王欣宇，車成來，林花，王霞，王宇輝，玄東哲，金龍哲

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001)

長白山有機靈芝提取物對小鼠細(xì)胞免疫力功能作用的研究

王欣宇，車成來，林花，王霞，王宇輝，玄東哲，金龍哲*

(延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，吉林 延吉 133001)

研究長白山地區(qū)靈芝提取物對小鼠細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)作用的影響。實驗以4個劑量組經(jīng)口灌胃，將小鼠隨機分為高、中、低3進行灌胃，空白組以等量蒸餾水處理，給小鼠連續(xù)給藥30d，對小鼠進行細(xì)胞免疫功能調(diào)節(jié)的測定。結(jié)果表明，長白山有機靈芝提取物具有提高免疫力功能的作用。

長白山地區(qū)；有機靈芝；免疫功能

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料與劑量選擇

樣品由延邊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)特產(chǎn)品加工研究所提供。昆明種雄性小鼠由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，合格證號為SCXK-(吉)2013-0001。成人劑量以60kg體質(zhì)量攝入1.2g/60kg·bw·d，相當(dāng)于人體攝入劑量的1、10和30倍，即0.02、0.2、0.6g/kg·bw·d，各劑量組以蒸餾水稀釋。以蒸餾水為空白對照組，每組12只，每只小鼠灌胃量為0.2mL/10g·bw·d，灌胃30d，并測定其各項免疫指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1 臟器/體重比值測定。將小鼠處死后，取脾臟和胸腺后稱重，分別計算其脾臟/體重比值以及胸腺/體重比值。

1.2.2 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(足跖增厚法DTH)。生理鹽水洗滌羊血洗滌3次，腹腔免疫用2%(V/V)SRBC進行腹腔注射，每只注射免疫0.2mL(相當(dāng)于1×108個SRBC)，待免疫4d時測量小鼠左后足跖的厚度，在測量足跖部位處皮下注射20%SRBC，每只小鼠注射20μL，24h后繼續(xù)測量其左后足跖的厚度，測量3次，取平均值。

1.2.3 ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗(MTT法)。將取無菌Hank’s液的小平皿，將脾置于其中，磨碎后制成單個細(xì)胞懸液。放于Hank’s液洗滌2次，離心，將細(xì)胞置于完全培養(yǎng)液(1mL)使其懸浮，臺酚蘭染色，計算活細(xì)胞數(shù)，將其濃度調(diào)至為3×108個/mL。每個細(xì)胞懸液分為兩個孔，每孔1mL加入24孔板中，一組作為對照組，一孔加75μL ConA液，放于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。在培養(yǎng)68h時，將每孔輕輕吸去0.7mL的上清液，并加入吸去相同量的RPMI 1640培養(yǎng)液(不含小牛血清)，同時每孔加入50μL 5mg/mL的MTT，培養(yǎng)4h。當(dāng)培養(yǎng)完畢，加入1mL酸性異丙醇，使紫色潔凈溶解至完全溶解后，導(dǎo)入2mL比色杯中，測OD值。

1.2.4 小鼠碳廓清實驗。小鼠進行尾靜脈注射印度墨汁(1∶4倍稀釋)，注射后立刻計時。當(dāng)注射2、10min時，在內(nèi)眥靜脈叢中取血20μL，并置于2mL的0.1%Na2CO3溶液中。測OD值，以Na2CO3溶液作為空白組。

1.2.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞實驗。2000r/min離心壓積雞紅細(xì)胞10min，小鼠腹腔注射20%懸液1mL，30min后將小鼠處死，取其體內(nèi)巨噬細(xì)胞洗液1mL，滴至墊有濕紗布的載玻片上，放于盒內(nèi)并移至孵箱37 ℃溫育20min。孵畢，用生理鹽水洗凈未貼片細(xì)胞。待晾干后，甲醇固定，4%(V/V)Giemsa-磷酸緩沖液染色，生理鹽水洗凈，晾干備用。油鏡下按照每片100個巨噬細(xì)胞計數(shù)，吞噬百分率或吞噬指數(shù)代表小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬能力。

