何士成　彭太兵　孫曼鈺　賈士儒　鐘成

摘要：為研究堿法預(yù)處理中溫度對(duì)不同底物特性的木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及酶解效率的影響，選用檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom，簡(jiǎn)稱CKK，以下簡(jiǎn)稱檸條）、水稻秸稈、小麥秸稈為原料，用NaOH溶液分別在常溫和高溫條件下進(jìn)行預(yù)處理；通過(guò)掃描電鏡（簡(jiǎn)稱SEM）分析、傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（簡(jiǎn)稱FTIR）分析、X-射線衍射（簡(jiǎn)稱XRD）分析等分析預(yù)處理后木質(zhì)纖維素的表面形態(tài)、化學(xué)成分及結(jié)晶度的變化，并用纖維素酶對(duì)預(yù)處理后的木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行酶解糖化試驗(yàn)。SEM和成分分析結(jié)果表明，NaOH溶液堿處理能有效去除木質(zhì)纖維素的木質(zhì)素成分，破壞致密的物理結(jié)構(gòu)；FTIR圖譜表明，經(jīng)NaOH溶液處理后，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，羥基、亞甲基、甲氧基和酯鍵等部分官能團(tuán)發(fā)生斷裂；XRD分析和酶解結(jié)果顯示，堿處理能破壞木質(zhì)纖維素原料中的結(jié)晶區(qū)，增大原料的孔隙率和內(nèi)表面積，從而增加纖維素酶的可及性和酶解轉(zhuǎn)化率，經(jīng)過(guò)24 h酶解后，高溫下堿處理能使水稻秸稈葡聚糖的轉(zhuǎn)化率高達(dá)9487%；其中，溫度又作為一個(gè)重要的因素影響NaOH溶液堿處理的效果，當(dāng)溫度升高時(shí)，NaOH溶液堿處理對(duì)木質(zhì)素的去除效果更好，對(duì)底物的物理結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，因此升高溫度會(huì)促進(jìn)NaOH溶液堿處理的作用效果。

關(guān)鍵詞：堿法預(yù)處理；溫度；木質(zhì)纖維素；檸條；水稻秸稈；小麥秸稈；成分分析；酶解糖化

中圖分類號(hào)： TQ3513；TQ91文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0292-05

收稿日期：2016-06-15

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201503135-15）。

作者簡(jiǎn)介：何士成（1991—），男，山東棗莊人，碩士，主要從事木質(zhì)纖維素生物質(zhì)降解研究。E-mail：hsctust@163com。

通信作者：鐘成，博士，教授，主要從事纖維素的生物合成代謝與降解機(jī)制研究。E-mail：czhong@tusteducn。

能源危機(jī)與環(huán)境壓力一直迫使人們尋求一種可代替現(xiàn)有化石能源的新能源，木質(zhì)纖維素是地球上大量存在的一種極具開(kāi)發(fā)潛力的可再生能源。中國(guó)木質(zhì)纖維素資源豐富，僅農(nóng)作物秸稈年產(chǎn)生量就有約7億t，林木枝葉和林業(yè)廢棄物約 9億t1]。木質(zhì)纖維素是一種具有高度結(jié)晶區(qū)、結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定的超分子，主要由40%～50%纖維素、15%～30%半纖維素以及15%～30%木質(zhì)素3種化學(xué)物質(zhì)組成2-3]。在植物細(xì)胞壁中，木質(zhì)素填充于纖維素和半纖維素之間，通過(guò)氫鍵和共價(jià)鍵與糖類聚合物連接在一起。這種結(jié)構(gòu)嚴(yán)重阻礙了纖維素酶對(duì)它的降解，合適的預(yù)處理是打破這種抗性的有效手段。常用的預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和物理化學(xué)法等，其中堿法預(yù)處理是一種備受關(guān)注的化學(xué)預(yù)處理方法，堿法預(yù)處理可去除原料中的部分木質(zhì)素，提高剩余多聚糖的酶可及性。但由于不同原料間底物分子結(jié)構(gòu)存在差異，同一種預(yù)處理方法在相同預(yù)處理?xiàng)l件下對(duì)不同底物產(chǎn)生的預(yù)處理效果具有一定的差異。

本研究選用檸條錦雞兒（Caragana korshinskii Kom，簡(jiǎn)稱CKK，以下簡(jiǎn)稱檸條，木本植物）、水稻秸稈、小麥秸稈（草本植物）作底物，采用NaOH溶液分別在常溫和高溫條件下對(duì)這3種原料進(jìn)行預(yù)處理，研究堿在同一預(yù)處理?xiàng)l件下對(duì)不同底物的預(yù)處理效果及預(yù)處理后木質(zhì)纖維素底物酶解規(guī)律的差異，為生物質(zhì)能源開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理參數(shù)的選擇提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11生物質(zhì)材料

