朱業(yè)晉　劉珊　彭琪琦　張曉媛　賴聞玲

摘要：采用土壤培養(yǎng)方法，研究了不同濃度（100、200、300 mgkg） 污染物萘和污染時間對菖蒲（Acorus calamus L）葉片葉綠素含量、脯氨酸含量、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對在萘污染初期（20 d），菖蒲葉綠素含量顯著下降、脯氨酸和MDA積累增加、SOD和POD活性顯著增強；經(jīng)過一段時間以后，葉綠素含量、脯氨酸和MDA積累、SOD活性都基本恢復正常。以上結(jié)果表明，菖蒲忍耐萘污染的能力較強，具有修復潮濕土壤萘污染的潛力。

關(guān)鍵詞：萘；菖蒲；生理特性；土壤修復

中圖分類號： X53文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0311-03

收稿日期：2016-05-29

基金項目：國家自然科學基金（編號：51309054）；江西省自然科學基金（編號：2011ZBAB204015，20122BAB204006）；江西省教育廳科學技術(shù)研究項目（編號：GJJ125656）。

作者簡介：朱業(yè)晉（1974—），男，江西贛州人，碩士，副教授，主要從事植物資源與水環(huán)境保護研究。E-mail：664542890@qqcom。

通信作者：賴聞玲，博士，副教授，碩士生導師，主要從事植物資源與水環(huán)境保護等研究。E-mail：664542890@qqcom。

多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指2個或2個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列組合成的一類稠環(huán)化合物1]。由于城市化和工業(yè)化的發(fā)展，PAHs已廣泛積累于土壤、水、沉積物和大氣中，進入了生物圈2]。PAHs具有長期殘留性、生物蓄積性、半揮發(fā)性和高毒性等特點3]，對生態(tài)系統(tǒng)和人類的身體健康造成嚴重的危害，因此對環(huán)境中的PAHs進行監(jiān)測和修復具有重要意義4]。

目前關(guān)于含PAHs土壤的修復技術(shù)主要有：化學修復、物理修復和生物修復，前2種方法費用高昂，而且容易造成二次污染甚至生態(tài)系統(tǒng)破壞；與之相比，生物修復是利用包括植物、動物、微生物在內(nèi)的特定生物種類，或其中任意2種以上生物相結(jié)合，在特定條件下對污染物富集或降解，其中植物修復技術(shù)因為成本低、操作簡便、不破壞生態(tài)環(huán)境和自然景觀、不造成二次污染等優(yōu)點成為熱點4]。不同類型的植物對多環(huán)芳烴的修復效果不同，有研究表明木本植物對PAHs的土壤污染修復能力不及草本植物，如油菜、黑燕麥、高羊茅對菲和芘的去除率都很高，達80%以上4]。利用草本植物凈化土壤中PAHs的研究主要集中在旱生環(huán)境，如苜蓿、燈芯草、玉米、黑麥草等，并且取得了一定的成果5]。但對于潮濕甚至淹水土壤，只能選擇水生植物作為修復材料。作為適應能力強，有強大須根系的水生植物菖蒲（Acorus calamus L）被視為理想研究對象。菖蒲生性粗放，無需特別管理，是多年生水生草本植物。菖蒲常被應用于凈化鉛、鎘、銅等重金屬及富營養(yǎng)化水體的科學研究中，在水體生態(tài)修復工程中具有良好的應用前景6-8]，但應用于修復多環(huán)芳烴污染物方面的研究尚未見報道，因此被寄予厚望。本試驗以萘作為多環(huán)芳烴的代表物質(zhì)，研究了淹水土壤中萘對菖蒲體內(nèi)的脯氨酸、過氧化物酶（POD）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）的影響，以便進一步了解凈化過程中，萘污染對菖蒲生理生化的影響。

