馮章麗，劉暢，顧廣軍，程顯敏，劉延杰，卜海東，于文全

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041)

SSR分子標記在梨遺傳育種研究中的應用

馮章麗，劉暢，顧廣軍，程顯敏，劉延杰，卜海東，于文全*

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157041)

對SSR分子標記在梨的品種鑒定，種質(zhì)資源評價，重要農(nóng)藝性狀的基因定位以及分子標記輔助選擇育種等4個方面的研究應用進展進行了綜述，并對當前SSR標記在梨研究中存在的主要問題和應用前景進行了分析，旨在為開展梨分子遺傳育種提供參考。

SSR；梨；遺傳育種；應用

梨屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)梨屬 (Pyrus) 多年生果樹。我國梨屬于東方梨(Oriental pears or Asian pears)種群，包含有13個種，是世界梨屬植物最主要的起源地之一，有著豐富的梨屬資源[1-2]。為了更好的利用和評價梨屬資源，多年來研究者們采用形態(tài)學，細胞學和同工酶標記等方法對我國梨屬植物在分類學，親緣關(guān)系以及品種選育研究等方面進行了研究，并取得了階段性的進展。近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，利用分子標記技術(shù)為梨屬植物的系統(tǒng)關(guān)系和品種親緣關(guān)系的研究提供了新的手段。至今為止，前人已經(jīng)利用了SSR[3-7]，ISSR[8-9]，RFLP[10]，RAPD[11]，SRAP[12]以及AFLP[4,13]等分子標記對梨資源開展了相關(guān)研究。SSR標記作為最常用的分子標記之一，由于其具有數(shù)量多，共顯性，重復性好以及易操作等優(yōu)點受到眾多研究者的青睞。目前，SSR標記已廣泛應用在梨資源的品種資源鑒定，遺傳基礎(chǔ)評價，重要農(nóng)藝性狀的基因定位以及分子輔助育種等多個方面，但由于SSR標記技術(shù)在梨屬資源中的研究應用起步較晚，相關(guān)研究有待于更深入的開展和豐富完善。基于此，本文總結(jié)了近年來利用SSR標記技術(shù)在梨資源研究中的應用及相關(guān)研究進展，旨在為更好的利用SSR標記進行梨品種的遺傳育種研究提供參考。

1 SSR分子標記

1.1 SSR分子標記原理

SSR(簡單重復序列，simple sequence repeats)分子標記又稱微衛(wèi)星標記，由Moore等于1991年創(chuàng)立，是當今生物學研究中最常用的分子標記之一[14]。通常，SSR標記是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復序列。SSR標記的原理是基于基因組中某一特定的微衛(wèi)星的側(cè)翼序列通常都是保守性較強的單一序列，而微衛(wèi)星中重復單位的數(shù)量又存在高度變異，因而可以將微衛(wèi)星側(cè)翼的DNA片段進行克隆和測序，再根據(jù)微衛(wèi)星的側(cè)翼序列人工設計合成引物，最終實現(xiàn)對微衛(wèi)星重復單位進行PCR擴增，擴增檢測出存在差異的微衛(wèi)星位點。由于個體的擴增產(chǎn)物在長度上的變化而產(chǎn)生堿基長度的多態(tài)性，這就是簡單序列重復長度多態(tài)性，即所謂的SSR擴增多態(tài)性。

1.2 SSR標記特點

研究發(fā)現(xiàn)，SSR標記廣泛隨機的分布于真核生物中，大約每隔10～50 kb就有1個SSR[15]。與其它分子標記相比，SSR標記具有這樣的幾個特點：(1)SSR標記在全基因組上具有數(shù)量豐富，覆蓋廣；(2)SSR標記具有多等位基因的特性，多態(tài)性高，提供的信息量高；(3)SSR標記是以孟德爾方式遺傳，呈共顯性，可有效鑒別出基因的純/雜合位點；(4)SSR每個位點由設計的引物順序決定，其重演性好，操作簡單，費用低；(5)SSR位點兩側(cè)的序列高度保守，設計合成的SSR引物通用性高；(6)SSR標記對DNA的要求不高，需要的DNA量少，易于進行PCR檢測，且適合于開展高通量分析[16-17]。