檸條錦雞兒采自內(nèi)蒙古自治區(qū)烏蘭察布市涼城縣，水稻秸稈采自湖南省永州市新田縣，小麥秸稈采自山東省棗莊市，以上原料自然風(fēng)干，剪成2～3 cm小段，用FZ102微型植物試驗(yàn)粉碎機(jī)（河北省黃驊市齊家務(wù)科學(xué)儀器廠）粉碎，過(guò)20目篩。

12預(yù)處理

檸條、水稻秸稈和小麥秸稈分別與01 molL NaOH溶液按料液比1 g ∶20 mL混合，分別在室溫條件下，于高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃預(yù)處理1 h，4 000 rmin離心15 min，棄去上清液，固體殘?jiān)粗林行浴?/p>

13木質(zhì)纖維素的特征分析

131掃描電鏡（簡(jiǎn)稱SEM）分析

用掃描電鏡觀察預(yù)處理前后木質(zhì)纖維素的表面結(jié)構(gòu)。樣品觀察前先噴金處理，電壓5～15 kV。

132傅立葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（簡(jiǎn)稱FTIR）分析

用傅立葉紅外光譜測(cè)定堿法預(yù)處理前后木質(zhì)纖維素化學(xué)成分的變化，儀器分辨率為4 cm-1，波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)為16次，樣品處理采用KBr壓片法，2 mg樣品與300 mg KBr混合，壓片，使樣品粒徑降低，分散均勻。

133X-射線衍射（簡(jiǎn)稱XRD）分析

用X-射線衍射方法分析NaOH溶液預(yù)處理前后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈纖維素結(jié)晶度的變化，在 2θ=10°～40°范圍內(nèi)掃描，變化速率為 2 °min。結(jié)晶度計(jì)算公式為

結(jié)晶度（簡(jiǎn)稱CrI）=（I002-I180°）I002×100%

式中：I002為002衍射晶面2θ=228°的強(qiáng)度，I180°為2θ=180°散射峰的強(qiáng)度。

134預(yù)處理前后木質(zhì)纖維素的成分分析

預(yù)處理前后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的葡聚糖、木聚糖和酸不溶性木質(zhì)素的含量參照美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室（簡(jiǎn)稱NREL）的試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定4]。

葡聚糖、木聚糖含量的測(cè)定方法：原料用72%硫酸在 30 ℃ 下水解1 h，再加入84 mL去離子水，在121 ℃下水解 1 h。水解液用022 μm水相濾膜過(guò)濾，用高效液相色譜（簡(jiǎn)稱HPLC）測(cè)定水解液中的糖分含量。D（+）-葡萄糖、D-（+）-木糖和L-（+）-阿拉伯糖作為混合標(biāo)品，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。葡聚糖、木聚糖含量的計(jì)算公式為endprint

葡聚糖含量=SX（]Cg×8673×09生物質(zhì)干質(zhì)量×1 000SX）]×100%；

HS2]木聚糖含量=SX（]Cx×8673×088生物質(zhì)干質(zhì)量×1 000SX）]×100%。

式中：Cg、Cx分別表示水解液中葡萄糖、木糖的濃度，gL；生物質(zhì)干質(zhì)量的單位為g。

酸不溶性木質(zhì)素和灰分含量的測(cè)定方法：取濾紙于 105 ℃ 烘箱烘干至恒質(zhì)量，精確稱量并記錄濾紙質(zhì)量。水解液殘?jiān)婵粘闉V，抽濾后的殘?jiān)?05 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，用馬弗爐測(cè)定樣品灰分。酸不溶性木質(zhì)素含量的計(jì)算方法為

HS2]AIL=SX（]m1×m2×m3m4SX）]×100%。

式中：AIL表示酸不溶性木質(zhì)素的含量；m1、m2、m3、m4分別表示濾紙和固體的質(zhì)量（g）、濾紙的質(zhì)量（g）、灰分質(zhì)量（g）、生物質(zhì)干質(zhì)量（g）。

