代錦繡，董軒名，倪歡歡，董延龍，金曉霞*

(1.哈爾濱師范大學(xué)，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069)

牽牛E3泛素連接酶PNRma1基因的克隆及抗旱相關(guān)性分析

代錦繡1，董軒名1，倪歡歡1，董延龍2，金曉霞1*

(1.哈爾濱師范大學(xué)，哈爾濱 150025；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝分院，哈爾濱 150069)

為研究牽牛E3泛素連接酶對其干旱脅迫的響應(yīng)情況，利用RT-PCR技術(shù)從牽牛中克隆得到1個E3泛素蛋白連接酶基因PNRma1的cDNA全長序列，其序列長度為734 bp，編碼244個氨基酸。對牽牛PNRma1蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明該蛋白主要由α螺旋(41.88%)和無規(guī)則卷曲(37.18%)構(gòu)成，并且牽牛PNRma1蛋白與野生潘那利番茄的同源性最高(相似度為94%)。在干旱脅迫處理下，PNRma1基因在牽牛根部的表達量總體上與對照相比呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，其在葉片中表達水平呈現(xiàn)后期上升趨勢，試驗結(jié)果表明，PNRma1基因響應(yīng)牽牛的干旱脅迫反應(yīng)，并且在根部(6h)早于葉片(9h)應(yīng)答干旱信號。

牽牛；PNRma1；生物信息學(xué)；表達分析

植物響應(yīng)逆境脅迫的過程與蛋白質(zhì)代謝的過程息息相關(guān)。在植物蛋白質(zhì)代謝過程中，某些特定功能蛋白質(zhì)的降解對于植物響應(yīng)外界逆境脅迫，維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和植物體正常的生長發(fā)育具有十分重要的作用。

在目前所發(fā)現(xiàn)的真核生物體各種蛋白質(zhì)降解途徑中，泛素/26S蛋白酶體系統(tǒng)是其中一個具有高度選擇性的降解蛋白質(zhì)的途徑。它是由26S蛋白酶體系統(tǒng)以及泛素啟動酶系統(tǒng)共同構(gòu)成的。其中泛素啟動酶系統(tǒng)主要負責(zé)對所需要降解的特異性目標(biāo)蛋白的泛素化[1]，它是由三大酶類一起組成的，分別為泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2和泛素-蛋白連接酶E3。

在泛素/26S蛋白酶體中，泛素-蛋白連接酶E3雖然發(fā)現(xiàn)的最晚，但是種類繁多并且功能復(fù)雜，已經(jīng)是當(dāng)今生物學(xué)研究中的熱點。它廣泛存在與真核生物中，參與植物生長發(fā)育過程中的花發(fā)育[2]、自交不親和[3]以及植物衰老[4]等過程，并且在植物的抗病反應(yīng)、激素反應(yīng)和逆境脅迫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用[5]。目前發(fā)現(xiàn)的泛素-蛋白連接酶E3根據(jù)亞基的組成可以分為單亞基型和多亞基型，其中單亞基型主要包括三大類：HETC(homologous to E6-APC terminus)蛋白家族、RING(really interesting new gene)蛋白家族和U-box蛋白家族[6]。Lee等[7]從辣椒中提取出一個E3泛素-蛋白連接酶Rma1H1蛋白，經(jīng)鑒定它是屬于RING-finger類型蛋白，它由Rma1基因編碼并能夠正調(diào)控植物的干旱脅迫反應(yīng)，從而極大地引起了人們對該類蛋白在應(yīng)答植物抗逆反應(yīng)中的興趣。 Bae等[8]后來也從水稻中分離出辣椒Rma1H1的同源蛋白，該蛋白由osrdcp1基因編碼，OsRDCP1同樣參與對水稻干旱的正調(diào)控；Li等[9]發(fā)現(xiàn)了一個RING-finger 類型泛素E3連接酶—OsBBI1蛋白，它的表達受的稻瘟病菌誘導(dǎo)，編碼OsBBI1蛋白的基因—osbbi1基因過表達可以提高水稻葉鞘表皮細胞壁厚度從而增強水稻對稻瘟病的抗性；Park[10]等發(fā)現(xiàn)了一個RING-finger 類型泛素E3連接酶—OsDSG1蛋白，它是從種子延遲萌發(fā)的T-DNA突變?nèi)后w中鑒定出的，編碼該蛋白的基因—osdsg1基因的表達能夠延遲種子萌發(fā)，因此osdsg1突變體可以增強植物應(yīng)對干旱和高鹽脅迫的耐受性。