1材料與方法

11材料與試驗設計

培養(yǎng)容器為市售紅色橡膠桶（上口內(nèi)徑36 cm，桶底內(nèi)徑32 cm，桶高40 cm），內(nèi)裝從菜地挖取而來經(jīng)風干過篩的土壤20 kg。用丙酮作助溶劑，配制不同濃度萘有機溶液分別均勻灌溉于桶中，過夜待丙酮揮發(fā)后將桶中土壤攪拌均勻，最終土壤中設置3個萘污染量梯度（100、200、300 mgkg），以不加萘為對照，每個處理3個重復。試驗植物為事先培養(yǎng)的菖蒲，選取長勢健壯、大小一致的菖蒲種植在桶中，保持淹水狀態(tài)，自然光下培養(yǎng)。每20 d取1次樣，每株剪取適量成熟菖蒲葉片，作為測定各項指標的試驗材料。

12測定方法

葉片葉綠素含量采用分光光度計法9]測定，單位mgg FW。脯氨酸含量采用酸性茚三酮法10]測定，單位μgg FW。MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法9]測定，單位μmolg FW。SOD活性測定采用NBT法9]，以抑制NBT光化還原50%的酶量為1個酶活性單位計算酶活性，單位U（g·min）。POD活性采用愈創(chuàng)木酚法9]測定，以每分鐘OD470增加001為1個酶活單位計算其活性，單位 U（g·min）。

13數(shù)據(jù)處理方法

運用Microsoft Excel 2003軟件統(tǒng)計平均值、標準差，并生成圖表。運用SPSS 130軟件進行相關(guān)性、組間和時間之間方差分析及差異性（雙尾）分析，采用雙因素方差分析方法分析不同時間、不同萘濃度處理及兩者交互作用的影響。

2結(jié)果與分析

21土壤萘污染對菖蒲葉綠素的影響

受萘的污染，菖蒲葉片中的葉綠素含量基本呈先降后升的趨勢（圖1）。其中低污染量（100 mgkg）污染對葉綠素含量的影響最大，在試驗的所有時間里都顯著地低于對照（P=0000）。較高含量萘污染（200、300 mgkg）在初期對葉綠素含量影響較大，20 d時二者顯著低于對照（P=0000、0012），但隨時間延長葉綠素含量逐漸恢復，40 d和60 d時與對照差異不顯著，并且兩污染量間差異不顯著，但與低污染量（100 mgkg）之間差異顯著（P=0000、0001）。

雙因素方差分析結(jié)果表明，萘污染量和污染時間都極顯著影響菖蒲葉片中葉綠素含量（P<001），但污染量和污染時間之間的交互作用對葉綠素含量的影響不顯著（表1）。

22土壤萘污染對菖蒲脯氨酸的影響

萘污染造成菖蒲葉片中脯氨酸含量在短期內(nèi)（20 d）急劇升高（圖2），3種污染量影響下菖蒲葉片脯氨酸含量都極顯著高于對照（P=0000、0000、0000），其中中等污染量（200 mgkg）影響下的脯氨酸含量最高，但其與低污染量（100 mgkg）和高污染量（300 mgkg）之間差異不顯著。隨著時間延長，脯氨酸含量下降，40 d后各污染量之間及與對照之間差異不顯著。雙因素方差分析結(jié)果顯示，污染時間極顯著影響菖蒲葉片中脯氨酸含量（P<001），萘污染量對脯氨酸含量影響不顯著，而污染量和污染時間之間的交互作用對脯氨酸含量影響極顯著（P<001）（表1）。

23土壤萘污染對菖蒲MDA的影響

萘影響下菖蒲葉片中的MDA含量總體呈先上升后下降的趨勢，其中低污染（100 mgkg）和高污染（300 mgkg）引起的反應較快，而中等污染（200 mgkg）引起的反應較慢。初期時（20 d）菖蒲葉片中的MDA含量都升高并高于對照，但各污染量之間及與對照之間都沒有顯著差異。中期時（40 d）低污染（100 mgkg）和高污染（300 mgkg）MDA含量降至與對照無顯著差異，而萘污染量200 mgkg的MDA含量繼續(xù)上升至與其他污染量及對照都有顯著差異（P=0011、0035、0026）。到污染的后期（60 d），中、高污染的MDA繼續(xù)下降，而低污染的MDA略有升高，但各組之間及與對照之間差異均不顯著。雙因素方差分析結(jié)果表明，污染時間極顯著影響菖蒲葉片中MDA含量（P<001），萘污染量對MDA含量影響不顯著，而污染量和污染時間之間的交互作用對脯氨酸含量影響極顯著（P<001）（表1）。

