列融合在XYN的5’端，擴(kuò)增產(chǎn)物通過常規(guī)分子生物學(xué)方法克隆到KM表達(dá)載體pUKDN118(中國發(fā)明專利申請(qǐng)201510562564)，構(gòu)建含有α-Factor信號(hào)肽和菊粉酶信號(hào)肽的耐溫木聚糖酶重組表達(dá)載體．重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化馬克斯克魯維酵母表達(dá)宿主菌K.marxianusFim-1(ura3Δ)，用SD-Ura-平板篩選轉(zhuǎn)化子．提取轉(zhuǎn)化子的基因組，利用引物Inu-xyn-F和Inu-xyn-R、α-Factor-xyn-F和α-Factor-xyn-R進(jìn)行PCR鑒定，若擴(kuò)增產(chǎn)物約分別為750bp和1000bp的克隆，既為重組表達(dá)木聚糖酶的馬克斯克魯維酵母工程菌(圖1)，其中α-Factor信號(hào)肽融合表達(dá)木聚糖酶的工程菌命名為Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn，而菊粉酶信號(hào)肽融合表達(dá)的工程菌則命名為Fim-1/pUKD-Inu-xyn．

2.2 兩種重組木聚糖酶酵母工程菌分泌表達(dá)水平的比較

Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn和Fim-1/pUKD-Inu-xyn分別接種于50mL YD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)72h后檢測發(fā)酵液上清和細(xì)胞內(nèi)木聚糖酶酶活，結(jié)果如表1所示，兩株木聚糖酶重組菌的胞內(nèi)與發(fā)酵上清液中均檢測到木聚糖酶的表達(dá)，但上清中的酶活遠(yuǎn)高于胞內(nèi)，分泌效率均在99%以上．結(jié)果表明，在馬克斯克魯維酵母中，α-Factor信號(hào)肽和菊粉酶信號(hào)肽都能引導(dǎo)重組蛋白分泌到胞外，但菊粉酶信號(hào)肽融合表達(dá)木聚糖酶的表達(dá)量高于α-Factor信號(hào)肽，上清中的酶活達(dá)318.91U/mL．

表1 不同信號(hào)肽融合表達(dá)的重組菌發(fā)酵胞內(nèi)與胞外木聚糖酶酶活Tab.1 The amount of intracellular and extracellular xylanase produced by the recombinant strains

2.3 重組木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)

利用不同pH緩沖液(3.5～7.0)，測定了木聚糖酶的最適反應(yīng)pH值，結(jié)果表明： 木聚糖酶的最適反應(yīng)pH為5.5，在pH 5.0～6.0范圍內(nèi)酶活力均在80%以上；在pH 3.5～4.5和pH 6.5～7.0范圍內(nèi)，酶的活性明顯下降(圖2(a))．

在50mmol/L的醋酸鈉pH 5.5緩沖液中，測定不同反應(yīng)溫度對(duì)木聚糖酶的影響，結(jié)果表明： 木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度為65℃；溫度提高到80℃，相對(duì)酶活力下降至76%；溫度低于50℃，則相對(duì)酶活力低于50%(圖2(b))．

圖2 木聚糖酶的(a)最適反應(yīng)pH和(b)最適反應(yīng)溫度Fig.2 (a) The optimum pH and (b) temperature of xylanase

將發(fā)酵上清液分別在不同pH緩沖液(3.5～7.0)中60℃處理1h后，在最適反應(yīng)條件下測定木聚糖酶的剩余酶活力，以酶活力最高的為對(duì)照，設(shè)為100%．結(jié)果表明： 木聚糖酶在pH 5.0～7.0范圍內(nèi)較穩(wěn)定，處理1h后殘余酶活力保持在70%以上；但pH 3.5～4.5條件下木聚糖酶的穩(wěn)定性較差(圖3(a)，見第450頁)．

將發(fā)酵上清液分別在不同溫度(45～80℃)下水浴處理1h，在最適反應(yīng)條件下測定木聚糖酶的剩余酶活力，以酶活力最高的為對(duì)照，設(shè)為100%．結(jié)果表明： 木聚糖酶在45～70℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，剩余酶活均保持在84%以上；75℃處理1h時(shí)，剩余酶活仍有73%；而80℃處理1h后，剩余酶活僅為29%(圖3(b))．

比較馬克斯克魯維酵母和大腸桿菌表達(dá)的木聚糖酶的最適反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)馬克斯克魯維酵母和大腸桿菌表達(dá)的木聚糖酶的最適反應(yīng)溫度都在65℃左右，最適反應(yīng)pH值也都在5.5左右，說明馬克斯克魯維酵母表達(dá)的木聚糖酶與在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)該酶的變化趨勢一致，具有較高的催化活性[25]．

