杜忠偉，胡志強(qiáng)，亢學(xué)平，王旭，李健，王鑫

(延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延邊 133000)

一種羊肚菌的菌種分離和母種培養(yǎng)基篩選

杜忠偉，胡志強(qiáng)，亢學(xué)平，王旭，李健，王鑫*

(延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延邊 133000)

對采自延邊地區(qū)的一種羊肚菌子實體，通過組織分離幼時和成熟的子實體不同部位(子囊盤、子囊盤和菌柄連接部、菌柄部)獲得菌種，制作4種(PDA，黃豆粉，玉米粉，黃豆芽)培養(yǎng)基配方，對菌絲體生長情況(萌發(fā)時間、顏色、菌絲長勢)進(jìn)行觀察記錄，結(jié)果得出：幼時子囊盤和菌柄連接部位分離成活率最高；黃豆芽培養(yǎng)基適宜做該羊肚菌菌株母種培養(yǎng)基。

羊肚菌;組織分離;菌絲體;培養(yǎng)基

羊肚菌屬(MorchellaDill.ex Fr)，屬于子囊菌門、盤菌綱、盤菌目、羊肚菌科。該屬的特點是子囊盤如海綿狀或羊肚狀，子實層沿子囊盤蓋的下陷部分生長，所有羊肚菌都是食用菌而且味道鮮美[1]。對于羊肚菌分多少種爭論不一，在《真菌詞典》第 10 版中也將其劃分為28個種[2]。羊肚菌營養(yǎng)價值高，作為珍惜的食藥用菌具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和研究價值。羊肚菌性平、味甘寒，無毒，具有幫助消化、化痰理氣、補(bǔ)腎壯陽及補(bǔ)腦提神等功效,是一味良好的傳統(tǒng)中藥[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究又表明,羊肚菌能增強(qiáng)人體免疫力、抗輻射、抗腫瘤、抗疲勞,并且能夠減輕癌癥患者放療、化療引起的毒副作用[4]。近幾年隨著人工栽培羊肚菌的成功，形成了全國的羊肚菌熱潮，在帶來利益的同時也給很多栽培戶帶來巨大損失。追其原因有菌種的成活率不穩(wěn)定，栽培技術(shù)不規(guī)范，盲目跟風(fēng)，因此進(jìn)一步對羊肚菌的分類、生活史、繁殖機(jī)理等問題和針對不同地域不同種類的羊肚菌的最適培養(yǎng)基和栽培技術(shù)進(jìn)行研究是未來羊肚菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。本文對采自吉林延邊地區(qū)的羊肚菌進(jìn)行菌種的分離和培養(yǎng)基篩選試驗，為進(jìn)一步開展馴化栽培試驗做準(zhǔn)備。

1 材料方法

1.1 研究材料

1.1.1 研究標(biāo)本。標(biāo)本：采自延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)房檐下雜草地中，分別采集到幼時和成熟后的兩種形態(tài)的子實體。采集時間：2017年5月18日，標(biāo)本保存在延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所標(biāo)本室，標(biāo)本編號YDJ01和YDJ02。

1.1.2 母種培養(yǎng)基配方。選用4種常用的培養(yǎng)基配方進(jìn)行測定，將其編號為A、B、C、D。

A: 馬鈴薯200g(去皮煮汁)、葡糖糖20g、瓊脂20g、KH2PO41.5g、MgSO43g、水1000mL。

B：黃豆粉5g、麩皮10g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL。

C：玉米粉5g、麩皮10g、葡萄糖20g、瓊脂20g、水1000mL。

D：黃豆芽500g(去皮煮汁)、葡萄糖20g、瓊脂20g、KH2PO41.5g、MgSO43g、水1000mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種分離試驗。將采集的幼時和成熟的羊肚菌子實體組織分離獲得的菌株編號為為YDJ-1和YDJ-2，對兩個時期的羊肚菌的子囊盤、子囊盤和菌柄連接處、菌柄部位進(jìn)行組織分離方法獲得菌株。采集的標(biāo)本放入超凈工作臺，用75%酒精擦拭子實體表面，用紫外燈對周圍環(huán)境消毒30min，接種于事先準(zhǔn)備好的PDA試管斜面培養(yǎng)基中，標(biāo)記后放入恒溫培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)定為25℃，定期觀察記錄成活率，污染率，每種方法重復(fù)5次。

1.2.2 培養(yǎng)基對比試驗。將獲得羊肚菌母種進(jìn)行提純培養(yǎng)獲得純種，按照4種培養(yǎng)基配方制作好培養(yǎng)基放入編號為1、2、3、4的三角瓶中，然后將三角瓶和事先包好的培養(yǎng)皿(直徑9cm)放入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌(121℃，30min)，滅菌后平板培養(yǎng)皿和4種培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中，紫外線消毒殺菌20min，放置冷卻，制作成平板培養(yǎng)基放置兩天，經(jīng)無菌操作將羊肚菌菌種分別接種4種不同培養(yǎng)基中，編號后放入在25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期觀察菌絲生長狀況，記錄菌絲密度、色澤、邊緣整齊度、長勢，每個處理重復(fù)10次；顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)和顏色并記錄。

