王偉，王新榮，曾炳山，劉英，范春節(jié)，紀(jì)春艷

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510000)

南洋楹潰瘍病病原菌生物學(xué)特性研究

王偉1，王新榮1，曾炳山2，劉英2，范春節(jié)2，紀(jì)春艷1

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/廣東省微生物信號(hào)與作物病害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510642； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)院熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510000)

研究了不同培養(yǎng)基、碳氮源、溫度、pH及光照條件對(duì)南洋楹潰瘍病病原菌可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：該菌的最適培養(yǎng)基為PDA，最適碳源、氮源分別是葡萄糖和蛋白胨，菌絲最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，最適pH為5～7，在12∶12光暗交替條件下生長(zhǎng)最好。

南洋楹；潰瘍??；可可毛色二孢；生物學(xué)特性

南洋楹Falcatariamoluccana是含羞草科Mimosaceae南洋楹屬的常綠喬木，自然分布于馬來西亞馬六甲和印度尼西亞，是世界著名的熱帶速生樹種之一。南洋楹木材纖維豐富，韌性強(qiáng)，易加工，是人造板、制漿造紙的優(yōu)良原料。南洋楹樹形優(yōu)美，根系富含根瘤菌，固氮力強(qiáng)，是風(fēng)景園林、改良土壤的優(yōu)良樹種[1]。

南洋楹人工林具有經(jīng)營(yíng)周期短，經(jīng)濟(jì)效益顯著等特點(diǎn)。目前，南洋楹人工林在廣東增城等地已形成規(guī)?；N植，促進(jìn)了當(dāng)?shù)亓洲r(nóng)的增收致富。國(guó)內(nèi)對(duì)于南洋楹的研究大多集中在引種、栽培、優(yōu)良種源/家系的選育上[2-5]，有關(guān)南洋楹病害的研究很少報(bào)道。張景寧等[6]報(bào)道了南洋楹叢枝病的發(fā)生。2013年作者在廣東增城惠東及博羅的南洋楹種植區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種潰瘍病，嚴(yán)重影響南洋楹的生長(zhǎng)及品質(zhì)。經(jīng)調(diào)查，該病害主要為害1～2 a生南洋楹植株，感病枝條呈現(xiàn)棕褐色或黑褐色小斑，干部常有黑褐色的凹陷潰瘍大病斑，感病植株生長(zhǎng)不良，有的落葉、頂枯，嚴(yán)重時(shí)甚至死亡。作者對(duì)采集的感病樣本進(jìn)行了病原菌分離培養(yǎng)、純化及鑒定，分別通過對(duì)南洋楹樹苗(苗齡2月)及南洋楹樹木(1 a生)接種代表優(yōu)勢(shì)病原菌菌株(BL1331和HD1332)的科赫法則致病性驗(yàn)證，結(jié)合菌株(BL1331和HD1332)的形態(tài)鑒定、分子鑒定和基于核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ribosomal internal transcribed spacer region，ITS)、β-微管蛋白(β-tubulin)及延長(zhǎng)因子(elongation factor 1-α，EF 1-α)的序列比較和多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建分析，首次系統(tǒng)報(bào)道了由可可毛色二孢Lasiodiplodiatheobromae引起南洋楹潰瘍病的發(fā)生[7]。本文作者對(duì)南洋楹潰瘍病優(yōu)勢(shì)病原菌可可毛色二孢的生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期對(duì)該病害的科學(xué)防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌株的分離純化 病樣從增城博羅及惠東兩地林場(chǎng)里發(fā)病嚴(yán)重且具典型癥狀的南洋楹病樹上采集，并進(jìn)行病原菌的分離、純化。在感病組織的病、健交界處取一小塊組織，用75 %乙醇浸泡30 s，后浸泡于10 %次氯酸鈉溶液2 min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，25 ℃培養(yǎng)，經(jīng)單孢分離，獲得單孢純化菌株，選取從博羅分離獲得的菌株BL1331和從惠東分離獲得的菌株HD1332作為供試菌株進(jìn)行生物學(xué)測(cè)定。