圖3 木聚糖酶的(a)pH穩(wěn)定性和(b)熱穩(wěn)定性Fig.3 (a) The pH stability and (b) thermostability of xylanase

圖4 木聚糖水解產(chǎn)物的薄層層析分析Fig.4 TLC analysis of the xylan hydrolysatesM: 木糖；1： 樺木木聚糖水解30min；2： 樺木木聚糖水解1h；3： 樺木木聚糖水解2h；4： 阿拉伯木聚糖水解30min；5： 阿拉伯木聚糖水解1h；6： 阿拉伯木聚糖水解2h.

分別以阿拉伯木聚糖和樺木木聚糖為底物進(jìn)行水解，薄層層析分析結(jié)果表明： 木聚糖能夠被水解為木二糖、木三糖以及更高聚合度的木寡糖，并且有少量木糖產(chǎn)生(圖4)，說明該木聚糖酶主要通過內(nèi)切方式，使木聚糖主鏈內(nèi)部的β-1,4糖苷鍵斷裂，水解為木二糖、木三糖等低聚寡糖．樺木木聚糖是直鏈型木聚糖，側(cè)鏈沒有修飾，而阿拉伯木聚糖中存在高度阿拉伯糖修飾，阿拉伯糖與木糖的比例約為38∶62，由此說明，重組木聚糖酶對(duì)側(cè)鏈修飾的木聚糖也有較高的水解活性．

2.4 不同信號(hào)肽木聚糖酶重組菌株的高密度發(fā)酵

發(fā)酵72h后兩株重組菌的細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期，菌體密度OD600都在240左右，F(xiàn)im-1/pUKD-Inu-xyn重組菌的細(xì)胞干重達(dá)到90g/L，而Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn重組菌的細(xì)胞干重為87g/L．發(fā)酵過程重組菌的產(chǎn)酶水平檢測表明，F(xiàn)im-1/pUKD-Inu-xyn在合成培養(yǎng)基中發(fā)酵72h，木聚糖酶產(chǎn)量高達(dá)157757U/mL，表達(dá)水平是搖瓶發(fā)酵產(chǎn)量的約500倍，而α-Factor信號(hào)肽融合表達(dá)的重組菌Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn的產(chǎn)酶量明顯低于Fim-1/pUKD-Inu-xyn，酶活僅為76377U/mL，說明在馬克斯克魯維酵母表達(dá)宿主K.marxianusFim-1ura3Δ中，采用菊粉酶信號(hào)肽表達(dá)木聚糖酶的效率更高(圖5)．

圖5 重組菌株發(fā)酵過程的生長曲線和產(chǎn)酶曲線Fig.5 The cell growth and supernatant xylanase during the fermentation of the recombinant strains(a) 發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長曲線；(b) 木聚糖酶的產(chǎn)酶曲線.

發(fā)酵過程中的發(fā)酵液上清SDS-PAGE電泳檢測發(fā)現(xiàn)，兩種信號(hào)肽介導(dǎo)的分泌表達(dá)木聚糖酶的分子量存在明顯差異，α-Factor信號(hào)肽融合表達(dá)的木聚糖酶的蛋白大小分布在25～100kDa之間，其中大部分重組蛋白的分子量位于35～70kDa范圍內(nèi)，而菊粉酶信號(hào)肽融合表達(dá)的木聚糖酶的蛋白大小分布在25～170kDa之間，大部分重組蛋白的分子量位于55～170kDa之間(圖6)．

圖6 重組菌株高密度發(fā)酵的上清的SDS-PAGE檢測Fig.6 SDS-PAGE analysis of xylanase secretory expression during the high-density fermentation(a) Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn不同發(fā)酵時(shí)間的上清液；(b) Fim-1/pUKD-Inu-xyn不同發(fā)酵時(shí)間的上清液.