本試驗通過對牽牛中RING-finger型編碼E3泛素連接酶蛋白基因—PNRma1基因的克隆，在此基礎(chǔ)上對該基因進行生物信息學(xué)分析及預(yù)測后，進一步研究其在干旱脅迫下的表達特性，為進一步研究該蛋白在牽牛生長發(fā)育及抗性生理過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為牽牛(PharbitisnilL.)。

1.2 試驗設(shè)計與方法

1.2.1 牽牛RNA的提取。牽?？俁NA的提取使用采用常規(guī)Trizol法。RNA質(zhì)量的檢測，用濃度為0.1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測所提出的牽牛總RNA的質(zhì)量。

1.2.2 牽牛cDNA第一鏈的合成。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TOYOBO)進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)液的配置如表1所示。

表1 cDNA第一鏈合成反應(yīng)液組成

1.2.3 牽牛PNRma1基因cDNA序列克隆

1.2.3.1 牽牛PNRma1基因的引物設(shè)計：利用辣椒的Rma1H1的cDNA序列為信息，與已經(jīng)公布的牽牛基因組序列(http://gkcsuja.solgenomics.net/tools/blast/)進行比對，獲得一段基因序列(登陸編號：Solyc07g054080.1)，根據(jù)這段基因的cDNA序列信息，在Sanger Biotech公司設(shè)計特異引物RMA-Q1M和RMA-Q2M(表2)。

表2 PNRma1基因引物名稱及序列

1.2.3.2 PCR體系及反應(yīng)程序：牽牛PNRma1基因的PCR克隆反應(yīng)體系為：2×ES Tap Master Mix 12.5μL，cDNA 1μL，上下游引物各1μL，ddH2O 9.5μL，總體積25μL。PCR反應(yīng)的程序是：94℃ 2min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35個循環(huán)，最終延長72℃ 2min。PCR擴增產(chǎn)物用濃度為1 %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1.2.4 牽牛PNRma1基因cDNA序列的回收。利用膠回收試劑盒(原平皓生物公司)說明書對牽牛PNRma1基因cDNA的PCR產(chǎn)物進行回收，回收產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 牽牛PNRma1基因的生物信息學(xué)分析。根據(jù)牽牛PNRma1的氨基酸序列，利用NCBI-blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)在線分析軟件對其序列與其他植物進行比對，為進一步研究PNRma1蛋白氨基酸序列相似性及進化關(guān)系，用軟件DNAMAN對序列進行多重比對，然后再用軟件MEGA 4構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用ProtParam(http: //web.expasy.org/protparam)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)；利用PSORT Prediction(http: //psort.hge.jp/form.html)預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細胞定位；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)預(yù)測氨基酸的二級結(jié)構(gòu)；利用SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測氨基酸的三級結(jié)構(gòu)。

1.2.6 干旱脅迫下PNRma1基因的表達特性分析。為研究PNRma1基因在牽牛干旱脅迫下的表達特性，對牽牛進行10% PEG6000干旱脅迫處理，在處理后的0，3，6，9，12h提取牽牛植株的根部和葉片的RNA，進行半定量RT-PCR表達分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牽?？俁NA的獲得與分析

利用Trizol法提取牽牛總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗后獲得了RNA條帶(圖1)。電泳后獲得的條帶較清晰，說明所提取出牽?？俁NA未發(fā)生降解，可以用于接下來的反轉(zhuǎn)錄。