1.2 培養(yǎng)基配方 生物學(xué)測(cè)定采用下述6種培養(yǎng)基。PDA(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)：馬鈴薯200 g，葡萄糖15 g，瓊脂20 g，補(bǔ)足水至1 000 mL；Czapek(查氏培養(yǎng)基)：硝酸鈉3 g，磷酸氫二鉀1 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鉀0.5 g，硫酸鐵0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂20 g，補(bǔ)足水至1000 mL；OA(燕麥培養(yǎng)基)：燕麥片20 g，葡萄糖15 g，瓊脂20 g，補(bǔ)足水至1 000 mL；CMA(玉米粉瓊脂培養(yǎng)基)：玉米粉300 g，瓊脂20 g，補(bǔ)足水至1 000 mL；Plant tissue(南洋楹汁液培養(yǎng)基)：健康新鮮南洋楹枝葉200 g，用水熬煮20 min，過濾，加入瓊脂20 g，補(bǔ)足水至1 000 mL；WA(水瓊脂培養(yǎng)基)：瓊脂15 g，補(bǔ)足水至1 000 mL。

1.3 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.3.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 將PDA平板上培養(yǎng)3 d的菌株沿菌落邊緣用打孔器打取直徑6 mm的菌餅，分別接種于PDA、Czapek、OA、CMA、Plant tissue、WA等6種平板培養(yǎng)基中央，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)，觀察菌落特征，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，以兩次測(cè)量的平均值代表該平皿的菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 不同C源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入等量蔗糖、果糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖及可溶性淀粉作為碳源制成相應(yīng)的平板培養(yǎng)基，以不加蔗糖的查氏培養(yǎng)基為碳源對(duì)照。打取直徑6 mm的菌餅分別接種于上述培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫光暗交替培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 不同N源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入等量的硫酸銨、硝酸銨、氯化銨、蛋白胨、牛肉膏、尿素以代替硝酸鈉作為氮源制成相應(yīng)的平板培養(yǎng)基，以不加硝酸鈉為氮源對(duì)照。打取直徑6 mm的菌餅分別接種于上述培養(yǎng)基中央，28 ℃恒溫光暗交替，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 不同溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，打取直徑6 mm的菌餅接種至平板的中央，分別置于5，10，15，20，25，30，35，40 ℃中光暗交替培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.5 不同光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，打取直徑6 mm的菌餅接種至平板的中央，分別置于24 h光照(光照強(qiáng)度為300 lx)、24 h黑暗及12∶12(L∶D)3種光照條件下，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.6 不同pH對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 用1 mol/L的HCl和NaOH調(diào)配pH為3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的查氏培養(yǎng)基，打取直徑6 mm的菌餅接種至平板的中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況，十字交叉法測(cè)量菌落直徑，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)特征 供試菌株BL1331和HD1332在PDA培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)速度較快，氣生菌絲發(fā)達(dá)，菌落初期為白色，絨毛狀，邊緣整齊，培養(yǎng)后期菌絲逐漸變?yōu)榛疑?，背面呈黑色，菌絲體呈束狀聳立(圖1)。供試菌株的分生孢子未成熟時(shí)單細(xì)胞，無色，薄壁；成熟時(shí)暗褐色，雙細(xì)胞，橢圓形至卵圓形，厚壁(圖2)。

圖1 菌株BL1331在PDA平板上的菌落形態(tài)(左:初期；右：后期)

圖2 菌株BL1331的分生孢子(標(biāo)尺20 μm)

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌菌株BL1331和HD1332在不同培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)存在一定差異。培養(yǎng)48 h后，兩個(gè)菌株在PDA上生長(zhǎng)速度最快，菌絲茂盛，菌落直徑明顯大于在其它培養(yǎng)基上的菌落直徑。在查氏、玉米粉、燕麥及南洋楹汁液培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度依次遞減，在水瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，菌落最小(表1)。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

注：數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均值，同列中不同小寫字母和大寫字母分別表示5%和1%的差異顯著水平。

2.3 不同碳源對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌菌株BL1331和HD1332在所有供試的碳源培養(yǎng)基上均能夠生長(zhǎng)，但對(duì)不同碳源的利用能力存在一定差異(圖3)。在含有葡萄糖和蔗糖的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)較快，培養(yǎng)48 h時(shí)菌株BL1331菌落直徑分別為對(duì)照的1.93和1.91倍，而菌株HD1332菌落直徑分別為對(duì)照的1.92和1.76倍。在含有乳糖、麥芽糖和可溶性淀粉的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度次之，在果糖上生長(zhǎng)速度較慢，在不加碳源的對(duì)照上生長(zhǎng)速度最慢。結(jié)果表明，葡萄糖和蔗糖是菌絲生長(zhǎng)的最佳碳源。