圖7 馬克斯克魯維酵母重組表達(dá)的木聚糖酶去N-糖基化分析Fig.7 Analysis for deglycosylation of the recombinant xylanase from K.marxianusM. PageRuler Prestained Protein Ladder；1. Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn發(fā)酵液上清；2. Fim-1/pUKD-Inu-xyn發(fā)酵液上清；3. 去糖基化酶Endo H處理后的Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn發(fā)酵液上清；4. 去糖基化酶Endo H處理后的Fim-1/pUKD-Inu-xyn發(fā)酵液上清．

通過在線軟件NetNGlyc對(duì)木聚糖酶的氨基酸序列N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶分子內(nèi)有兩個(gè)潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別位于37位和88位的天冬酰胺上．利用New England Biolabs公司的去糖基化酶EndoH，分別對(duì)Fim-1/pUKD-Inu-xyn和Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn重組表達(dá)的木聚糖酶蛋白進(jìn)行去糖基化處理．與未處理前的發(fā)酵液上清相比，兩株馬克斯克魯維酵母表達(dá)的重組蛋白上層彌散的蛋白條帶明顯減少，而25kDa大小的蛋白條帶明顯變濃(圖7)，并且該條帶大小與木聚糖酶理論分子量一致．去糖基化分析結(jié)果表明，重組木聚糖酶蛋白條帶出現(xiàn)彌散是由于不同程度的N-糖基化修飾引起的；此外，與α-Factor信號(hào)肽相比，菊粉酶信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白分泌過程糖基化程度較高．

3 討 論

在蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中，宿主菌的生長特性、蛋白翻譯后修飾機(jī)制、蛋白質(zhì)折疊與分泌途徑等對(duì)外源基因的分泌表達(dá)能力具有重要影響[26-27]．馬克斯克魯維酵母是真核生物中生長最快的生物，具有生物量高、生長快、耐高溫、可利用多種碳源等特性，因此在重組蛋白工業(yè)生產(chǎn)中具有非常廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景[28-31]．本研究利用新型的馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了耐溫木聚糖酶的高效表達(dá)，發(fā)酵72h產(chǎn)酶量達(dá)157757U/mL．在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，來源于Aspergillusniger、Aspergillususamii和Trichodermareesei木聚糖酶的重組表達(dá)水平分別是10035U/mL、58792U/mL和130000nkat/mL(約7800U/mL)[32-34]，因此，馬克斯克魯維酵母表達(dá)木聚糖酶的產(chǎn)量高、發(fā)酵周期短，在木聚糖酶的工業(yè)化生產(chǎn)中更有優(yōu)勢．

在酵母中表達(dá)外源蛋白時(shí)，分泌信號(hào)肽的選擇對(duì)于分泌蛋白表達(dá)水平和修飾至關(guān)重要．Murasugi等[35]比較了α-factor信號(hào)肽和PHO1信號(hào)肽引導(dǎo)人重組肝素結(jié)合細(xì)胞因子在畢赤酵母中的分泌效率，以α-factor信號(hào)肽的分泌效率更高，是PHO1信號(hào)肽的140倍．Pal[20]等利用α-factor信號(hào)肽在畢赤酵母中分泌表達(dá)hGM-CSF，也獲得了非常好的分泌效果．本研究以木聚糖酶為目的蛋白，構(gòu)建了木聚糖酶重組分泌表達(dá)載體，兩種信號(hào)肽切割的位點(diǎn)都是Lys-Arg，在分泌過程中被酵母細(xì)胞中的蛋白酶Kex2切除形成成熟的木聚糖酶蛋白．在本研究中，我們比較了釀酒酵母α-factor信號(hào)肽和克魯維酵母菊粉酶信號(hào)肽在馬克斯克魯維酵母中介導(dǎo)的分泌表達(dá)效果，發(fā)現(xiàn)兩種信號(hào)肽都能有效地將翻譯后的木聚糖酶蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外，但菊粉酶信號(hào)肽介導(dǎo)木聚糖酶的分泌表達(dá)量相對(duì)較高，由此說明在馬克斯克魯維酵母中，不同信號(hào)肽介導(dǎo)的蛋白分泌效率的差異，可能與信號(hào)肽自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)．此外，我們還發(fā)現(xiàn)不同的信號(hào)肽引導(dǎo)的目的蛋白翻譯后的糖基化修飾過程也存在明顯差異，菊粉酶信號(hào)肽介導(dǎo)木聚糖酶分泌表達(dá)過程的N-糖基化程度明顯高于α-factor信號(hào)肽，這種過度糖基化與重組蛋白的生物活性、蛋白分泌效率是否相關(guān)還需進(jìn)一步研究．因此，在表達(dá)外源蛋白時(shí)，對(duì)于分泌信號(hào)肽的偏好性不同，需要根據(jù)宿主菌自身的特性選擇合適的分泌信號(hào)肽．

[1] BEG Q K, KAPOOR M, MAHAJAN L,etal. Microbial xylanases and their industrial applications: A review [M].ApplMicrobiolBiotechnol, 2001,56(3/4): 326-338.