24土壤萘污染對菖蒲SOD的影響

菖蒲葉片SOD活性萘污染的響應依污染量而不同。中、高污染量刺激SOD活性先升高再下降，在20 d時顯著高于對照（P=0025、0020），而低污染量（100 mgkg）在初期時（20 d）使得SOD活性顯著下降而低于對照（P=0012），在40 d時所有污染量SOD達到最大，而后降低。初期時（20 d）低污染量影響SOD活性顯著低于對照和中、高污染量，其他時間各組之間無顯著差異。從雙因素方差分析結(jié)果來看，萘污染量和污染時間都顯著影響菖蒲葉片中SOD活性（P<005），污染量和污染時間之間的交互作用對SOD活性的影響顯著（P<005）（表1）。

25土壤萘污染對菖蒲POD的影響

萘污染對菖蒲葉片POD活性的影響非常顯著。不同污染量在不同時間均刺激POD活性顯著高于對照（P<005），不同污染量基本都隨時間推移而刺激作用加強，到后期（60 d）POD活性與污染量成正比，不同污染量之間差異顯著（P<005）。雙因素方差分析結(jié)果也表明，萘污染量、污染時間、污染量和污染時間之間的交互作用都極顯著影響菖蒲葉片中POD含量（P<001）（表1）。

3討論

植物在遭受污染脅迫時，體內(nèi)的各項生理特性會做出響應，這些生理指標的變化往往可以作為衡量污染物毒性和植物抗污染能力的表征。

葉綠素是植物生長的重要指標之一， 研究報道大多數(shù)植

FK（W12]TPZYJ5tif]

物在鹽、水分、重金屬、有機物的脅迫下葉綠素含量會下降11-14]，部分植物在重金屬脅迫下葉綠素含量會上升15]。在對多環(huán)芳烴脅迫的研究中顯示，經(jīng)過一段時間的脅迫，一些植物如擬南芥16]、水葫蘆17]、狐尾藻18]等植物的葉綠素含量會因多環(huán)芳烴脅迫而降低，而玉米幼苗受萘脅迫反應為葉綠素含量增加19]。這些研究表明植物種類、脅迫方式、污染的強度、污染時間可能都會影響試驗結(jié)果。對金魚藻的研究顯示，受萘脅迫金魚藻體內(nèi)葉綠素含量先升后降，研究者認為前期植物根對環(huán)境中污染物快速吸收而促進生長，后期污染物逐漸分散和積累在植物組織中，表現(xiàn)為對光合作用生理活動的抑制18，20]。本試驗中，菖蒲葉片葉綠素含量在萘脅迫下變化的趨勢為先降后升，與前者的結(jié)果不同。在對金魚藻的研究中，采用水培直接污染的方式，植物直接吸收是主要影響方式，因此前述機理可以較好地解釋試驗現(xiàn)象，而本研究中萘在土壤中被吸附、遷移和轉(zhuǎn)化，對比植物的直接吸收，更多的可能是萘對土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生影響而影響菖蒲的生長，筆者推測土壤萘污染短期內(nèi)使土壤理化性質(zhì)發(fā)生不利的變化，隨著時間延長，土壤微生物等作用使得土壤理化性質(zhì)得以不同程度恢復，從而出現(xiàn)本研究中的現(xiàn)象。以往的研究中，在水培條件下受脅迫植物葉綠素降低程度與脅迫程度呈正比，但本研究中呈現(xiàn)的規(guī)律相反，同樣是污染土壤中培育的玉米也出現(xiàn)葉綠素變化與脅迫程度的不規(guī)律關(guān)聯(lián)性，筆者推測可能與土壤復雜的理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)，具體的機理還有待進一步研究。本研究結(jié)果還表明在此試驗萘含量下，菖蒲生理在短時間內(nèi)受一定影響，但可以逐漸恢復。