圖1 牽牛RNA的提取

圖2 牽牛PNRma1全長cDNA PCR擴增結(jié)果M：分子量標(biāo)準(zhǔn) DL2000 1：PCR產(chǎn)物

2.2 牽牛PNRma1基因cDNA克隆結(jié)果

使用牽牛葉片的cDNA為模板，利用設(shè)計出的PNRma1引物進行PCR擴增，克隆出牽牛PNRma1基因，回收得到牽牛PNRma1基因，最后電泳檢測得到一條750bp左右的目的條帶(圖2)。

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 牽牛PNRma1氨基酸同源性分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。將克隆得到的cDNA 序列進行生物信息學(xué)分析，通過NCBI的ORF Finder程序進行分析，結(jié)果顯示開放讀碼區(qū)為734 bp，編碼244個氨基酸(圖3)。

根據(jù)已克隆的牽牛PNRma1氨基酸序列在NCBI上與其他植物的同源氨基酸序列進行比對分析，結(jié)果表明(圖4)，牽牛PNRma1氨基酸序列與野生潘那利番茄一致性為94%，與甜椒、番茄和馬鈴薯的一致性分別為92%、91%、90%，與各種煙草的一致性為80%以上，說明PNRma1基因在這些植物中比較保守。

圖3 PNRma1可讀框核苷酸序列及氨基酸序列

圖4 牽牛PNRma1與其他物種Rma1氨基酸序列保守區(qū)域的多重比對

將上述在氨基酸序列與比對較高的植物生成進化樹，用于分析牽牛PNRma1與其他物種中相關(guān)蛋白的進化關(guān)系，結(jié)果表明(圖5)，牽牛PNRma1與番茄同屬1個分支；美花煙草和野生煙草的Rma1屬于同1個分支；胡蘿卜屬于并系。

圖5 PNRma1氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹

2.3.2 牽牛PNRma1蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用SOPMA對PNRma1蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，結(jié)果如圖6所示，大寫行是氨基酸序列，下面的小寫行是其對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)，其中h代表α-螺旋(alpha helix)、e代表延伸鏈(extended strand)、t代表β-轉(zhuǎn)角(beta turn)、c代表無規(guī)則卷曲(random coil)。圖中結(jié)果表明PNRma1蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，h占41.88%，e占14.96%，t占5.98%，c占37.18%。由此推測，PNRma1蛋白含有大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲。

圖6 PNRma1蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3.3 PNRma1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。利用SWISS-MODEL對PNRma1基因編碼的氨基酸三級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，如圖7所示，牽牛PNRma1蛋白的三級結(jié)構(gòu)區(qū)呈現(xiàn)一定的螺旋彎曲結(jié)構(gòu)，其中有4個明顯的螺旋結(jié)構(gòu)。

圖7 PNRma1蛋白結(jié)構(gòu)域區(qū)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.4 干旱脅迫下，牽牛PNRma1基因的RT-PCR表達特性

為研究PNRma1基因在牽牛受到干旱脅迫下的響應(yīng)特征，利用半定量RT-PCR技術(shù)進行該基因的表達特性分析，結(jié)果如圖8和圖9所示。該基因在牽牛受到干旱脅迫時的根部表達圖片看出，其表達在6h時增強顯著，顯著高于0h初始時期，之后12h時表達量減弱。而在牽牛葉片，PNRma1基因的表達在9h和12h的表達強于初始時期，以上表明PNRma1基因響應(yīng)牽牛的干旱脅迫反應(yīng)，并且根部(6h)早于葉片(9h)應(yīng)答干旱信號，PNRma1基因增強表達顯著。