[2] 方洛云,鄒曉庭,許梓榮.木聚糖酶基因的分子生物學(xué)與基因工程 [J].畜禽業(yè),2002(02): 2-3.

[3] HENRISSAT B, BAIROCH A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities [J].BiochemJ, 1993,293(3): 781-788.

[4] POLIZELI M L, RIZZATTI A C, MONTI R,etal. Xylanases from fungi: Properties and industrial applications [J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2005,67(5): 577-591.

[5] SUBRAMANIYAN S, PREMA P. Application of probiotics in the dairy industry: The long way from traditional to novel functional foods [J].CritRevBiotechnol, 2002,22(1): 33-64.

[6] 慕娟,問清江,黨永,等.木聚糖酶的開發(fā)與應(yīng)用 [J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2012(1): 111-115.

[7] MOHANA S, SHAH A, DIVECHA J,etal. Xylanase production byBurkholderiasp. DMAX strain under solid state fermentation using distillery spent wash [J].BioresourTechnol, 2008,99(16): 7553-7564.

[8] BATTAN B, SHARMA J, DHIMAN S S,etal. Enhanced production of cellulasefree thermostable xylanase byBacilluspumilusASH and its potential application in paper industry [J].EnzymeMicrobTechnol, 2007,41(6/7): 733-739.

[9] POORNA C A, PREMA P. Production of cellulase-free endoxylanase from novel alkalophilic thermotolerantBacilluspumilusby solid-state fermentation and its application in wastepaper recycling [J].BioresourTechnol, 2007,98(3): 485-490.

[10] WANG S L, YEN Y H, SHIH I L,etal. Production of xylanases from rice bran byStreptomycesactuosusA-151 [J].EnzymeMicrobTechnol, 2003,33(7): 917-925.

[11] NINAWE S, KAPOOR M, KUHAD R C. Purification and characterization of extracellular xylanase fromStreptomycescyaneusSN32 [J].BioresourTechnol, 2008,99(5): 1252-1258.

[12] DOBREVA G T, PISHTIYSKI I G, STANCHEV V S,etal. Optimization of nutrient medium containing agricultural wastes for xylanase production byAspergillusnigerB03 using optimal composite experimental design [J].BioresourTechnol, 2007,98(14): 2671-2678.

[13] YAN Q J, WANG L, JIANG Z Q,etal. A xylosetolerant β-xylosidase fromPaecilomycesthermophila: Characterization and its co-action with the endogenous xylanase [J].BioresourTechnol, 2008,99(13): 5402-5410.

[14] AZIN M, MORAVEJ R, ZAREH D. Production of xylanase byTrichodermalongibrachiatumon a mixture of wheat bran and wheat straw: Optimization of culture condition by Taguchi method [J].EnzymeMicrobTechnol, 2007,40(4/5): 801-805.

[15] LI X T, JIANG Z Q, LI L T,etal. Characterization of a cellulase-free, neutral xylanase fromThermomyceslanuginosusCBS 288.54 and its biobleaching effect on wheat straw pulp [J].BioresourTechnol, 2005,96(12): 1370-1379.

[16] FONSECA G G, HEINZLE E, WITTMANN C,etal. The yeastKluyveromycesmarxianusand its biotechnological potential [J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology, 2008,79(3): 339-354.

[17] URIT T, L?SER C, WUNDERLICH M,etal. Formation of ethyl acetate byKluyveromycesmarxianuson whey: Studies of the ester stripping [J].BioprocessBiosystEng, 2011,34(5): 547-559.

[18] LANE M M, MORRISSEY J P.Kluyveromycesmarxianus: A yeast emerging from its sister’s shadow [J].FungalBiolRev, 2010,24(1/2): 17-26.

[19] RODICIO R, HEINISCH J J. Yeast on the milky way: Genetics, physiology and biotechnology ofKluyveromyceslactis[J].Yeast, 2013,30(5): 165-177.

[20] PAL Y, KHUSHOO A, MUKHERJEE K J. Process optimization of constitutive human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(hGM-CSF) expression inPichiapastorisfed-batch culture [J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2006,69(6): 650-657.

[21] GIBSON D G, YOUNG L, CHUANG R Y,etal. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases [J].NatureMethods, 2009,6,343-345.

[22] ADAMS A, GOTTSCHLING D E, KAISER C A,etal. Methods in yeast genetics: A cold spring harbor laboratory course manual [J].ColdSpringHarborLaboratoryCoursePress, 1994,8(24): 2939-3110.