135酶解試驗(yàn)方法

酶解反應(yīng)的總體積為20 mL，在 100 mL 的三角瓶中進(jìn)行。葡聚糖負(fù)荷為1%，其中葡聚糖負(fù)荷定義為葡聚糖的質(zhì)量占酶解混合物總體積的百分比（木質(zhì)纖維素材料的密度近似為1 gmL）。酶解反應(yīng)所用的酶為纖維素酶Celluclast 15 L和β-葡萄糖苷酶，其中纖維素酶Celluclast 15 L按15 FPUg葡聚糖的負(fù)荷添加（Celluclast 15 L的濾紙酶活性為3776 FPUmL），β-葡萄糖苷酶的添加體積和纖維素酶的相同。酶解溫度為50 ℃，轉(zhuǎn)速為 180 rmin。分別在酶解反應(yīng)進(jìn)行3、6、24、48、72 h時(shí)取樣，所取樣品12 000 rmin離心10 min后取上清，用022 μm水相注射器濾膜過(guò)濾，用HPLC測(cè)定酶解液中的糖濃度，計(jì)算葡聚糖和木聚糖的轉(zhuǎn)化率。

HS2]葡聚糖轉(zhuǎn)化率=SX（]cg×V×09mgSX）]×100%；

HS2]木聚糖轉(zhuǎn)化率=SX（]cx×V×088mxSX）]×100%。

式中：V為酶解液體積，mL；mg、mx分別為酶解初始條件下葡聚糖和木聚糖的質(zhì)量，g。

2結(jié)果與分析

21NaOH溶液預(yù)處理對(duì)檸條、水稻秸稈和小麥秸稈表觀形態(tài)的影響

從圖1可以看出，和未處理水稻秸稈相比，常溫堿處理的水稻秸稈表面出現(xiàn)了一些孔洞，可能是秸稈中木質(zhì)素溶出的結(jié)果，升高預(yù)處理溫度后，堿液對(duì)水稻秸稈表觀結(jié)構(gòu)的破壞程度更為明顯，秸稈表面雜亂無(wú)序，部分纖維斷裂，纖維的排列也變得疏松。同水稻秸稈一樣，小麥秸稈也來(lái)源于草本植物，常溫堿處理后小麥秸稈致密有序的結(jié)構(gòu)受到了一定程度的破壞，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一定程度的皺縮，升高處理溫度后，小麥秸稈的纖維束變得松軟，部分表面坍塌。和小麥秸稈、水稻秸稈不同的是，檸條屬于木本植物，從各自未處理的SEM照片上也可明顯看出，檸條的整體結(jié)構(gòu)更為致密，但是經(jīng)過(guò)常溫和高溫堿處理后樣品表觀結(jié)構(gòu)同樣變化很大，升高堿處理溫度后，對(duì)樣品的破壞程度更加突出。

22NaOH預(yù)處理后檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的FTIR光譜

CM（24]檸條、水稻秸稈和小麥秸稈經(jīng)NaOH溶液在不同溫度條

FK（W25]TPHSC1tif]

件下預(yù)處理后的FTIR光譜如圖2所示。經(jīng)NaOH溶液預(yù)處理后，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的特征峰變化較明顯，特征峰透光率強(qiáng)度整體呈現(xiàn)減弱趨勢(shì)，其中，表征羥基伸縮振動(dòng)的峰在波數(shù)3 425 cm-1處強(qiáng)度明顯減弱，表明NaOH溶液預(yù)處理破壞了木質(zhì)纖維素中的部分氫鍵，而且隨著預(yù)處理溫度的提高，對(duì)氫鍵的破壞程度增強(qiáng)，從而對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞程度也增大5]。波數(shù)2 918 cm-1處表征纖維素中—CH、—CH2伸縮振動(dòng)的特征峰強(qiáng)度明顯減弱，表明NaOH溶液預(yù)處理使纖維素大分子中甲基、亞甲基發(fā)生了部分?jǐn)嗔?，進(jìn)一步表明纖維素的含量增加6]。波數(shù)1 166 cm-1處表征酯鍵中C—O—C鍵伸縮振動(dòng)的吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，表明堿處理打破了糖聚合物和木質(zhì)素間的重要酯鍵7]。波數(shù)1 045 cm-1峰強(qiáng)度的減弱表征愈創(chuàng)木基的羥基被破壞8]。1 245 cm-1表征乙?；蠧FY=，1]O的伸縮振動(dòng)，NaOH溶液處理后該吸收峰強(qiáng)度明顯降低，表明木質(zhì)纖維素生物質(zhì)經(jīng)NaOH溶液處理后，大部分乙?；蝗コ@與朱圓圓等得出的結(jié)論8]一致。波數(shù) 1 730 cm-1 處表征羰基CFY=，1]O伸縮振動(dòng)的吸收峰消失，波數(shù)1 636 cm-1表征吸附水H—O—H彎曲振動(dòng)的吸收峰，1 034 cm-1 表征C—O—H的變形，1 112、1 051 cm-1峰強(qiáng)度的變化與纖維素和半纖維素相關(guān)基團(tuán)的變化有關(guān)。綜上所述，檸條、水稻秸稈和小麥秸稈經(jīng)NaOH溶液處理后，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，部分官能團(tuán)，如羥基、亞甲基、甲氧基和酯鍵等發(fā)生斷裂。