圖8 干旱脅迫下牽牛PNRma1基因在根部的表達M：DL2000；1：0h；2：3h；3：6h；4：9h；5：12h

圖9 干旱脅迫下牽牛PNRma1基因在葉片的表達M：DL2000；1：0h；2：3h；3：6h；4：9h；5：12h

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

本研究通過RT-PCR方法從牽牛中克隆到一個泛素E3連接酶基因PNRma1，cDNA全長為734 bp，可編碼244個氨基酸。牽牛PNRma1蛋白與其他植物進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與野生潘那利番茄一致性為94%，與甜椒、番茄和馬鈴薯的一致性分別為92%、91%、90%，說明該基因在這些植物中保守性較高。對PNRma1蛋白進行生物信息學(xué)分析表明，其二級結(jié)構(gòu)中，h占41.88%，c占37.18%，推測PNRma1蛋白含有大量的α-螺旋和無規(guī)則卷曲。該蛋白的三級結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測含有4個明顯的螺旋結(jié)構(gòu)。在以上基礎(chǔ)上，進一步研究表明PNRma1基因早期響應(yīng)牽牛的干旱脅迫反應(yīng)，基因表達增強顯著，并且該基因在根部(6h)早于葉片(9h)應(yīng)答干旱信號。

3.2 討論

早在2003年，辣椒Rma1H1作為干旱誘導(dǎo)基因就被最初鑒定出來[11]，進而陸續(xù)對該基因進行研究[7-8,12]。雖然部分植物Rma1基因已被克隆，但在觀賞植物牽牛中尚未見報道。本試驗中采用RT-PCR的方法，獲得牽牛PNRma1基因cDNA序列(圖1、2)。牽牛PNRma1與其他8種植物進行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其在野生潘那利番茄的同源性最高為94%，其次是甜椒、番茄和馬鈴薯(圖4)，這說明PNRma1基因在這些植物中較保守。

對牽牛進行干旱處理，RT-PCR檢測結(jié)果表明：在干旱脅迫處理下，PNRma1基因在牽牛葉片和根部的表達量在脅迫初期都呈現(xiàn)一次明顯的上升(圖8、9)，總體上表達量與對照相比呈現(xiàn)上升趨勢，這與玉米中鑒定出的RING型E3泛素連接酶ZmGW2相似，在玉米苗期不同脅迫處理下，ZmGW2基因在根和葉中均被誘導(dǎo)表達，在干旱脅迫條件下，該基因前期表現(xiàn)出上調(diào)表達，而后表達量逐漸下降[13]，并且PNRma1基因在根部表達(6h)早于葉片表達(9h)來應(yīng)答干旱信號。以上說明PNRma1基因是一個受干旱脅迫誘導(dǎo)增強表達的基因且在根部優(yōu)勢表達。

本試驗結(jié)果表明PNRma1基因可能參與牽牛的干旱應(yīng)答及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，且在不同器官所起的調(diào)節(jié)作用有一定的差異，其機理需進一步研究。本研究結(jié)果為進一步研究牽牛的抗旱分子機理提供了試驗基礎(chǔ)，為牽?？购颠z傳改良提供了理論依據(jù)和候選基因資源。

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CloningandDroughtResistanceAnalysisofE3UbiquitinLigasePNRma1GeneinPharbitisnilL.

Dai Jinxiu1,Dong Xuanming1,Ni Huanhuan1,Dong Yanlong2,Jin Xiaoxia1*

(1.Harbin Normal University,Harbin 150025;2.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences Horticultural branch,Harbin 150069)

The experiment cloned an cDNA sequence of E3 ubiquitin ligase genePNRma1 by RT-PCR method withPharbitisnilL. used as experimental materials. The length ofLeRma1 gene was 734 bp,which encoded 244 amino acids. Two stage structure of PNRma1 protein was predicted and the results showed that the protein was mainly composed of alpha helix (41.88%) and irregular coiled coil (37.18%). Homology analysis showed that the deduced amino acid sequence exhibited high homology withSolanumpennellii(94% similarity). Under drought stress,the expression ofPNRma1 gene compared with the control in the root showed a trend of increase and then decrease,and its expression level in leaves showed upward trend later,the results showed that thePNRma1 gene responded the drought stress response of morning glory and responded to drought signals at the root (6h) earlier than the leaf (9h) response.

PharbitisnilL.;PNRma1; Bioinformatics; Expression analysis

2017-05-04

黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201510231017)

*通訊作者：金曉霞(1980-)，女，博士，副教授，主要從事植物分子生物學(xué)研究，E-mail：xiaoxia6195@163.com。

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.06.002

Q814

A