圖3 不同碳源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 不同氮源對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 病原菌菌株BL1331和HD1332對(duì)不同氮源的利用能力存在一定差異(圖4)。培養(yǎng)48 h時(shí)，兩個(gè)菌株在含有蛋白胨的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最快，在含有硝酸銨的無機(jī)氮源培養(yǎng)基上菌絲的生長(zhǎng)速度較慢，而在含有尿素的培養(yǎng)基上幾乎不生長(zhǎng)。結(jié)果表明，蛋白胨是菌絲生長(zhǎng)的最佳氮源，而尿素不利于菌株生長(zhǎng)。不同氮源培養(yǎng)基上菌落形態(tài)也稍不同，在含有蛋白胨、牛肉膏等有機(jī)氮源的培養(yǎng)基上菌落較致密，菌絲茂盛，而在硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌絲稀疏(圖5)。

圖4 不同氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

圖5 不同氮源培養(yǎng)基上菌株BL1331的菌落形態(tài)(左：蛋白胨；中：牛肉膏；右：硝酸銨)

2.5 不同溫度對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 溫度對(duì)病原菌菌株BL1331和HD1332的菌絲生長(zhǎng)都具有顯著影響。兩個(gè)菌株在10～35 ℃的范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng)，在25～30 ℃范圍內(nèi)菌絲生長(zhǎng)較快，顯著高于其它溫度區(qū)域。在15 ℃和35 ℃生長(zhǎng)速度較慢，在10 ℃條件下生長(zhǎng)緩慢，在5 ℃和40 ℃的條件下不生長(zhǎng)(表2)。結(jié)果表明，最適宜該菌菌絲生長(zhǎng)的溫度范圍在25～30 ℃，低于5 ℃和高于40 ℃均不能生長(zhǎng)。

表2 不同溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

注：數(shù)值為3個(gè)重復(fù)的平均值，同列中不同小寫字母和大寫字母分別表示5%和1%的差異顯著水平。

2.6 不同光照對(duì)供試菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 不同光照條件對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)具有影響，菌株BL1331和HD1332在完全光照和光暗交替的條件下生長(zhǎng)較為快速，在完全黑暗條件下生長(zhǎng)較慢(表3)。結(jié)果表明，光暗交替最有利于病原菌的菌絲生長(zhǎng)。

表3 光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響(PDA，25 ℃)

2.7 不同pH對(duì)菌株BL1331和HD1332菌絲生長(zhǎng)的影響 供試菌株的菌絲在pH 4～11的范圍內(nèi)均能夠生長(zhǎng)。菌絲在pH為5～7的范圍內(nèi)生長(zhǎng)最快，在pH 7～11的范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度有所減緩(圖6)，說明微偏酸條件更有利于該病原菌的生長(zhǎng)。

圖6 不同pH對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)研究結(jié)果表明：最適合該病原菌菌絲生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為PDA，最適碳、氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。在供試碳源中，低聚糖(如葡萄糖和蔗糖)有利于病原菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)。在供試氮源中，有機(jī)氮源有利于病原菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，而無機(jī)氮源相對(duì)較差，尿素則難以利用，與沙田柚果腐病(citusmaximafruit rot)菌的研究結(jié)果一致[8]。病菌在pH 4～11的范圍內(nèi)都能夠生長(zhǎng)，最適pH為5～7，在12∶12光暗交替條件下生長(zhǎng)最好，在全光照、全黑暗條件下均能生長(zhǎng)，表明該病菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性較強(qiáng)。在5 ℃條件下，病原菌菌絲不能生長(zhǎng)。在10 ℃條件下，菌絲生長(zhǎng)十分緩慢，表明低溫可減緩該病害的發(fā)生。最適合病原菌菌絲生長(zhǎng)的溫度為25～30 ℃，同毛葡萄穗軸褐腐病(vitisheyneanabrown rachis rot)病原菌菌絲生長(zhǎng)的最適溫度范圍一致[9]。在25～35 ℃的條件下，病原菌菌絲生長(zhǎng)較好，表明高溫較低溫更適宜病原菌菌絲的生長(zhǎng)，在高溫條件下可能仍具有較強(qiáng)的存活力而有利于病害的流行蔓延，此特點(diǎn)與林間高溫多雨時(shí)發(fā)病較重相一致。在生產(chǎn)實(shí)踐中，通過控制環(huán)境條件減少病原菌，從而減緩病害的發(fā)生，也能夠?yàn)樯L(zhǎng)季節(jié)預(yù)測(cè)病害的發(fā)生和及時(shí)防控提供基礎(chǔ)的依據(jù)。