由圖2可以看出，對(duì)于草本植物水稻秸稈和小麥秸稈，相較于常溫堿處理，高溫堿處理后樣品中木質(zhì)素特征峰減弱程度更大，表明升高溫度對(duì)水稻秸稈和小麥秸稈中木質(zhì)素的破壞作用較大，這與成分分析得出的結(jié)果一致。而對(duì)于木本植物檸條，從檸條預(yù)處理前后的紅外圖譜中可看出，升高預(yù)處理

FK（W12]TPHSC2tif；S+4mm]

溫度對(duì)檸條木質(zhì)素相關(guān)基團(tuán)的特征峰影響程度并不大，可能是由于相較于草本植物，木本植物細(xì)胞壁中木質(zhì)素、半纖維素和纖維素的交聯(lián)程度更為致密，從而使木質(zhì)素更難去除。這也表明在同一預(yù)處理?xiàng)l件下，NaOH溶液對(duì)木本植物和草本植物的處理效果有較大的差異。

23NaOH溶液預(yù)處理對(duì)檸條、水稻秸稈和小麥秸稈纖維素結(jié)晶度的影響

由表1可以得出，經(jīng)NaOH溶液預(yù)處理后，水稻秸稈、小麥秸稈和檸條的結(jié)晶度都有所降低，這是因?yàn)镺H—能皂化半纖維素和木質(zhì)素之間的酯鍵以及削弱纖維素和半纖維素之間的氫鍵，破壞木質(zhì)纖維素原料中的結(jié)晶區(qū)，使木質(zhì)纖維素發(fā)生潤(rùn)脹，增大原料的孔隙率和比表面積，從而增加酶對(duì)木質(zhì)纖維素的可及度。由結(jié)晶度結(jié)果可以看出，升高堿處理溫度，3種底物結(jié)晶度都明顯降低，其中，水稻秸稈的結(jié)晶度變化最大，結(jié)晶度降低至560%，小麥秸稈和檸條經(jīng)高溫堿處理后結(jié)晶度大致相當(dāng)，分別為569%和541%。endprint

24堿處理前后各底物的成分分析

不同溫度條件下NaOH溶液預(yù)處理對(duì)檸條、水稻秸稈、小麥秸稈各成分含量的影響如圖3所示。NaOH溶液可以破壞木質(zhì)素聚合體間的醚鍵，使木質(zhì)素解聚為小片段的聚合體，從而溶解在NaOH溶液中。經(jīng)過(guò)NaOH溶液預(yù)處理后，水稻秸稈和小麥秸稈中纖維素（葡聚糖）、半纖維素（木聚糖）含量明顯升高，木質(zhì)素含量明顯降低，表明NaOH溶液預(yù)處理已經(jīng)去除了秸稈中的大量木質(zhì)素，從而使得纖維素和半纖維素比例相對(duì)升高。然而，經(jīng)過(guò)NaOH溶液預(yù)處理后，檸條中半纖維素和木質(zhì)素含量變化不大，纖維素含量卻有一定程度的升高。根據(jù)趙偉等的研究，檸條枝莖富含蛋白質(zhì)和脂肪，在利用NaOH溶液對(duì)檸條預(yù)處理的過(guò)程中，一部分蛋白質(zhì)和脂肪成分被提取出來(lái)9-11]。因此，預(yù)處理后檸條中纖維素的含量增加。另外，雖然NaOH溶液預(yù)處理對(duì)檸條中的木質(zhì)素有一定程度地去除，但其與纖維素、半纖維素的緊密交聯(lián)結(jié)構(gòu)使得檸條的木質(zhì)素去除效果不如水稻秸稈和小麥秸稈明顯。從圖3中還可以明顯看出，溫度對(duì)堿處理后木質(zhì)纖維素各成分含量的影響較大，與常溫堿處理相比，升高溫度使各木質(zhì)纖維素底物的葡聚糖含量分別增加1904%（水稻秸稈）、1480%（小麥秸稈）、1059%（檸條），水稻秸稈和小麥秸稈木質(zhì)素含量分別降低1346%、765%，說(shuō)明溫度能有效地促進(jìn)堿溶液對(duì)木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素的破壞。同時(shí)，在同一預(yù)處理?xiàng)l件下，升高溫度對(duì)檸條、水稻秸稈和小麥秸稈的纖維素含量影響程度并不一致，升高預(yù)處理的溫度，纖維素含量變化由大到小為水稻秸稈>小麥秸稈>檸條。這說(shuō)明由于不同底物的分子結(jié)構(gòu)有一定差異，同一種預(yù)處理方法對(duì)不同底物的影響也呈現(xiàn)出一定差異。