2 SSR分子標記在梨品種鑒定中的應用

由于SSR標記是呈共顯性標記，利用SSR標記檢測親本材料間位點的差異，就可以有效的將親本與雜交種區(qū)分開。同時，基于SSR標記具有多態(tài)性高，重演性好以及易于操作檢測等優(yōu)點，已被公認為是植物新品種保護最廣泛應用的標記體系，目前已經(jīng)廣泛用于DNA指紋圖譜的構(gòu)建中[18]。至今為止，SSR技術(shù)已在梨品種資源鑒定中得到了大量的應用。

Sawamura等[19]利用S-RNase等位基因和18個SSR標記對55份日本梨材料成功進行了親本后代血緣關(guān)系鑒定。Kimura等[20]利用9個SSR標記鑒別6個種60個亞洲梨，研究表明其中7個SSR標記能將58個品種區(qū)分開。Yamamoto等[21]利用蘋果SSR標記鑒定包括19個日本梨，7個中國梨，5個歐洲梨，3個野生品種以及2個雜交品種的36個梨品種資源。結(jié)果表明，參試材料除突變體外，均可在檢測到的79個等位基因位點上相互鑒別開來。此外，在構(gòu)建梨指紋圖譜方面，薛華柏等[7]利用SSR特征指紋數(shù)據(jù)，構(gòu)建了29個梨品種SSR特征指紋數(shù)據(jù)表，它可以直觀有效的對品質(zhì)進行區(qū)分鑒定。張靖國等[22]以20個梨栽培品種為例，利用SSR標記構(gòu)建梨分子身份證體系，根據(jù)引物對不同品種擴增條帶大小進行編碼，然后將每個品種17個SSR位點的賦值依次組合，建立了20個梨栽培品種的分子身份證。高源等[23]利用10對SSR熒光標記引物，構(gòu)建了中國建國后選育的92個梨品種的指紋圖譜，選擇2～3對引物就可以區(qū)別不同品種。由此可見，SSR標記用于梨屬資源鑒定，具有多態(tài)性高，分辨能力強的特點，在今后開展梨品種資源保護和指紋圖譜構(gòu)建中具有重要的應用價值。

3 SSR分子標記在梨遺傳多樣性評價中的應用

遺傳多樣性是種質(zhì)資源評價的重要指標，前人利用SSR分子標記對梨屬資源的遺傳多樣性進行了相關(guān)研究。曹玉芬等[3]利用SSR技術(shù)對梨 41個栽培品種進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，12對 SSR引物擴增出 114個等位基因，平均每個位點9.5個，位點雜合度在 0.1517～0.7079之間，遺傳多樣性指數(shù)為0.4630。蔡丹英等[4]采用10對蘋果和3對梨上的SSR引物對來自溫嶺和麗水的18個地方梨品種類型進行了鑒定分析，結(jié)果表13對SSR引物的觀察雜和度(He)為0.056～0.944，平均值為0.57，而香農(nóng)指數(shù)(I)的范圍0.340～2.013，平均值為 1.22。劉清文等[24]利用覆蓋梨全基因組的134個SSR標記對45份西洋梨品種資源進行遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)分析，共檢測到673個等位基因，每個SSR位點平均擴增5.02個，45份參試西洋梨品種的觀測等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)以及Shannon信息指數(shù)(I)平均值分別為5.02、3.84、0.73、0.72和1.42。在梨屬資源的親緣關(guān)系鑒定上，曹玉芬等[3]利用系統(tǒng)聚類分析將41個參試梨品種分為西洋梨和東方梨兩大類。張東等[25]利用SSR標記技術(shù)對29個砂梨品種的親緣關(guān)系進行了分析，并進一步通過聚類分析將29個砂梨品種分成4個組。Teng等[26]研究表明，中國長江流域的野生砂梨可能是中國砂梨和日本梨系統(tǒng)的共同祖先。Cao等[27]和Tian等[28]對亞洲梨進行SSR標記分析，認為原產(chǎn)中國的白梨，砂梨品種和日本砂梨品種相互交錯，并且一些日本梨與中國砂梨親和力較高，表明中國砂梨和日本梨具有很近的親緣關(guān)系。此外，SSR標記已經(jīng)利用到梨核心種質(zhì)資源圃的構(gòu)建中，這對于梨屬資源的收集保存也具有重要意義。卜海東等[29]利用梨資源的表型性狀和 SSR分子標記相結(jié)合的方式，對寒地果樹資源圃的201份梨資源進行核心種質(zhì)構(gòu)建研究，確定了36份資源為該圃的核心種質(zhì)資源，為寒地梨育種資源多樣性保護奠定了提供了保障。