逆境條件下植物容易產(chǎn)生大量活性氧，使植物細胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，其產(chǎn)物MDA含量通常來表征植物在脅迫因子作用下的損傷程度16-17]。受萘脅迫，菖蒲葉片MDA含量初期時增大，表明短期內(nèi)細胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化而被損傷，但隨著時間推移MDA含量逐漸下降，顯示菖蒲葉片細胞膜逐漸恢復。雙因素方差分析顯示MDA受時間的影響顯著。Heath等認為，葉綠素的破壞與MDA的產(chǎn)生是同時發(fā)生的，葉綠體的脂質(zhì)過氧化可對葉綠素的形成過程產(chǎn)生抑制作用，合成葉綠素所需的酸受到破壞，使葉綠素含量降低，最終可能導致光合系統(tǒng)的失活21]。本研究結(jié)果與其一致，MDA在初期增多，后期逐漸恢復，趨勢與葉綠素變化相反。

脯氨酸是植物細胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，并可幫助清除多余氧自由基，受到逆境脅迫時許多植物會積累高水平的脯氨酸11，15，17]，因此脯氨酸積累通常被當作植物受脅迫的一種信號和抗脅迫的指標。本研究中脯氨酸含量的反應類似于MDA，同時雙因素方差分析顯示，脯氨酸和MDA都受作用時間、時間與萘含量之間交互作用的影響顯著，而萘含量對其影響不顯著，說明萘對菖蒲的影響主要集中在污染初期。

在逆境條件下植物抗氧化酶系統(tǒng)具有應激反應，其中SOD、POD是植物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶21]。SOD主要清除植物體內(nèi)超氧化物自由基（O-2KG-2]· ），為抗氧化的第一道防線，POD則清除多余的H2O2。當植物暴露在多環(huán)芳烴環(huán)境中，植物抗氧化酶活性隨濃度和作用時間反應不同。萘脅迫的前期（15 d）白骨壤幼苗子葉SOD和POD活性升高，隨脅迫時間延長而活性降低22]。金魚藻體內(nèi)的SOD活性因萘污染而降低，在萘濃度較高時顯著降低，而POD活性沒有顯著變化18]。秋茄幼苗的根尖和子葉SOD、POD受萘和芘誘導活性增加23]。菲脅迫初期（12 h）時，擬南芥葉片SOD及POD活性明顯高于對照24]。本研究中，除低污染量（100 mgkg）條件下SOD降低以外，其他條件下SOD和POD都在污染的初期即產(chǎn)生增強反應，說明污染初期菖蒲體內(nèi)氧自由基增多，抗氧化酶系統(tǒng)防御作用增強。SOD活性在20 d后逐漸恢復正常，規(guī)律與脯氨酸、MDA類似，而POD活性持續(xù)升高，并且與污染量成正比?？赡茌撩{迫導致菖蒲體內(nèi)積累的自由氧以H2O2為主。

4結(jié)論

菖蒲對萘污染在初期（20 d）受傷害，清除超氧離子自由基（ O-2KG-2]· ）及過量H2O2的機制隨之啟動，表現(xiàn)為葉綠素含量顯著下降、脯氨酸和MDA積累增加、SOD和POD活性顯著增強，但沒有表現(xiàn)出與污染量之間的顯著相關(guān)性；經(jīng)過一段時間以后，葉綠素含量、脯氨酸和MDA積累、SOD活性都基本恢復正常。菖蒲忍耐萘污染的能力較強，具有修復潮濕土壤萘污染的潛力。

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