表1 羊肚菌不同時期不同部位對組織成活的影響

注：+代表菌絲稀疏，長勢不好，++代表較濃密，長勢較好，+++代表濃密，長勢好。

圖1 組織分離獲得的部分試管菌種注：圖a為子實體獲組織分離獲得的菌種，b為提純后的菌種；試管培養(yǎng)基內(nèi)顆粒物為菌核。

2 結(jié)果分析

2.1 不同分離部位對組織成活的影響

研究發(fā)現(xiàn)不同分離部位菌絲萌發(fā)和菌絲長勢不同，但均可生長，子囊盤和菌柄部連接處及菌柄部成活率較高。幼時分離的成活率比成熟后高，污染率低。研究發(fā)現(xiàn)利用羊肚菌子實體分離菌種易感染細(xì)菌，但通過培養(yǎng)一段時間發(fā)現(xiàn)，如果小部分感染細(xì)菌的羊肚菌菌絲仍然可以生長，說明羊肚菌的抗雜菌能力強(qiáng)。培養(yǎng)獲得的菌絲絨毛狀，易產(chǎn)生氣生菌絲，菌絲顏色由白色變成淺棕色后期成褐色，隨著培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌絲形成深棕色顆粒狀的菌核。通過顯微鏡對培養(yǎng)獲得菌絲進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，菌絲為有隔菌絲，透明，無色至棕色，在菌絲的兩側(cè)會形成分枝狀的突起，菌絲之間交錯鏈接構(gòu)成一個復(fù)合的整體。羊肚菌不同分離部位分離對組織成活的影響見表1，分離獲得的菌種如圖1。

2.2 四種培養(yǎng)基對比結(jié)果

羊肚菌菌絲在4種配方的培養(yǎng)基中均能生長，在黃豆芽培養(yǎng)基中菌絲長勢最好，菌絲濃密，菌落絨毛狀邊緣，白色至淡褐色，生長快；其次為PDA培養(yǎng)基，菌絲較濃密，菌落絨毛狀邊緣，白色至淡褐色，生長最快；玉米粉培養(yǎng)基菌絲緊貼培養(yǎng)基生長，稀疏，菌落形態(tài)不明顯，生長較快；黃豆粉培養(yǎng)基，菌絲弱，稀疏，菌落形態(tài)不明顯，生長慢。不同培養(yǎng)基中菌落形態(tài)照片見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)基下的菌落形態(tài)圖注：1號圖為培養(yǎng)第4天的菌落形態(tài)，2號圖為培養(yǎng)至7天后的菌落形態(tài)，此時菌落已經(jīng)長滿平板培養(yǎng)皿，其中PDA培養(yǎng)基內(nèi)氣生菌絲較多，顏色較深，有菌核產(chǎn)生，黃豆芽培養(yǎng)基菌絲濃密，無菌核產(chǎn)生，菌絲活力旺盛，黃豆粉培養(yǎng)基菌絲稀疏，顏色淺，無菌核產(chǎn)生，玉米粉培養(yǎng)基菌絲稀疏，活力弱。

3 總結(jié)

通過對采集的羊肚菌子實體進(jìn)行組織分離、培養(yǎng)，得出子囊盤、子囊盤和菌柄鏈接部、菌柄部分離均能生長，但成活率有差異；同一種菌株在不同的培養(yǎng)基中形成的菌落形態(tài)，菌絲長勢不同，黃豆芽培養(yǎng)基最適合羊肚菌菌絲生長，其次為PDA培養(yǎng)基。通過對采集的羊肚菌進(jìn)行菌種分離和母種培養(yǎng)基篩選試驗，獲得菌種為下一步的馴化栽培試驗奠定基礎(chǔ)。

[1]戴玉成，楊祝良.中國藥用真菌名錄及部分名稱的修訂[J].菌物學(xué)報,2008,27：801-824 .

[2]P.M. Kirk,P.F. Cannon,D.W. Minter et al. Dictionary of the fungi(10th ed.)[M].UK:CABI,2008.

[3]孫曉明，張衛(wèi)明，吳素玲,等.羊肚菌抗疲勞作用研[J].中國野生植物資源，2001， 20(1):12-13,17-18.

[4]邢增濤,孫芳芳,劉景圣.尖頂羊肚菌液體培養(yǎng)條件的研究[J].食用菌學(xué)報，2004， 11(4):38-43.

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.006

S646.7

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