4 SSR分子標記在梨重要農(nóng)藝性狀的基因定位中的應用

至今為止，SSR標記已經(jīng)廣泛應用與梨資源的遺傳圖譜構(gòu)建和基因定位研究中。前人已經(jīng)利用不同的材料構(gòu)建了多張梨分子遺傳圖譜，這為梨資源的重要數(shù)量性狀基因定位奠定了基礎(chǔ)。Yamamoto等[30]在2002年利用SSR分子標記構(gòu)建了63株Bartlett×Hosui雜交F1的分子遺傳圖譜。韓明麗等[31]利用八月紅梨和碭山酥梨雜交得到的F1代實生苗為作圖群體構(gòu)建了一張包含有63個SSR標記的分子遺傳圖譜。崔海榮[32]通過開發(fā)砂梨的SSR標記，結(jié)合EST-SSR和RAPD兩種標記，構(gòu)建了砂梨“西子紅/喜水”F1群體的遺傳連鎖圖譜，并利用BSA法篩選出控制砂梨褐皮性狀的分子標記CH05902，最終確定該標記與控制褐色性狀位點的遺傳距離是4.6cM。田義軻等[33]以矮化梨與茌梨的F1 雜交分離群體為材料，利用BSA法，通過對40對SSR引物的篩選，獲得了一個與PcDw基因連鎖距離為9.3cM 的SSR標記KA14210，由此將該基因定位到了梨品種‘Barlett’遺傳圖譜的第16連鎖群上。Wang等[34]在第16連鎖群上的51對SSR引物中篩選到一個與PcDw基因連鎖距離僅0.9 cM 的SSR標記TsuENH022。宋偉等[35]以梨品種“黃金”和“碭山酥”的F1代雜交分離群體為試材，用分離群體分組分析法，獲得了與梨果實褐皮性狀相連鎖的SSR 標記CH01c06 和Hi20b03，遺傳連鎖距離分別為4. 8 cM 和12. 0 cM。劉金義等[36]利用225對源自梨和蘋果基因組的SSR引物，結(jié)合分離群體分離分析法和選擇基因型分析法，對酸/低酸性狀進行群體分離分析，結(jié)果表明，標記KU10 與果實酸/低酸性狀連鎖，遺傳距離為12.15cM，并由此將果實酸/低酸性狀的QTL 初步定位到梨遺傳圖譜的第2 連鎖群上。Pierantoni 等[37]利用AFLP 和SSR標記采用區(qū)間作圖法進行了梨黑星病抗性QTL分析和定位，共檢測到3個梨黑星病抗性QTL位點，定位在母本圖譜的第3和第7連鎖群上，其最高貢獻率高達87.1%。Wu 等[38]利用SNP和SSR標記對梨果實性狀進行QTL定位分析，共發(fā)現(xiàn)與花梗長度、單果重、果實縱徑、橫徑和可溶固形物5個性狀相關(guān)的14個QTL位點，分布在第 2、3、5、10、11、13、14 和 17 連鎖群，其貢獻率范圍為14%～30%。