25堿處理對(duì)檸條、水稻和小麥秸稈酶解的影響

對(duì)經(jīng)過(guò)NaOH溶液在不同溫度條件下預(yù)處理后的水稻秸稈、小麥秸稈和檸條進(jìn)行酶解糖化。由圖4可知，堿處理可以有效提高底物中葡聚糖的轉(zhuǎn)化率，升高堿處理溫度后這種作用變得更為明顯。其中，經(jīng)24 h酶解后，高溫堿處理水稻秸稈的葡聚糖絕大部分已被酶解轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化率高達(dá)9487%，是未處理水稻秸稈葡聚糖轉(zhuǎn)化率（3430%）的277倍，對(duì)應(yīng)木聚糖轉(zhuǎn)化率是未處理的566倍（圖5）。因?yàn)榻?jīng)高溫堿處理后大部分的木質(zhì)素溶解并轉(zhuǎn)移到溶液中，而木質(zhì)素含量又是影響酶解轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，木質(zhì)素含量降低，酶解體系中酶的無(wú)效吸附減少，從而使酶的利用率增加。高溫堿處理小麥秸稈最終的葡聚糖轉(zhuǎn)化率為8268%，是未處理小麥秸稈葡聚糖轉(zhuǎn)化率（1981%）的417倍，對(duì)應(yīng)木聚糖轉(zhuǎn)化率是未處理的575倍。同為草本植物，堿處理的小麥秸稈酶解時(shí)表現(xiàn)出和水稻秸稈相類似的結(jié)果。

不同的預(yù)處理底物因結(jié)構(gòu)之間的差異，在酶解糖化中表現(xiàn)出的結(jié)果也不相同。小麥秸稈和水稻秸稈酶解糖化的結(jié)果類似，但是和檸條樣品的酶解結(jié)果相差較大，高溫堿處理的檸條樣品葡聚糖和木聚糖的最終轉(zhuǎn)化率都并不高，主要受致密的物理結(jié)構(gòu)和較高木質(zhì)素含量的影響，從成分分析和SEM的結(jié)果也可以證明這一點(diǎn)?？偟膩?lái)說(shuō)，同一預(yù)處理和酶解條件下，草本植物比木本植物更易酶解。

3結(jié)論與討論

NaOH溶液堿處理作為一種有效的預(yù)處理方式，能有效去除木質(zhì)纖維素的木質(zhì)素成分，破壞致密的物理結(jié)構(gòu)，這一點(diǎn)在SEM照片中可以直觀地看出。FTIR圖譜、XRD分析和成分分析可以得到相同的結(jié)果，即預(yù)處理后木質(zhì)纖維素的木質(zhì)素結(jié)構(gòu)受到一定程度的破壞，結(jié)晶度降低，酶解轉(zhuǎn)化率提高。其中溫度作為一個(gè)重要的因素影響NaOH溶液堿處理的效果，溫度升高時(shí)，NaOH溶液堿處理對(duì)木質(zhì)素的去除效果更好，對(duì)底物的物理結(jié)構(gòu)破壞更嚴(yán)重，因此升高溫度是促進(jìn)NaOH溶液堿處理效果的一種有效方式。

本研究依托NaOH溶液預(yù)處理方法，選取小麥秸稈、水稻秸稈作為草本類木質(zhì)纖維素的代表，選取檸條作為木本類木質(zhì)纖維素的代表，研究表明同一預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)不同底物預(yù)處理效果有一定影響。木本類木質(zhì)纖維素由于致密的物理結(jié)構(gòu)和更高的木質(zhì)化程度，使得其對(duì)預(yù)處理和酶解糖化的阻抗作用更大。為了更好地利用木本類木質(zhì)纖維素，須根據(jù)木本植物特殊的物理化學(xué)結(jié)構(gòu)，尋找更有效的預(yù)處理方法。

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