[23] MILLER G L. Use of Dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar [J].AnalChem, 1959，31(3): 426-428.

[24] 王曉丹,郭麗瓊,趙力超,等.木聚糖酶酶活性測定方法及酶活性單位定義 [J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009(9): 128-131.

[25] YOU C, HUANG Q, XUE H,etal. Potential hydrophobic interaction between two cysteines in interior hydrophobic region improves thermostability of a family 11 xylanase fromNeocallimastixpatriciarum[J].BiotechBioeng, 2010,105(5): 861-870.

[26] DOHERTY A J, ASHFORD S R, BRANNIGAN J A. A superior host strain for the over-expression of cloned genes using the T7 promoter based vectors [J].NucleicAcidsRes, 1995,23(11): 2074-2075.

[27] CUDNA R E, DICKSON A J. Endoplasmic reticulum signaling as a determinant of recombinant protein expression [J].BiotechnologyandBioengineering, 2003,81(1): 56-65.

[28] WEN T, LIU F, HUO K,etal. Cloning and analysis of the inulinase gene fromKluyveromycescicerisporusCBS4857 [J].WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology, 2003,19(4): 423-426.

[29] ZHANG J, YUAN H, WEN T,etal. Cloning of theKcURA3 gene and development of a transformation system forKluyveromycescicerisporus[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2003,62(4): 387-391.

[30] KONDO K, MIURA Y, SONE H. High-level expression of a sweet protein, monellin, in the food yeastCandidautilis[J].NatBiotechnol, 1997,15(5): 453-457.

[31] CAI X P, ZHANG J, YUAN H Y,etal. Secretory expression of heterologous protein inKluyveromycescicerisporus[J].ApplMicrobiolBiotechnol, 2005,67(3): 364-369.

[32] WANG J, LI Y, LIU D. Improved production ofAspergillususamiiendo-β-1,4-Xylanase inPichiapastorisvia combined strategies [J].BiomedResInt, 2016,2016(2): 1-9.

[33] LI Y Y, ZHAONG K X, HU A H,etal. High-level expression and characterization of a thermostable xylanase mutant fromTrichodermareeseiinPichiapastoris[J].ProteinExprPurif, 2015,108: 90-96.

[34] FANG W, GAO H, CAO Y,etal. Cloning and expression of a xylanase xynB fromAspergillusnigerIA-001 inPichiapastoris[J].JBasicMicrobiol, 2014,54: 190-199.

[35] MURASUGI A, TOHMA-AIBA Y. Comparison of three signals for secretory expression of recombinant human midkine inPichiapastoris[J].BiosciBiotechnolBiochem, 2001,65(10): 2291-2293.

EffectofSignalPeptideonSecretoryExpressionofXylanaseinKluyveromycesmarxianus

WUYue1,2,ZHOUJungang1,2,LüHong1,2

(1.StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,SchoolofLifeSciences,FudanUniversity,Shanghai, 200438,China;2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai, 200438,China)

As a new type of non-conventional yeast,Kluyveromycesmarxianusis the fastest growing eukaryote with strong secretion and high safety. In yeast, secretory signal peptide plays an important role in mediating the heterologous proteins into the post-translational modifications, such as glycosylation, which is important for the synthesis of correctly folded and active form, and also to secrete them. In this study, we employed two secretory signal peptides, including α-Factor signal peptide fromSaccharomycescerevisiaeand inulinase signal peptide fromK.marxianus, to compare the secretion efficiency of the thermostable xylanase. The xylanase activity in the supernatant produced by the recombinant strains Fim-1/pUKD-Inu-xyn and Fim-1/pUKD-α-Factor-xyn was 318.91 U/mL and 117.90 U/mL, respectively, indicating that the secretion efficiency of inulinase signal peptide was higher than that of α-factor signal peptide. The optimum pH and temperature of xylanase was pH 5.5 and 65℃, respectively, and incubated at 75℃ for 1h, the residual activity was more than 73%. In a 5L fermentor, the expression level of xylanase reached 157757U/mL. Our results showed that theK.marxianusexpression system has a very broad application prospect in industrial enzyme field.

xylanase;Kluyveromycesmarxianus; signal peptide; high expression

0427-7104(2017)04-0446-09

2016-11-21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102803B，2014AA093511)；上海市科委基地項(xiàng)目(13DZ2252000)

吳 玥(1991—)，女，碩士研究生；呂 紅，女，教授，通信聯(lián)系人，E-mail： honglv@fudan.edu.cn.

Q36，Q814

A