5 SSR分子標記在梨分子標記輔助選擇育種中的應用

分子標記輔助選擇育種是將現(xiàn)代分子生物學與傳統(tǒng)遺傳育種學有機的結(jié)合起來，從而提高選擇效率和準確性，縮短育種年限，實現(xiàn)產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等綜合性狀的高效改良。劉金義等[36]定位了一個SSR標記KU10與果實酸/低酸性狀連鎖，為進一步開展梨果實酸/低酸性狀分子輔助育種奠定了基礎(chǔ)。宋偉等[39]利用“矮化梨”×(“茌梨”+“新高梨”)的F1代分離群體供試材料，通過對281對分別源自蘋果和梨基因組的SSR引物的BSA 篩選與群體分析，獲得了與梨果實形狀相關(guān)的SSR標記CH02b10 和CH02f06，其對圓形/非圓形性狀判斷的符合率分別為91. 67% 和96. 67%。此外，Evans 等[40]在梨第17連鎖群上發(fā)現(xiàn)了2 個與梨棉蚜抗性基因緊密連鎖的SSR標記NH006b 和NH014a，利用此標記可進行梨棉蚜抗性檢測。2011年，Wang等[34]篩選到一個SSR 標記TsuENH022，它與PcDw基因連鎖距離僅0.9 cM，這也是到目前為止與梨所有農(nóng)藝性狀基因遺傳距離最近的標記，可以用來進行梨矮化性狀的標記輔助選擇育種。目前，雖然SSR已應用于梨的輔助選擇育種研究，但由于現(xiàn)有的與目標性狀緊密連鎖的遺傳標記很少，所以有待于開發(fā)合成新的SSR標記，構(gòu)建新的高密度遺傳圖譜，定位出距離各連鎖群更近的基因，以提高標記選擇的高效性和準確性。

6 SSR分子標記在梨研究中存在的問題及應用前景分析

由于梨樹為多年生植物，且基因型高度雜合，遺傳背景十分復雜，這些均給梨育種研究帶來困難。傳統(tǒng)育種往往根據(jù)表型選擇，盲目性較大，利用SSR分子標記技術(shù)能夠從DNA水平上有效的進行闡述，是梨輔助遺傳育種研究的有力手段，能夠大大加快梨育種進程，提高品種選育效率。目前來看，SSR標記在梨研究中主要存在這樣的3個方面的問題：(1)由于SSR標記在梨研究中的應用起步較晚，盡管當前已經(jīng)構(gòu)建了許多梨資源的分子遺傳圖譜，但真正可以應用于分子輔助育種的卻很少。(2)從梨屬植物基因組中開發(fā)出的SSR引物較少，檢測的SSR位點數(shù)不足，尚未完全覆蓋整個梨的基因組，且許多SSR引物的檢測效果不好。據(jù)文獻報道，目前超過500對引物能用于梨上，主要有梨的240對，蘋果的200對以及桃和甜櫻桃的65對，但利用頻率高，且效果的好的SSR引物有62對[41](表1)。(3)SSR標記單獨無法準確有效的區(qū)分芽變品種和原品種。

表1 62對梨高效SSR引物

近年來，隨著分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展，梨分子標記的研究已取得實質(zhì)性進展。相信未來會有越來越多的梨SSR分子標記被開發(fā)和利用起來，這必將進一步促進梨遺傳圖譜的構(gòu)建和重要農(nóng)藝性狀基因的定位和克隆，最終為實現(xiàn)梨分子標記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

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ApplicationofSSRMolecularMarkerinPearGeneticsandBreedingResearch

Feng Zhangli,Liu Chang,Gu Guangjun,Cheng Xianmin,Liu Yanjie,Bu Haidong,Yu Wenquan

(Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Mudanjiang,Heilongjiang 157041)

We summarized the application of SSR molecular markers in pear cultivars,including identification of pear variety,diversity of germplasm resources evaluation,gene mapping of important agronomic traits and marker-assisted selection breeding four aspects,and further analyzed the current main problems of SSR markers research and application prospects in the pear. The aim is to provide references for developing pear molecular genetic breeding in future.

SSR; Pear;Genetics and breeding; Application

2017-06-09

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金(CARS-28)

馮章麗(1984-)，女，助理研究員，碩士，主要從事寒地果樹育種研究，E-mail：ffzzl-0319@163.com;*通訊作者：于文全。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.032

S661.2

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