1.2.6 NK細(xì)胞活性測定(乳酸脫氫酶LDH測定法)。取靶細(xì)胞、效應(yīng)細(xì)胞各100μL，分別加入96孔板中，向靶細(xì)胞釋放孔分別加100μL的靶細(xì)胞和100μL的培養(yǎng)液，靶細(xì)胞最大釋放孔分別加入100μL靶細(xì)胞、1%NP40，分別設(shè)有3個平行孔，于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃ 培養(yǎng)4h，離心，每孔吸取100μL的上清液，待反應(yīng)10min后，向每孔加入30μL 的1molHCl溶液，使其反應(yīng)終止，測OD值，計算NK活性。

2 結(jié)果

表1 受試樣品對小鼠臟器/體重比值的影響

表2 受試樣品對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(DTH)的影響

表3 受試樣品對ConA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

表4 受試樣品對小鼠單核-巨噬細(xì)胞碳廓清作用的影響

表5 受試樣品對小鼠巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞能力的影響

按不同劑量連續(xù)給予小鼠受試樣品長白山有機靈芝提取物30d，經(jīng)統(tǒng)計分析，小鼠臟器/體重比值、淋巴細(xì)胞的增殖能力、碳廓清功能、吞噬率、吞噬指數(shù)在0.02、0.2、0.6g/kg組與空白組比較均無顯著性差異(P>0.05)，足跖腫脹度在中、高劑量組均高于空白組，且相比較有顯著性差異(P<0.05)(見表1，2，3，4，5，6)。

表6 受試樣品對小鼠NK細(xì)胞活性的影響

3 討論

現(xiàn)代研究表明，通過提高宿主免疫功能實驗發(fā)現(xiàn)，靈芝具有抗腫瘤作用[1-2]、增強抗病毒效果、且提高氧化酶活性使體內(nèi)自由基清除起到抗衰老作用、降血脂等[3]在醫(yī)學(xué)中起到極其重要的作用。本文以長白山地區(qū)特有的冷涼氣候條件下栽培的有機靈芝為原料，探究長白山有機靈芝提取物對小鼠細(xì)胞免疫功能的調(diào)節(jié)作用。長白山有機靈芝提取物給予小鼠30d后進行觀察，對小鼠各臟器/體重比值無差異，說明藥物對小鼠無影響，在遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗中，小鼠的足跖腫脹度在0.2、0.6g/kg組呈陽性，有明顯增強小鼠的遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，研究表明上述實驗結(jié)果與給藥劑量有關(guān)；在動物給藥期間，各劑量組藥物均明顯高于空白組藥物，說明其具有提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腹腔巨噬細(xì)胞吞噬雞紅細(xì)胞、促進單核-巨噬細(xì)胞碳廓清的能力，顯著提高NK細(xì)胞抗瘤活性，說明長白山有機靈芝提取物可刺激人單核巨噬細(xì)胞，直接或間接激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞，抑制嗜中性粒細(xì)胞自發(fā)性凋亡，使細(xì)胞因子有序生長。實驗表明，受試樣品可增強特異性和非特異性細(xì)胞免疫功能，具有提高免疫力功效的作用。根據(jù)《保健食品功能學(xué)評價程序與檢驗方法規(guī)范》，長白山有機靈芝提取物具有增強免疫力功能的作用。

[1]鄧海林,吳佩穎,王建新. 靈芝的研究進展[J]. 時珍國醫(yī)國藥,2005,16(2): 141-143.

[2]林志彬. 靈芝抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展[J]. 北京大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版,2002,34(5): 493-498.

[3]You YH,Lin ZB. Protective effects of Ganoderma lucidum polysaccharides peptide on injury of macrophages induced by reactive oxygen species[J]. Acta Pharmacol Sinica,2002,23(9): 787-791.

2017-09-19

*通訊作者：金龍哲(1965-)，男，副研究員，研究方向：農(nóng)特產(chǎn)品加工，E-mail:664130853@qq.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.016

S567.3+1

A