可可毛色二孢主要分布在熱帶、亞熱帶地區(qū)，寄主廣泛，能夠引起500多種植物病害，導(dǎo)致潰瘍、枝枯、壞死、果腐等癥狀[10]。它是一類弱寄生菌，Jami等研究報(bào)道[11]逆境脅迫條件有利于其成功侵染植物。南洋楹潰瘍病是近年南洋楹種植業(yè)的重要病害，其發(fā)病流行規(guī)律尚不明確。我們?cè)谠龀遣┝_和惠東南洋楹林場(chǎng)的病害調(diào)查初步發(fā)現(xiàn)，林間蟲害頻發(fā)、溫暖多雨的環(huán)境，尤其是臺(tái)風(fēng)后造成林木風(fēng)折傷口的條件下，病害易嚴(yán)重發(fā)生。有必要在南洋楹潰瘍病病原菌生物學(xué)特性的研究基礎(chǔ)上，系統(tǒng)開展該病害發(fā)生、發(fā)展及流行規(guī)律的研究，結(jié)合科學(xué)種植、改變環(huán)境，藥劑篩選等綜合防控措施，積極有效地控制南洋楹潰瘍病的進(jìn)一步發(fā)生及蔓延。

[1] SIREGAR U J,RACHMI A,MASSIJAYA M Y,et al.Economic analysis of sengon (Paraserianthesfalcataria) community forest plantation,a fast growing species in East Java,Indonesia[J].Forest Policy and Economics,2007,(9):822-829.

[2] 鄭永光,周小珍,陳紅躍,等.南洋楹優(yōu)良種源/家系選擇的研究[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(3):29-33.

[3] 韋如萍,胡德活,鄭永光,等.南洋楹種源家系試驗(yàn)[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,27(1):64-69.

[4] 韋如萍,晏姝,胡德活,等.11年生南洋楹引種試驗(yàn)及家系選擇[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(5):19-24.

[5] 劉英,曾炳山,裘珍飛,等.基質(zhì)對(duì)南洋楹組培苗移植成活的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(11):29-33.

[6] 張景寧,吳愛萍,程偉文,等.南洋楹叢枝病病原的研究[J].廣東林業(yè)科技,1994,(2):24-26.

[7] JI C Y,CHEN C J,WANG X R,et al.A report on canker disease ofFalcatariamoluccanacaused byLasiodiplodiatheobromaein China[J].Crop Protection，2017,91:89-92.

[8] 董章勇,羅梅,賓淑英,等.沙田柚果腐病病原菌的鑒定與生物學(xué)特性[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(22):125-128.

[9] 史國(guó)英,胡春錦,羅掉愛,等.毛葡萄穗軸褐腐病病原菌鑒定及其生物學(xué)特性[J].植物病理學(xué)報(bào),2010,40(3):242-249.

[10]URBEZ-TORRES J R,LEAVITT G M,VOEGEL T M,et al.Identification and distribution ofBotryosphaeriaspp.associated with grapevine cankers in California[J].Plant Disease,2006,90:1490-1503.

[11]JAMI F,SLIPPERS B,WINGFIELD M J,et al.Greater Botryosphaeriaceae diversity in healthy than associated diseasedAcaciakarrootree tissues[J].Australasian Plant Pathology,2013,42:421-430.

(責(zé)任編輯 李計(jì)順)

BiologicalcharacteristicsofthepathogenLasiodiplodiatheobromaefromthecankerdiseaseinFalcatariamoluccana/

WANG Wei,et al.
(College of Agriculture,South China Agricultural University,Guangdong Provincial Key Laboratory for Microbial Signals and Crops Disease Control,Guangzhou 510642,China)

Biological characteristics ofLasiodiplodiatheobromaecausingFalcatariamoluccanastem canker disease were studied.The results showed that the optimal media for mycelium growth was PDA.The most suitable carbon and nitrogen source were glucose and peptone.The optimum temperature was 25℃.The most suitable pH value was from 5.0 to 7.0,and the most suitable light-dark cycle was 12∶12 h.

Falcatariamoluccana;canker disease;Lasiodiplodiatheobromae;biological characteristics

2016-11-17；

2016-12-18

國(guó)家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(No.201304113)

王偉(1992—)，男，山西太原人，在讀研究生，研究方向?yàn)橹参锊±韺W(xué)，E-mail:565422947@qq.com

紀(jì)春艷，博士，從事植物病理學(xué)研究，E-mail:jcy3210@163.com。

S763.15

A

1671-0886(2017)06-0014-04